The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.

1. بناء الكهربائي (الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج محول الكهربائي الذي يناسب واجهة مجلس القطب من النظم التجارية مكبر للصوت متعدد القنوات 1،2،25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحة زجاجي صغير لصقها على قاعدة موصل 18 دبوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط قاعدة مع 3 قطع قصيرة من سلك معزول إلى 3 العروات لحام منفصلة مشدود على طبق زجاجي (الشكل 1 A1-A3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الأخدود في لوحة زجاجي فيه الزجاج الشعرية يمكن التحرك بسهولة وستعقد في مكانها بواسطة المسمار (الشكل 1 B1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمديد الزجاج الشعرية حوالي 5 ملم باستخدام دبوس minutien. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق الأسلاك الكهربائي الجزئي على طول دبوس minutien والزجاج الشعرية لضمان الاستقرار والدعم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متعدد القنوات انتاج الاسلاك الدقيقة (اعتمدت من Ryuichy اوكادا 32،33) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فترة 3 أسلاك متناهية الصغر (البولي يوريثين المغلفة الأسلاك النحاسية، 15قطر ميكرون) في الطريقة التي يتم وضعها بجانب بعضها البعض (الشكل 1 B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 12 فولت لحام إبرة لنشر طبقة رقيقة من الشمع الأسنان انصهار منخفضة (50 درجة مئوية) جزئيا على طول الأسلاك لالغراء لهم معا (القطب غيض) (الشكل 1 B3). ترك بضعة سنتيمترات غير إلتصق (نهاية القطب) كما سيتم استخدام هذا القسم في وقت لاحق لربط الأسلاك الصغيرة مع محول كهربائي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط متعددة الأسلاك قناة الصغير إلى محول كهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزجاج الشعرية من حامل وإرفاقه مع دبوس minutien إلى طرف القطب. جعله مواز الموقف إلى القطب الدقيقة (Figure1 B3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء طرف القطب إلى دبوس minutien باستخدام انصهار منخفضة شمع طب الأسنان وقطع القطب الصغير في طرف، جاحظ 2-3 سم من دبوس minutien وفي نهاية القطب (الشكل 1 الأسهم الصغيرة B3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زلة SL الشعريةightly العودة الى محول كهربائي. استخدام المسمار لاصلاحها (الشكل 1 B4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جندى المغفلة من الأسلاك الثلاثة إلى العروات لحام باستخدام بندقية لحام مع درجة حرارة حوالي 360 درجة مئوية لضمان ذوبان العزل (الشكل 1 B4). بعد لحام، وضمان وجود اتصال الكهربائية الكافية (~ 300 kOhm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل احد من الأقطاب الكهربائية (ماجستير) لمجلس واجهة كهربائي من headstage وإصلاح قناة أخرى متعددة القطب (الرقيق) على محول منفصل. ربط قنوات العبد إلى القطب الرئيسي (الشكل 1 C1). بالإضافة إلى ذلك، جندى الإشارة فضلا عن أقطاب العضلات إلى قاعدة القطب الرئيسي (الشكل 1 C2). </li></ol></li></ol> 2. إعداد النحل (الشكل 2) في هذه التجارب وصفت، ونحل العسل (mellifera أبيس)، وهو حيوان اللافقارياتوبالتالي لا تتطلب تصاريح أخلاقية محددة للاستخدام، ويستخدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبض علافات نحل العسل (A. mellifera) عند مدخل الخلية في الصباح كما هو موضح من قبل الآخرين 34،35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدئ النحل على الثلج المجروش حتى الشلل (5-10 دقيقة) وإصلاح واحدة في حامل زجاجي القياسية أو أنبوب معدني بطريقة التي يتعرض لها رئيس (الشكل 2 أ). للتقليل من استخدام حركات الرأس المنخفضة ذوبان الشمع الأسنان (~ 50 درجة مئوية) وتحديد رأس بعناية لحامل حول أساس مجمع العينين والرقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام منخفضة ذوبان الشمع ليحملق في scapi من الهوائيات على رأسه كبسولة (الشكل 2 ب) دون لمس السوط. والسوط الهوائي يحتاج إلى الإشارة إلى الأمام. تأكد من أن النحل يمكن أن تتحرك بحرية في خرطوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الرأس كبسولة لضمان وجهة نظر دون عائق، والوصول إلى أعلى الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية النحل بمحلول السكروز 30٪ حتى saturatiعلى تبليل لضمان ما يكفي من أنسجة المخ والجدوى الجيدة للحيوان (الشكل 2 C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شقوق حذرا عموديا على طول الحدود من عيون المجمع وأفقيا فوق قواعد antennal وكذلك تحت التي تشبه وإزالة قطعة خففت من إهاب (الشكل 2 D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين جانبا بعناية الغدد البلعوم السفلي وإزالة القصبة الهوائية لضمان عرض واضح الوصول إلى الدماغ قبل قطب كهربائي الإدراج (أرقام 2E، 2F). </li></ol> 3. الكهربائي الإدراج في حالة المثال الموضح في الشكل 2، ويتم وضع قطب كهربائي واحد يهدف إلى L-ALT، والآخر يهدف على M-ALT 2. باستخدام معالم وجه الخصوص، المناطق المستهدفة أخرى ممكنة أيضا، على سبيل المثال مناطق الانتاج وAL MB 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أقطاب كهربائية باستخدام micromanipulators في المنطقة ذات الاهتمام ( <stroنانوغرام&gt; الشكل 2G و 3A). لاستهداف المكان م-ALT القطب بين الجامعة وإعلامي من الفص العمودي للMB. ضمان موقع الإدراج يجري فوق نقطة التفرع من السندات الإذنية ALT الناصف الوحشي. تبرز الكهربائي في الدماغ وعلى عمق حوالي 180 (2E الشكل) ميكرون. لL-ALT PN مكان تسجيل القطب تحت protocerebrum الجانبي (وLH) في منتصف خط وهمي بين الجانب الوحشي من الفص الرأسي ومنتصف AL. إدراج القطب وعلى عمق حوالي 300 ميكرومتر (الشكل 2E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مرجع (سلك الفضة، وحوالي 25 ميكرون قطر) في العين مجمع المماثل من خلال قطع صغير في إهاب. إدراج الأسلاك الفضية أخرى في المنطقة الإسقاط العضلات تحت التي تشبه الجانبي. ملاحظة: إذا لزم الأمر سلوك التعلم من النحل يمكن رصدها بدقة عالية الزمنية من خلال تسجيل M17 العضلات، التي تشارك طن الاستجابة تمديد خرطوم (PER) النحل 36 كما هو موضح في 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترسيخ بقوة الأقطاب داخل الدماغ وكبسولة الرأس، وتغطي كامل المساحة فوق الدماغ مع اثنين من السيليكون المكون (الشكل 2H)، والتي سوف يمنع الدماغ من الجفاف. ملاحظة: يمكن للتسجيلات تستمر لساعات تصل إلى أيام، ويمكن على سبيل المثال أن تسجل النحل أثناء إجراء الإشراط الكلاسيكي (الشكل 2H) أو حفز مع لوحة كبيرة من الروائح المختلفة. </li></ol> 4. الحصول على البيانات وتجهيزها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرمجيات المناسبة اكتساب يلبي المتطلبات التالية: معدل 25 دقيقة كيلو هرتز أخذ العينات؛ التناظرية أو الرقمية 1،25 2 عبر التمايز بين قنوات القطب؛ الفرقة تمرير مرشح من 300 هرتز إلى 8،000 هرتز لاستخراج مسمار الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرمجيات المتاحة ارتفاع الفرز لاستخراج النشاط حدة واحدة، على سبيل المثال TEMPLأكلت تقنيات مطابقة كما وردت في البرنامج Spike2 (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيد من التحليل استخدام الوقت الطوابع وحدات استخراج لحساب وحدة واحدة وبلغ متوسط ​​استجابات رائحة (الشكل 4) أو لحساب ناقلات السكان لتحليل المكون الرئيسي (PCA) (الشكل 5) باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا. لمزيد من تحليل وحدة واحدة واستجابة الكمون السكان من فضلك قارن المنشورات الأخيرة 1،2،25. </li></ol> 5. تصور النسبية الكهربائي الموقع (الشكل 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع نصائح الأقطاب في حل أي من 5٪ اليكسا هيدرازيد 568 أو 5٪ اليكسا هيدرازيد 488 الذي يذوب في 0.5 M محلول كلوريد البوتاسيوم قبل التجارب التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأقطاب والسيليكون غطاء بعناية بعد التجارب، وشطف الدماغ مع قارع الأجراس حل النحل، وإزالة الغدد والقصبة الهوائية وتضاف بلورات صغيرة من tetramethylrhodamiن ديكستران أو إدراج الحل 5٪ حلها في 1.0 M خلات البوتاسيوم في AL لتسمية العطاءات anterogradely. نفذ الخطوات التالية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الصبغة التي سيتم تناولها ونقلها بواسطة الخلايا العصبية الإسقاط على طول محور عصبي مساحات بهم (30-45 دقيقة) (الشكل 4A)، قبل غسل الدماغ مع قارع الأجراس النحل حل ثلاث مرات لمدة 30-45 دقيقة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدئ النحل على الجليد حتى تجميد وإزالة بعناية الدماغ من الكبسولة الرأس. يحملق في الدماغ قبل الشطف في حل 0.1 M PBS تحتوي على 4٪ الفورمالديهايد ويبقيه بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار على الأقل 12 ساعة قبل غسل الدماغ مرتين في 0.1 M برنامج تلفزيوني (10 دقيقة لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X الدماغ لمدة 20 دقيقة في 0.2٪ تريتون X-100 0.1 M مخففة في برنامج تلفزيوني قبل التجفيف في سلسلة الكحول تصاعدي (30٪، 50٪، 70٪، 90٪، 95٪، 3X الإيثانول بنسبة 100٪، 20 دقيقة كل خطوة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين الدماغ المجففة في Methylsalicylate على شريحة المجهر وقالخطوط الجوية الاثيوبية مع شريحة الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام متحد البؤر مجهر المسح بالليزر ومسح الدماغ والمقاطع البصرية كل 2-5 ميكرون باستخدام مجمع متناسق الهدف خطة امزيغ (10X 0.4 NA الغمر). تثير الأنسجة باستخدام 568 نانومتر الطول الموجي للtetramethylrhodamin ديكستران والطول الموجي من 488 نانومتر للموقف القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة بناء هياكل الدماغ الملون ومسارات الكهربائي من مداخن الصورة في 3D مع برنامج إعادة الإعمار (على سبيل المثال. AMIRA أو فيجي) (الشكل 4). </li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

يوضح هذا المقال إنتاج واستخدام مصمم خصيصا متعدد القنوات الصغيرة الأسلاك الكهربائية. الأقطاب وصفها هي مناسبة لتسجيل كل من وحدة واحدة والنشاط السكاني وهو أمر مفيد خاصة بالنسبة للقياسات الكمون وغيرها من الخصائص الزمانية استجابة الخلايا العصبية المختلفة وneuropils مختلفة ضمن عينة واحدة (لمزيد من التفاصيل انظر 1،2،25). بالإضافة إلى ذلك أظهرنا كيفية تنفيذ بشكل دائم الأقطاب والأسلاك الدقيقة للسماح التسجيلات مستقرة طويلة الأجل في التصرف النحل التي تستمر لساعات تصل إلى أيام. أصبح خارج الخلية تسجيلات متعددة وحدة أداة مواتية لتحقيق القرار الزماني عالية جنبا إلى جنب مع المعلومات المكانية. في حالتنا، وهذه هي إما مساحات العصبية موازية 2 أو اثنين neuropils مختلفة 1. الخلايا العصبية متعددة يمكن تسجيلها وتحليلها على مستوى الخلايا العصبية واحد وبشكل متواز في القرار الزماني عالية. سجل وحدة متعددةطبقت بالجلسات الأولى في الثدييات 38 و في وقت لاحق أيضا في الحشرات 39-41. وقد تحقق تقدم كبير في تطوير وتحسين تقنيات التسجيل خارج الخلية متعدد القنوات 42،43. هذا، على سبيل المثال، يتضمن تطوير أقطاب جديدة 44 أو الرواية ارتفاع الفرز والتجميع خوارزميات 45. الطرق العامة من تقنيات التسجيل وحدة متعددة خارج الخلية وصفا جيدا 46-48. الأقطاب الذاتي بنيت يظهر في هذا الفيديو بالإضافة إلى ذلك يمكن تكييفها عن طريق إضافة المزيد microwires في القطب أو أسلاك متناهية الصغر يمكن الملتوية للحصول على مسافات ثابتة قابلة للقياس بين النصائح. أن كلا الإجراءين، ومع ذلك، يؤدي إلى تناقص المرونة وزيادة سمك القطب. مقارنة مع تحقيقات السيليكون المستخدمة عادة لتسجيلات خارج الخلية في الحشرات أكبر من ذلك بكثير مثل الصقور العثة، الجراد والصراصير 40،49 - </سوب&gt; 51 وصفت الأسلاك الكهربائية الصغيرة هي أصغر ومرنة ويمكن التعامل بسهولة مع حركات الدماغ المحتملة، وبالتالي، يمكن استخدامها بشكل موثوق في الحشرات الاجتماعية الصغيرة مثل النحل والنمل التي تظهر ذخيرة السلوكية أوسع من ذلك بكثير. معظم تحقيقات السيليكون لديهم ساق حادة مثل هياكل قطع محاور عصبية والأنسجة العصبية على طول قناة الإدراج، في حين الأسلاك الدقيقة وصفها هي الجولة، مرونة وأصغر حجما وبالتالي هي أقل ضررا على الأنسجة المحيطة بها والتي هي ميزة واضحة إذا كان الهدف هو دراسة طويلة اللدونة الأجل في حيوان سليمة ويتصرف. ميزة أخرى من الأقطاب الكهربائية الأسلاك الدقيقة هو إنتاجها منخفضة التكلفة وسهولة التعامل. بدلا من التنظيف بعناية اجراء تحقيق سيليكون مكلفة الأسلاك الكهربائي وقطع طازجة قبل الإدراج في الدماغ، وبالتالي عدم وجود مشاكل الازدحام. وعلاوة على ذلك فمن الممكن استخدام أكثر من واحد سلك كهربائي الصغرى في نفس إعداد إدراجها إما في neuropiles مختلفة 1 سمساحات ص 2 كما نعرض هنا. هذا النهج هو مواتية خاصة لتحليل ومقارنة الجوانب الزمانية مثل الإختفاء الاستجابة والتفاعلات على مختلف المستويات المعالجة العصبية. نحن على بينة من حقيقة أن الإشارات المسجلة خارج الخلية لا تعكس النشاط خلية واحدة في حد ذاتها. هو دائما مركب من النشاط الكهربائي في جميع أنحاء طرف القطب. لتحديد مصدر إشارة الفرق من قناتين الأسلاك الصغيرة المجاورة داخل القطب واحد وتحسب دائما. وبالتالي كانت مصدر لإشارات ارتفاع المستخدمة لاستخراج النشاط حدة واحدة دائما قريبة جدا من واحد أو قناة القطب الآخر مما أدى إلى ارتفاع الطول الموجي يمكن تمييزها بسهولة. إشارات من أبعد، مثل نشاط العضلات أو نشاط neuropils المجاورة، والوصول إلى كل من الأقطاب الكهربائية في نفس الوقت تستحضر الأشكال للمقارنة وسعة وسيتم تجاهل هذا الإجراء. باستخدام تقنية القالب مطابقة Spike2،نحن واثقون جدا للحصول على النشاط وحدة واحدة، والتي ليست هي نفسها، ولكن قريبة جدا من نشاط الخلايا العصبية واحدة. ومع ذلك، يمكن تجنب مسألة ارتفاع الفرز باستخدام تقنيات التسجيل داخل الخلايا. تسجيلات خلية واحدة مع أي من أقطاب حادة أو ماصات التصحيح تسمح المعرفة بتعمق حول خصائص الفسيولوجية للخلية عصبية واحدة. ولكن نظرا لصغر حجم الخلايا العصبية الحشرات وneurites التي منها (على سبيل المثال، أقل من 1 ميكرون لنحل العسل السندات الإذنية 52) تسجيلات المدى القصير فقط يمكن التحكم فيها. وعلاوة على ذلك، والتسجيلات داخل الخلوية قد تكون غازية ويمكن أن يؤذي الخلية التي هو ربما سبب آخر لقيود زمنية. في الجسم الحي تسجيلات داخل الخلايا في الحشرات نادرا ما تدوم ساعة واحدة. A نافذة الوقت الذي كان كافيا لعمله الرائد مارتن المطرقة 53 الذي سجل داخل الخلايا من الخلايا العصبية التي تم تحديدها واحد، وبطني المفردة maxilar الخلايا العصبية رقم 1 (VUMmx1). ما في وسعه ليترالحبر نشاطها مباشرة إلى مسار المثوبة. جوليان Mauelshagen 54 مسجلة داخل الخلية النشاط لتحديد فطر الجسم خارجي الخلايا العصبية، والخلايا العصبية السويقة خارجي # 1 (PE1) خلال تكييف الكلاسيكية. وكان نفس الخلايا العصبية في تركيز منزل ومانز 55 عندما وجدوا الكمونية بعد التحفيز الكهربائي للخلايا كينيون. ومع ذلك، يمكن أن اوكادا وزملاؤه 56 استخدام نمط ارتفاعه داخل الخلية تتميز كذلك (المسامير المزدوجة والثلاثية) لتحديد PE1 خلال التسجيلات خارج الخلية. بعد كل شيء مزيج من الطريقتين، والتسجيلات داخل الخلايا من الخلايا العصبية التي تم تحديدها والتسجيلات خارج الخلية على المدى الطويل قد يكون أداة قوية للتحقيقات في المستقبل. ومع ذلك، باستخدام الأقطاب حادة لتسجيل عدة خلايا (وحدات) في وقت واحد عند مستويات معالجة مختلفة على مدى ساعات طويلة تصل إلى أيام لتحليل علاقاتهم الاستجابة الزمنية و / أو حتى التغييرات البلاستيك طيكاد يكون من المستحيل. مع اقتراب التصوير الكالسيوم الأولى في نحل العسل 57،58 باستخدام الأصباغ الكالسيوم الحساسة وتحليل الأنماط المكانية لاستجابات رائحة الوصول 59-62. ومع ذلك، في كثير من الحالات الأصباغ الحساسة الكالسيوم يجب أن تكون أدخلت على أنسجة المخ عن طريق التلاعب الغازية التي تحد مرة أخرى مدى الحياة والنحل والخصائص الذاتية للخلايا تحليلها. يتم التغلب على هذه المشكلة في الكائنات نموذج آخر مثل ذبابة الفاكهة باستخدام أجهزة استشعار الكالسيوم قدم وراثيا 63،64. ولكن، بشكل عام، وأجهزة الاستشعار الكالسيوم قد فرض قيود أخرى لأنها يمكن أن تكون بمثابة مخازن الكالسيوم التي تؤثر على الأرجح الخصائص الزمانية الردود الرائحة. يمكن تسجيلات داخل الخلايا في وقت واحد جنبا إلى جنب مع التصوير الكالسيوم أو النهج الحسابية تثبت القرار الزماني السليم لعمليات التصوير 65،66. ومع ذلك، فإن القرار الزمني للعملية التصوير في حد ذاته هو راذهص محدودة. نظم حيازة البصرية عادة استخدام CCD التصوير مع القرار الزماني من 5-20 هرتز 67، على الرغم من 2 فوتون التصوير قد تكون قادرة على الحصول على تسلسل أسرع 68. ومع ذلك، وزيادة معدل أخذ العينات يذهب دائما جنبا إلى جنب مع خسارة في القرار المكانية. وعلاوة على ذلك الأصباغ الكالسيوم الحساسة المستخدمة في نحل العسل الخضوع التبييض، مما يقلل أيضا اكتساب الوقت 69. بالمقارنة مع غيرها من تقنيات التسجيل الفسيولوجية في الحشرات لدينا متعدد القنوات مرنة أقطاب الصغرى سلك ضمان وصول وقت طويل إلى وحدة واحدة والسكان نشاط الخلايا العصبية في التصرف النحل. أثبتنا كيفية استخدام اثنين من هذه الأقطاب في مراحل المعالجة المختلفة في نفس الحيوان، مما يسهل تحليل الجوانب الترميز الزمني بين المواقع تسجيل مختلفة. تعتمد على مشكلة البحث ونموذج الحشرات الطريقة الأساسية لبناء القطب تظاهر هنا يتم تمديد بسهولةقادرة و / أو يمكن تكييفها. على سبيل المثال فإنه من الممكن تصور لاستخدام أكثر من الأسلاك الثلاثة واحد لإنتاج الأقطاب متعدد القنوات. بالإضافة إلى ذلك، عدد من المواقع يمكن تمديد تسجيل ومراقبة الجوانب الزمانية أكثر من اثنين أو مساحات neuropils هو ممكن عمليا. أملنا هو أن هذا الأسلوب سوف تلهم العديد من العلماء وسيساهم بشكل إيجابي في فهم معالجة الخلايا العصبية في أدمغة متطورة الصغيرة.

نحل العسل وكذلك معظم الحشرات الأخرى تعتمد بشكل كبير على الشم. وغيرها التي يستخدمونها العظة حاسة الشم لتحديد اتجاهاتها، التزاوج والتواصل مع conspecifics، والبحث عن الطعام. يساهم نظام حاسة الشم وضعت بشكل جيد على ذخيرة غنية من السلوكيات التعلم المتصلة المحفزات رائحة الأزهار. هذه السلوكيات يمكن دراستها بسهولة تحت الظروف المعملية للرقابة (للمراجعة انظر 3-5). هم &quot;العقول البسيطة&quot; (cp. 6) مع أعدادهم صغيرة نسبيا من الخلايا العصبية يجعل نحل العسل كائن نموذج مناسب تماما لدراسة الترميز حاسة الشم والتعلم خلال رصد النشاط العصبي. نظام حاسة الشم لدى الحشرات وكذلك في الثدييات يظهر منظمة مشابهة إلى حد كبير (للمراجعة انظر 7،8). في نحل العسل حوالي 80،000 الخلايا العصبية مستقبلات 9 يقع في sensillae على طول هوائيات 10،11 ترجمة التحفيز رائحة البيئية إلى رجل أعمالإشارة اونال. محاور عصبية من الخلايا العصبية مستقبلات الشمية يعصب الفص antennal (AL)، التي لديها تنظيم الكبيبي مماثلة لالبصلة الشمية الفقاريات. وتضم الجامعة حوالي 164 الكبيبات مترابطة مع بعضها البعض بنحو 4،000 interneurons المحلي (LN) (للمراجعة انظر 12). خاصة في نحل العسل وقد تبين مؤخرا أن LNS توفير اتصال الجانبية غير مكتمل وأن المجموعات السكانية الفرعية المختلفة تمتلك خصائص عنصري وconfigural حاسة الشم الترميز 13،14. وقد أظهرت AL إلى تقسيمها إلى الفص بطني وظهري نصفي مما أدى إلى وسطي والمسالك الجانبية الفص antennal (M-L-ALT و؛ يطلق عليه سابقا م وL-APT للالإنسي والوحشي لوب Antennal protocerebral المسالك 15-17). هنا مصطلحات المسالك الجديدة التي أدخلت من خلال بذل جهد الأخيرة لتسمية موحدة للدماغ الحشرة سيتم استخدام 18. كلا العطاءات (ل م و-ALT) الجمع بين إما 410 (ل-ALT) أو 510 (م-ALT) proje uniglomerularالخلايا العصبية كشن (PN)، على التوالي 15،16،19. وقد تم مؤخرا أظهرت السندات الإذنية كل مساحات إلى الروائح كود بالتوازي 2 (للمراجعة انظر 17،20)، وكلاهما مساحات تشكيل synaptically اتصالات مع خلايا متباينة كينيون (KC)، وهي الهيئة الفطر (MB) الخلايا العصبية الرئيسية. كل MB يحتوي على حوالي 172،000 ككس 21-23. من المعروف أن ميجا أن تشارك في التكامل التحفيز، التعلم، وتشكيل الذاكرة. التشعبات الذخائر المتروكة من ككس تشكل السويقة (الجذعية الفطر)، والذي فقد اثنين من مناطق الانتاج الرئيسية: وvertica أو ألفا الفص والأفقي أو بيتا الفص 22،24. إخراج MB يتقاطع فقط حوالي 400 خلية عصبية خارجي (EN) 24. ENS المسؤولة عن معالجة المعلومات الشمية يعصب معظمها الجانب البطني من الفص العمودي 22. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن ENS سجلت في هذا المجال ترميز جمعية رائحة مكافأة 25. كما الزمانيأصبحت pects داخل منظومة حاسة الشم من الحشرات وكذلك الفقاريات جانبا هاما وكبيرا من حيث المبدأ الترميز المحتملة 26 - 29. لتكون قادرة على تسجيل في وقت واحد الخلايا العصبية متعددة من مواقع مختلفة في القرار الزماني عالية، أنشأنا مزدوجة متعددة تقنيات التسجيل باستخدام وحدة مخصصة متعددة الأقطاب والأسلاك قناة أدخلت إلى المناطق المستهدفة المختلفة في نظام حاسة الشم النحلة. هذا النهج تمكننا من تحليل ومقارنة معالجة الزمنية في نظام حاسة الشم نحل العسل على مستوى الخلايا العصبية واحد والسكان من الخلايا العصبية الشمية إما بين مسارات متوازية، المسار المزدوج 2 حاسة الشم أو بين مختلف neuropils اللاحقة 1. في الآونة الأخيرة مع المنهج التجريبي مماثلة في نظام حاسة الشم الجراد 30 باستخدام تكوين مختلف من الأقطاب الكهربائية كانوا قادرين على تحليل آلية الترميز الزمانية المكانية للخلفية ثابتة رائحة اعتراف 31. اللنا، التسجيلات المزدوجة التي أنشئت تمكين جمع المعلومات المكانية عن ملامح نشاط الخلايا العصبية في وقت واحد. مقارنة مع أخذ العينات المكانية أوسع تم الحصول عليها من التصوير الكالسيوم هذا الأسلوب يسمح تسجيل من مركزين فقط. ومع ذلك، فإن ميزة مقارنة تقنيات التصوير الكالسيوم هو الدقة الزمنية عالية من العمل التسجيلات المحتملة، والتي لا يمكن أن تقدمها إما التقليدية التصوير CCD أو اقتناء التصوير 2 الفوتون. الأقطاب خارج الخلية وصفها هنا يتم زرعها بشكل دائم وثابت بالنسبة إلى الدماغ والرأس كبسولة تجنب الانجراف القطب. هذا هو ميزة واضحة بالمقارنة مع استخدام أقطاب كهربائية داخل الخلايا حادة. ميزة أخرى لمقارنة تسجيلات داخل الخلايا والتصوير الكالسيوم هي المرة المراقبة العصبية طويلة تتراوح بين عدة ساعات إلى أيام. هذا هو شرط مسبق هام لتحقيق يرتبط العصبية تشكيل التعلم والذاكرة. فوائد إضافية متعددةويرد مزيد من التسجيلات حدة في قسم المناقشة. في هذه النظرة المنهجية سيظهر الإجراء تصنيع أقطاب الأسلاك العرف تصميم، وتكييفها من 32،33 وملاءمة للتسجيلات وحدة متعددة على المدى الطويل في الدماغ نحل العسل. بالإضافة إلى ذلك، على سبيل المثال كيف يتم زرع هذه الأنواع من الأقطاب الكهربائية بشكل دائم في موقعين تسجيل مختلفة داخل منظومة حاسة الشم نحل العسل لتسجيل في وقت واحد هو مبين-L وم-ALT على مدى فترات طويلة من الوقت للسماح العديد من البروتوكولات التحفيز 2. للتحقق من تسجيل مواقف وتقدم مثالا وبروتوكول لتلطيخ وتسجيل آخر التصور من مواقع التسجيل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>76235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odors</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Methanol free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>BioChemica</td>
			<td>A1388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylsalicylate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4529.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7162</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10437</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bee Ringer Solution</td>
			<td>see 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane-coated copper wire</td>
			<td>Elektrisola</td>
			<td>15&#181;m diameter &#38; P155 insulation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax&#160;</td>
			<td>Densply Detrey</td>
			<td>64103015S1</td>
			<td>moderate melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax</td>
			<td>Flexaponal&#160;</td>
			<td>124-202-00</td>
			<td>low-melting Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWIK SIl</td>
			<td>WPI</td>
			<td>03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 Pin Socket</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>189634-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot melting glue</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>827673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering needle</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>830283</td>
			<td>12 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering terminal lug&#160;</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>531901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glaselectrodes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td>V2A 0.2 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>switchable headstage</td>
			<td>Tucer Davis Technologies</td>
			<td>SH16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage connection module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>INT-03M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier Module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>PDA-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition boards</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6123, Ni-6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Lab View 8.2</td>
			<td>custom design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-Sorting&#160;</td>
			<td>CED&#160;</td>
			<td>Spike 2 v7.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG-wires</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT05100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP2 AOBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIRA</td>
			<td>Mercury Computer Systems&#160;</td>
			<td>2/5/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees

في كل من الثدييات والحشرات تتم معالجة المعلومات العصبية في المراكز العليا والدنيا أجل الدماغ المختلفة. تقترن هذه المراكز عبر متقاربة والاتصالات التشريحية متباينة بما في ذلك التغذية إلى الأمام وردود الفعل الأسلاك. وعلاوة على ذلك، يتم إرسال المعلومات من نفس المصدر جزئيا عبر مسارات موازية لمختلفة وأحيانا في مناطق الدماغ نفسه. لفهم الفوائد التطورية فضلا عن المزايا الحسابية هذه الاستراتيجيات الأسلاك وخصوصا تبعيات الزمنية على بعضها البعض، فمن الضروري أن يكون الوصول إلى الخلايا العصبية في وقت واحد واحد من مساحات مختلفة أو neuropiles في نفس الاعداد في القرار الزماني عالية. نحن هنا التركيز على نحل العسل من خلال إظهار وصول فريدة من نوعها على المدى الطويل خارج الخلية لتسجيل نشاط وحدة متعددة في اثنين neuropiles اللاحقة 1، الفص antennal (AL)، وأول مرحلة التجهيز حاسة الشم والجسم الفطر (MB)، وهو أعلى مركز أجل التكامل INVOlved في التعلم وتكوين الذاكرة، أو اثنين مساحات العصبية موازية 2 ربط AL مع MB. وقد تم اختيار هذا الأخير كمثال وسوف يمكن وصفها بشكل كامل. في الفيديو دعم ويتجلى بناء والإدراج دائمة مرنة متعددة الأقطاب والأسلاك القناة. البشرى التضخيم التفاضلية للقنوات سلك كهربائي الصغرى يقلل بشكل كبير من الضوضاء ويتحقق من أن مصدر إشارة يرتبط ارتباطا وثيقا موقف طرف القطب. المرونة الميكانيكية للأقطاب الأسلاك المستخدمة يسمح التسجيلات مستقرة على المدى الطويل الغازية على مدى عدة ساعات تصل إلى أيام، والتي هي ميزة واضحة بالمقارنة مع تقنيات التسجيل الجسم الحي وخارج الخلايا في التقليدية.

&quot;هذا البروتوكول يسمح التسجيلات في وقت واحد في اثنين من مراحل التجهيز المختلفة داخل نحل العسل الفردية وبالإضافة إلى ذلك يسمح لاختبار الآليات الكامنة وراء التعلم والذاكرة عن طريق على سبيل المثال.، PER تكييف داخل النحل ضبط النفس.&quot; هذا هو شرط أساسي لتحليل الجوانب الزمنية المعالجة العصبية. هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة لنهج العلمية المختلفة لكشف الشبكة العصبية نظام حاسة الشم النحلة. على سبيل المثال يتم استخدام هذا الأسلوب (ط) لتحليل معالجة الزماني للالسندات الإذنية داخل المسار المزدوج حاسة الشم من نحل العسل، و-L و m-ALT السندات الإذنية (الشكل 5). في الشكل 5A يتم إعطاء مثال واحد من PN-L ALT سجلت في وقت واحد مع PN من م-ALT الى عشرة متوسط ​​المحاكمة ويوضح قوة استجابتها والكمون فيما يتعلق خمسة تركيزات مختلفة مثل رائحة ونا مميزا الحرارة المؤامرة. في المتوسط ​​من سبعة النحل مع 11 لتر و 13 مللي أمبيرLT السندات الإذنية (أرقام 5B، 5C) يوضح أن كلا من قوة الاستجابة وكذلك الكمون ردا على ذلك، إلى حد ما، يعكس تركيز الرائحة. وبالتالي السندات الإذنية في هذا المثال زيادة قوة الاستجابة في حين مع زيادة تركيز الرائحة الكمون استجابتها رفض (أرقام 5B، 5C). هذه النتيجة هي محدودة نوعا ما، وصالحة فقط لتحليل الرائحة، ولكن لا يزال يتفق مع النماذج الحسابية الأخيرة من AL 37. ما إذا كان الترميز في تركيز الرائحة AL النحلة وراء حسابات غير خطية أو وراء خصائص الترميز الأخرى لا يزال يتعين تحليلها في المستقبل. علاوة على ذلك، يمكن استخدام أسلوب (ب) لمقارنة الجوانب الزمنية في النشاط السكاني في مرحلتين المعالجة اللاحقة، وAL-MB-والإخراج (الشكل 6). يوضح تحليل المكون الرئيسي (PCA) أن رائحة حساب يطول وتدوم العرض رائحة بأكملها على المستوى PN في حين ENق فقط رائحة وإيقاف مجموعة ممثلة في النشاط السكاني (الشكل 6). وبذلك بلغ عدد السكان EN نشاطهم القصوى بالفعل في نقطة الوقت الذي كان فيه النشاط PN لا تزال تتطور (cp. فيلم 1). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> . الرقم 1 تصنيع ثلاث قنوات أقطاب الصغرى سلك A1) وملحوم والنهايات من ثلاثة أسلاك لموصل دبوس IC في المراكز 11 و 13 و 16 A2) وثمل أربعة العروات لحام على لوحة قاعدة بلاستيكية زجاجي؛ يتم إدخال دبوس minutien في غيض من الزجاج الشعرية التي يتم بعد ذلك تعلق على لوحة من البلاستيك. A3) يتم لصقها على لوحة من البلاستيك على رأس دبوس موصل IC ونهاية خالية من كل سلك ملحوم لحام واحدة من أعلى العروات. &lt;قوية&gt; B1) لتجهيز حامل الكهربائي مع الأسلاك النحاسية الجميلة، وشعري لا بد من اتخاذها للخروج مرة أخرى. B2) وقاعدة حامل ثم يتم إصلاحها في العرف مواءمة الجهاز. يتم محاذاة ثلاثة أسلاك النحاس الصغيرة على طول الأخدود وثابتة مع شريط لاصق في نهاية كل B3) يتم لصقها الأسلاك الدقيقة بالتوازي مع شمع طب الأسنان ويتم وضع شعري مرة أخرى في مكان (السهام طويلة)؛ ثم هي التي تعلق على أسلاك متناهية الصغر لصقها على شعري بالشمع الأسنان ويتم قطع اطرافها قبالة (السهام قصيرة). B4) وملحوم والمغفلة ثلاثة من الأسلاك النحاسية الى المراكز الثلاثة الاولى العروات لحام بالتالي تقديمهم في اتصال مع الكهربائية يمكن ان تكون مرتبطة IC دبوس موصل. C1) اثنين من أقطاب تجميعها بشكل كامل لبعضها البعض للاستخدام مع headstage واحد. C2) لهذا الغرض ترتبط دبابيس من القطب واحد (اليسار والرقيق) عن طريق أسلاك معزولة إلى القطب الآخر (يمين، ساريةإيه)، والتي يتم توصيلها إلى مرحلة الرأس؛ يمكن للheadstage توصيل الكهربائي أيضا جمع مدخلات من العضلات (M17) والقطب المرجعية (المرجع). <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. إعداد والإدراج القطب دائمة في الدماغ النحل. A) يتم إدخال النحل في حامل زجاجي بعد الشلل على الجليد. يشار إلى هوائيات مع السوط (فلوريدا) وسقيبة (SC). ب) الرأس ويتم إصلاح الهوائيات باستخدام الشمع الأسنان. C) وحلق كبسولة الرأس ويتم تغذية النحل مع الماء والسكر. D) يتم فتح الكبسولة الرأس. E) بعد إزالة الغدد والقصبة الهوائية من أعلى الدماغ، ويمكن بسهولة أن تميز مختلف neuropiles والمعالم الرئيسية. يشار إلى مسارات للالعطاءات جنبا إلى جنب مععلامة حيث يتم إدراج الأقطاب. (MB: هيئة فطر، AL: الفص Antennal، OL: الفص البصري، α: ألفا الفص الفص أو الرأسي، ALT: antennal المسالك الفص، E1: الجانب القطب الإدراج للحصول على تسجيلات M-ALT، E2: الجانب القطب الإدراج لL-ALT يتم إدراج التسجيلات). F) مرجع (المرجع) والأقطاب الكهربائية في العضلات (M17) في كبسولة الرأس من خلال ثقوب صغيرة في بشرة أو العين المجمع. G) يتم إدراج الأقطاب والأسلاك في الدماغ في المواقع المناسبة. H) بعد تحديد الأقطاب في مكانها باستخدام اثنين من السيليكون المكون النحل لا يزال يظهر PER ويمكن تكييف (على سبيل المثال، باستخدام الماء والسكر). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. خارج الخلية تسجيل في اثنين مساحات العصبية واستخراج وحدة واحدة (ارتفاع الفرز). A </strأونج&gt;) الرسم التخطيطي من الإعداد التجريبية. وتركز اهتمامها على النحل في حامل زجاجي. يتم توفير التحفيز رائحة عبر أنبوب زجاجي. اثنين من السيقان القطب تقوم بالتسجيل من الدماغ النحل المكشوفة. B) في وقت واحد التسجيلات من لتر وم-ALT السندات الإذنية (الأخضر والأرجواني آثار) تظهر الاستجابات مثير على كل مساحات إلى التحفيز 500 ميللي ثانية رائحة العسل في محلول الماء بتركيز 1:100 في 33 درجة مئوية. كل سطر يمثل تآمر القنوات متباينة كتسمية مرمزة من العروات لحام كهربائي في بار A.: 50 μV C) بعد الإجراءات ارتفاع الفرز يتم فرز إمكانات العمل واحد ولون مشفرة. تراكب من الوحدات التي تم فرزها يوضح الفصل بين الطول الموجي. D) سبايك الرسم البياني فاصل يشير إلى نوعية الفصل بين الوحدات التي تم فرزها كدليل على ارتفاع الفرز كافية. ملاحظة عدم وجود ارتفاع في الفترة صهر الوحدة. E) رأيان (E1، E2) منوتجمع 3D وحدة فرزها مع تحليل العنصر الرئيسي الذي يشير إلى مسافة الوحدات التي تم فرزها لبعضها البعض. الدوائر تدل على مسافة 2.5 أضعاف Mahalanobis التي تشبه SD في الفضاء ويشير إلى وجود تمايز كبير من المجموعات في الفضاء المكون الرئيسي F) اللون وحدات ترميز تصور إمكانات العمل مرئية في التكبير من ثلاث قنوات من تسجيل المسالك واحدة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4. التصور بعد تسجيل وإعادة الإعمار 3D-الموقف التسجيل. أ) عرض الإسقاط من أورثو-شرائح على طول ض محاور مع أقصى قدر من المواءمة كثافة من انتيرووردمها إلى الوراء من الخلايا العصبية الإسقاط إسقاط uniglomerular من AL إلى MB وLH. تم إدراج التتبع داخل الخلايا Microruby (tetramethylrhodamin ديكستران) إلى AL بعد التجارب التسجيل. الكبيبات الملون داخل AL دليل PN تلطيخ المناسبة. B) الإسقاط عرض شرائح أورثو على طول ض محاور مع أقصى قدر من المواءمة كثافة من تلطيخ من القطبين مع اليكسا هيدرازيد 488 مما يدل على وضع قطب كهربائي لم-ALT (E1، السهم ) و l-ALT (E2، السهم). التتبع اليكسا هيدرازيد 488 يهاجر إلى الأنسجة المحيطة القطب والبقع موقع الإدراج القطب. لاحظ، وتلطيخ بارز في الجامعة هو الحرفية السطحية. C) 3D إعادة بناء الخلايا المستهدفة ملطخة (السندات الإذنية) وموقع القطب الإدراج من A، B (الجانب الأيمن) جنبا إلى جنب مع لمحة التخطيطي للنظام حاسة الشم نحل العسل (يسار الجانب) مع الإشارة إلى مسارات-L و m-ALT. ملاحظة، فقط uniglomerوتظهر مساحات جزيئية PN. AN: الأعصاب antennal، AL: الفص antennal، LH: القرن الوحشي، MB: هيئة فطر، E1، E2: مواقع الإدراج الكهربائي، M-ALT: سطي لوب Antennal المسالك، L-ALT: الوحشي لوب Antennal المسالك، ج: الذيلية، ص: منقاري، م: وسطي، ل:. الوحشي <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> الشكل 5. مثال على رائحة تركيز الترميز داخل المسار المزدوج توضيح حاسة الشم. A) المؤامرات الحرارة رد واحد ل-ALT (الخضراء) و M-ALT احد PN (البنفسجية) حصلت في وقت واحد من نحل العسل الفردية ردا على الرائحة hexanal إلى زيادة تركيزات رائحة (من 1: 10 -6 إلى 1:100). كل سطر في المتوسط ​​عشرة STIM المحاكمةulation. يظهر معدل اطلاق مثل تغير الكثافة النسبية وهو معدل اطلاق النار في ما يتعلق النشاط العفوي طرح باء) استجابة السكان الكمون من 11 لتر و 13 م ALT السندات الإذنية من 7 النحل المسجلة. في كل النحل سجلت السندات الإذنية من كل مساحات في وقت واحد. يظهر الكمون استجابة السكان الكمون تناقص مع زيادة تركيز الرائحة في السندات الإذنية من كل مساحات. تم تسجيل ظهور رائحة استجابة في الهوائيات في 99 ميللي ثانية عبر electroantennograms وتطرح من الإختفاء استجابة PN. لاحظ أنه عند أدنى تركيزات استجابات ضعيفة جدا لقياس الكمون، وبالتالي تم استبعاد استجابة. C) السكان يطلقون معدل من نفس السندات الإذنية كما في B. ومع تزايد تركيز الرائحة قوة الاستجابة آخذ في الازدياد. يبين-ALT لتر قوة استجابة أقوى. في B، C وترد المتوسط ​​وSD. <img alt="الرقم 6" fo:contenتي العرض = &quot;5IN&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot; العرض = &quot;500&quot; /&gt; الشكل 6. مقارنة النشاط السكاني في مرحلتين المعالجة اللاحقة على طول مسار حاسة الشم في نحل العسل و. تم تسجيل البيانات في 20 الحيوانات التي حفزت مع 1-HEXANOL و 2 octanone. A) كل سطر يمثل اللون كاذبة مشفرة متوسط ​​معدل اطلاق النار من إسقاط واحد الخلايا العصبية (PN) المحسوبة في 10 التكرار رائحة 1-HEXANOL. يبدأ العرض في وقت ورائحة 0 واستمرت ثلاث ثوان. B) يظهر نفسه كما في A) ولكن لجسم الفطر الخلايا العصبية خارجي (EN). المصفوفة هو مبين في A) يمكن أن ينظر إليها باعتبارها ناقلات السكان PN خلال التحفيز رائحة مع 1-HEXANOL. حسبنا نفس النوع من ناقلات السكان خلال التحفيز رائحة مع 2 octanone واستخدامها على حد سواء ناقلات في تحليل المكون الرئيسي (PCA) الحفاظ على البعد الزماني. ج) ثلاثة مكونات رئيسية الأول (PC1 و 2 و 3) وتآمر ضد بعضها البعض لتوضيح فصل الرائحة في النشاط الفرقة PN في الانتاج الفص antennal. وتعد هذه المرة قبل بداية رائحة سوداء. ويظهر النشاط خلال ثلاث ثوان من التحفيز مع 1-HEXANOL باللون الأزرق. يظهر النشاط خلال التحفيز مع 2 الأوكتانول باللون الأحمر. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا 1.5 ثانية (آخر) من النشاط بعد رائحة مجموعة من 1-HEXANOL (الضوء الأزرق) و 2 octanonen (الوردي). لاحظ أنه على مستوى الفرقة PN، سواء الروائح تستحضر مسارات واضحة للغاية تسوية في &quot;النقطة الثابتة&quot; التي يدوم أطول فترة التحفيز رائحة كله. إلا بعد رائحة تعويض مسارات نقل مرة أخرى إلى النشاط الأساسي دون التحفيز رائحة. D) وقد أجري التحليل نفسه على مستوى الفرقة EN تمثل النشاط في الانتاج الجسم الفطر. مقارنة مع النشاط PN الروائح تثير مسار أقل وضوحا. وعلاوة على ذلك &quot;نقطة ثابتة&quot; ليست واضحة. في البداية رائحة مسارات بفعل الأسواق العالمية ضغطهاrmingle مع النشاط الأساسي على الرغم من أن رائحة لا تزال موجودة. فقط رائحة تعويض أثار مسارا إضافية. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. الفيلم 1</a> حل وقت تقييم رائحة يسببها المسار بعد تحليل المكون الرئيسي للناقل PN-السكان (يسار) ومتجه السكان EN (اليمنى. حزب المحافظين الشكل 6) وتشمل الأجزاء العلوية المكونات الرئيسية الثلاثة الأولى (PC1، 2 و 3) تآمر ضد بعضها البعض. توضيح الألواح أقل تقييم PC1 و 2 و 3 مع مرور الوقت. يتم وضع علامة التحفيز رائحة بواسطة شريط الرمادية. وقد تزامن كل اللوحات. لاحظ أن النشاط السكاني EN يبدأ قليلا قبل النشاط السكاني PN، وهي ظاهرة يبدو أن contraintuitive ولكن يمكن تفسير ذلك الربط وخصائص الطبقات المعنية، والتي يتم مناقشتها في وقت سابق 1.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

أنشئت التسجيلات المدى الطويل خارج الخلية في وقت واحد من اثنين neuropiles الدماغ المختلفة أو اثنين مساحات تشريحية مختلفة في نحل العسل. تسمح هذه التسجيلات التحقيق في الجوانب الزمنية للتجهيز الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الخلايا العصبية واحد، وكذلك على مستوى الفرقة في حيوان يتصرف.

تسجيلات في وقت واحد على المدى الطويل في مرحلتين العصبية في معالجة يتصرفون نحل العسل

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

simultaneous-long-term-recordings-at-two-neuronal-processing-stages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.8K Views.  University of Würzburg.  أنشئت التسجيلات المدى الطويل خارج الخلية في وقت واحد من اثنين neuropiles الدماغ المختلفة أو اثنين مساحات تشريحية مختلفة في نحل العسل. تسمح هذه التسجيلات التحقيق في الجوانب الزمنية للتجهيز الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الخلايا ال...

Video: Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

الآلي Sholl تحليل الصرف متعلق بالخلايا العصبية رقمية على مستويات متعددة

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم<em&gt; C. ايليجانس</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

إجراء لغرس صالحة المنظمة من Microwires للتسجيلات واحدة وحدة في استيقظ، تتصرف الحيوانات

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الفأر القوقعة إإكسبلنتس

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

توليد وصيانة طويلة الأجل خالية من الأعصاب<em&gt; حيدرة</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

أوبتوجينيتيك الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال في التصرف الفئران

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

الصراع الحسي طويلة الأجل في التصرف بحرية الفئران

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...