The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

נויטרופילים היו מבודדים ממתנדבים בריאים שחתמו הסכמה מדעת. מחקר שבוצע בעמידה בהנחיות מוסדיות ולאומיות לרווחת אדם. 1 ציפוי ותחזוקה של תאי האנדותל וריד טבורי אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות טבורי אדם וריד האנדותל (HUVECs) על פי הוראות יצרן. (בינוני האנדותל בסל בינוני (EBM-2) בתוספת האנדותל צמיחה בינונית (EGM-2) singlequots) לגדול HUVECs על פיברונקטין (FN) -coated מנות (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל, מומסים במי demineralized) באמצעות מדיה. השתמש בתרבית תאים בין 4-8 מעברים לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: זרימת תאים מעילים עם של פיברונקטין 100 μl (10 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לפחות שעת 2 ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: כאשר תאים מגיעים 80-90 מפגש%, trypsinize התאים לאחר שטיפה זהירה עם פוספט שנאגרו מלוח RT (PBS) pH 7.4, צנטריפוגות ב XG 800 וגלול ב800,000 תאים / מ&quot;ל ​​באמצעות תקשורת. צלחת 80,000 תאים בכל ערוץ של זרימת התאים מצופים FN ועדינות פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה. תרבות O / N בחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: רענן התקשורת בזרימה קאמרית השקופיות בעדינות על ידי הטיית השקופיות בזווית של ° 45. (ראה איור 1 א). הערה: מומלץ להסיר רק את התקשורת במאגרים ולא בערוץ עצמו. הסרתה של התקשורת בערוצים עלולה לגרום לאובדן תא האנדותל ומוות כתוצאה מכוח גרירה של אמצעי התקשורת הנגרמת על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב אם תאי האנדותל יצרו monolayer (כלומר, מחוברות 100%). אם התאים לא 100% ומחוברות, לשנות את התקשורת שתי פעמים ביום עד שהם מגיעים 100 מפגש%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים הגיעו confluency, לגרות את התאים עם תקשורת (ראה שלב1.1) המכילים מתווך דלקתי (TNF-α (מ&quot;ל / 10 ng)). גירוי HUVECs O / N (כלומר, שעה 12) עם תוצאות TNF-α בפנוטיפ דלקתי של האנדותל, כלומר., עד תקנה של מולקולות הידבקות תא כגון ICAM-1 וVCAM-1 13. </li></ol> .2 בידוד polymorphonuclear יקוציט על ידי מפלי Percoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן N-2-hydroxyethylpiperazine-2-ethanesulfonic-N&#39;חומצת -buffer (HEPES) (להלן בשם: זרימת חיץ) לפני שבודד לויקוציטים polymorphonuclear (PMN). זרימת חיץ משמש כדי לשטוף PMNs מבודד וכחיץ בזרימה assay. כדי להכין זרימת חיץ: לדלל 7.72 גרם NaCl (132 מ&quot;מ), 4.76 HEPES g (20 מ&quot;מ), 0.45 גרם KCl (6 מ&quot;מ), MgSO 0.25 גרם 4 (1 מ&quot;מ) • 7H 2 O, K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1.2 מ&quot;מ) ב1 ליטר של מים demineralized ולהתאים pH 7.4 (המניה זה יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה הטרי 100 μl M 1 CaCl 2 &amp; #160; (1 מ&quot;מ), 2.5 מ&quot;ל אלבומין אדם מריכוז מניית 200 g / L (0.5% V / V) ו0.1 גרם גלוקוז ל100 מ&quot;ל (0.1% w / v) של זרימת חיץ. בשלב הבא, לסנן את זרימת החיץ באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. הערה: זרימת מאגר זה צריך להיות מוכן טרי עבור כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הבידוד של PMN, להכין 10% פתרון ציטראט trisodium (TNC) בPBS, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20 מ&quot;ל של דם מלא בvacuettes heparine נתרן ממתנדב בריא. לדלל כל דם 1: 1 עם 10% PBS / TNC ב50 צינורות מ&quot;ל ומיליליטר 20 פיפטה דילול דם בזהירות על 12.5 מ&quot;ל של Percoll (23% (w / w) פתרון colloidal במים עם צפיפות של 1.130 g / ml) בצינור 50 מ&quot;ל חדש. בזהירות להניח את הצינורות בצנטריפוגה וספין ל20 דקות ב XG 800 עם נמוכה האצה ובלי הפסקה שנקבעה על RT. הערה: בעת הוספת הדם המדולל לPercoll, להטות את צינור Percoll המכיל בזווית של ° 45 ועדינות פיפטה הדם המדולל בשנינות הצינורh הגדרת ילד פיפטה האיטית ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הנוזלים ולאחר מכן למלא את הצינור עם תמוגה חיץ קר כקרח כדורית אדומה (3 [0.01 ז] ו18.5 EDTA מ&quot;ג 4.15 גרם NH 4 Cl [0.155 M], 0.5 KHCO g (טריפלקס III) [0.1 מ&quot;מ] 500 מ&quot;ל של O H 2 קר כקרח) לlyse אריתרוציטים. השאר צינור על קרח, לעתים צינור היפוך, עד ההשעיה הופכת לאדומה כהה, ואחריו XG 500 צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C עם הפסקות אפשרו. הערה: חלק גלולה מכיל PMNs (נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים) יחד עם אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ולשטוף גלולה פעמיים בתמוגה חיץ קר כקרח ב XG 500 למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם זרימת חיץ ב RT ולקבוע את ריכוז PMNs או באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי. להשעות את PMNs בזרימת חיץ ב1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ולשמור על RT. </li></ol> .3 תיוג של האנדותל צומתאל VE-cadherin וPECAM-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את נוגדן 647 PECAM אלקסה פלואוריד (שיבוט WM59) בשעה 1: דילול 100 ונוגדן VE-cadherin-FITC סידן עצמאי (שיבוט 55-7H1) בשעה 01:50 דילול לHUVEC מדיום תרבות (ראה שלב 1.1), דגירה במשך 30 דקות לפני תחילת זרימת הניסוי לדמיין דינמיקת junctional של תאי האנדותל בגלגול נויטרופילים תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים. הערה: לפני הוספת הנוגדנים ישירות הכותרת לזרימת התאים, להבטיח שהנפח בכל ערוץ אינו עולה על 100 μl. זה עוזר לשמור על הוצאות הנוגדן נמוכים ככל האפשר. </li></ol> .4 PMN TEM Assay תחת זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את PMNs לתוך אמבט מים במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס לפני הזרקה אותם לזרימת המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינורות לזרימת מחסנית ריקה ולמלא עם (צעד לראות 4.3) חם (למשל, 37 ° C) זרימת חיץ כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בעת הגדרת המערכת זרימת דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צד אחד של זרימת מחסנית ריקה למערכת זרימת משאבת המזרק באמצעות צינורות סיליקון המכילים מזרק 20 מ&quot;ל, ולשים את הזרימה הקאמרית לבמת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר הצד של זרימת מחסנית ריקה האחר לבקבוק המאגר מלא ב37 מעלות זרימת חיץ C (איור 1) ולהתחיל את משאבת המזרק כדי למלא את כל צינורות עם זרימת חיץ. המשאבה תמשוך את זרימת החיץ מהמאגר, דרך הזרימה קאמרית לתוך המזרק. הערה: צינורות זו מכיל גם יציאה באונליין Luer הזרקה, המאפשרת PMNs להיות מוזרק עם מחט לתוך ניסוי ריצה מבלי לעצור את הזרימה ויצירת בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את זרימת התא הריק עם הזרם קאמרית המכיל HUVECs טופל-TNF-α, לחבר את צינורות זרימה המכיל חיץ ולמקם אותו לתוך הבמה מיקרוסקופ (איור 1 ג). לצבוט את הצינורות לפני הניתוק והחיבור מחדשמ &#39;לתאי המכילים את HUVECs, שלא צובט את עלול לגרום להיווצרות של בועות אוויר בתוך הצינור ו / או זרימת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מהירות הזרימה לDYN 1/2 סנטימטר, בהתאם למהירות זרימה פיזיולוגית בvenules נימי הודעה (1-5 DYN / 2 סנטימטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשומה ניגודיות דיפרנציאל הפרעה (DIC), FITC (488 ננומטר) ואלקסה פלואוריד (ננומטר 647) 647 בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק PMNs (שלב 4.1) בזרימת המערכת לאט דרך אונליין בנמל הזרקת Luer (1D איור) באמצעות 1 מ&quot;ל מזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כמה דקות, לויקוציטים מופיע, לדבוק, ומתגלגל. להפסיק את הניסוי בכל רגע רצוי על ידי ניתוק צינורות מהזרימה קאמרית ומקבע pipetting (פורמלדהיד .3.7% ב PBS) לתוך הזרם קאמרית. לאפשר קיבוע ל10 דקות, ואחרי כביסה עם PBS. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת הדמיה (ראה חומרים ושולחן ציוד). הערה: בצע אותו הניסוי באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר מצויד בתא אקלים עם טמפרטורה קבועה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו63X שמן אובייקטיבי. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases:+'+vascular+rheumatology.">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration.">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li><li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots.">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+migration:+cell-cell+contacts+get+intimate.">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li><li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains.">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

לפרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי למנוע ההיווצרות של בועות אוויר בזרימת התאים, שכן זה יגרום לאפופטוזיס התא וmonolayer שיבש. כדי להימנע מכך, ברצוננו להדגיש לשלם ריבית מסוימת לצעדים 4.2 ו4.5, שבו הצינורות מחוברים לזרימה קאמרית. עוד צעד קריטי בפרוטוקול הוא תחול של PMNs שנשמרים ב RT על ידי דוגריהם ל15-30 דקות ב37 מעלות צלזיוס לפני הזרקה אותם לזרימה קאמרית (שלב 4.1). כתוצאה מכך תחול של integrins יקוציט, המאפשרת להם להיצמד למולקולות דבקות כגון ICAM-1 או VCAM-1 בהאנדותל. פרוטוקול זה אינו מוגבל ללמוד את הגלגול של נויטרופילים. ניתן להשתמש גם סוגי יקוציט אחרים כגון מונוציטים או לימפוציטים. שים לב השלב ש4.1, כלומר, תחול לויקוציטים עשוי להיות שונה בין סוגי יקוציט. כמו כן, ניתן להשתמש בסוגים אחרים של תאי האנדותל. לשם כך הוא נשאר קריטיכדי לעורר את תאי האנדותל עם גירויים דלקתיים מתאימים כגון TNF-α או IL-1β. אם נויטרופילים לא מגיבים בtransmigrating, ניתן לשקול טיפול לזמן קצר נויטרופילים (5 דק &#39;) עם פפטיד N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-פנילאלנין (fMLP) 16. זה יעודדו את הנויטרופילים, בintegrins בפרט, עוד יותר, מה שהופך אותם יותר נוטה לדבוק לאנדותל. בדרך כלל 2 מהירות זרימת סנטימטר / DYN 1 משמשת. מהירות זרימה זו נמדדת בvenules פוסט נימים, אתרים שבם רוב הגירת transendothelial יקוציט מתרחשת 17. שימוש בזרימת התאים שתוארו, ניתן להגביר את מהירות עד לזרימת 10 DYN / 2 סנטימטר. עם זאת, זה לא מומלץ להגדיל את הגזירה נוספת. זה עלול לגרום לדליפה לא רצויה של הצינור והניתוק של התאים מהזרימה קאמרית. התוצאות מתוארות באיור 3 עולות כי אלהנוגדנים יכולים לשמש כדי לחזות וללמוד את הדינמיקה של תאי תאי צמתים האנדותל במהלך diapedesis יקוציט. בפרט, בנוסף למבחני גלגול הקיימים פרוטוקול זה מאפשר להפלות paracellular מהגירת transcellular תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים בזמן אמת. מאז הנוגדנים להכתים את תאי תאי צמתים, אחד יכול להבקיע מספר כדוריות הדם לבנות החוצים VE-cadherin / צמתים PECAM-1-חיוביים לעומת nonpositive VE-cadherin / PECAM-1 אתרים. דרך, הגירת transcellular זה יכול להיות מופלה מהגירת paracellular. חשוב להדגיש כי נוגדנים אלה לא מפריעים לתפקוד של החלבונים שהם נקשרים ל: הנוגדן PECAM-1 שימש במחקר זה מופנה כנגד תחום תאי השני. תאי האנדותל שהיו מצופים בנוכחות הנוגדנים לא הראו פגמים בהפצת או להרכיב monolayer, דבר המצביעים על כך שהנוגדן לפחות לאלהפריע לאינטראקציות homotypic בין תאי האנדותל. בנוסף לכך, שני הנוגדנים אינם פוגעים ביכולתם של נויטרופילים לנדוד דרך monolayer אנדותל. בנוסף, מספר הנויטרופילים שמתגלגלים לאורך monolayer אנדותל בהעדר או הנוכחות של הנוגדנים לא שינה (מידע לא מוצג). חשוב לציין, מיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal נותנת לנו את האפשרות להקליט את ערוצי ניאון שונים ודסק&quot;ש בו זמנית. לפיכך, assay זה מאפשר ללמוד את הדינמיקה של VE-cadherin וPECAM-1 באותו הזמן שבו נויטרופילים חוצים את צומת תאי תאי אנדותל ויעזרו להבין מדוע לויקוציטים לבחור מסלול אחד על פנים השני, כלומר, paracellular לעומת transcellular.

הגירת transendothelial יקוציט יעילה ופיקוח הדוק (TEM) היא בעל חשיבות מרכזית בתהליכים פיסיולוגיים כגון מעקב חיסוני ודלקת חריפה. עם זאת, בתנאים פיתו-פיסיולוגי מסוימים, TEM מבוקר והמוגזם הוא ציין וכתוצאה מהמחלות כרוניות דלקתיות (למשל, דלקת מפרקים שגרונית, טרשת עורקים, אסטמה). כמו כן, במהלך גרורות של תאי גידול, התהליך של הגירת transendothelial הוא סייע לתאים סרטניים לעזוב את זרימת הדם לגרורות 1-3. על מנת במיוחד כדי להפריע ליקוציט מוגזם או TEM תאים סרטניים, נדרשת הבנה מפורטת של הרגולציה של תהליך זה. הוא האמין כי תהליך TEM מתרחש דרך שלבים שונים. מחקרי זרע, בביקורת לפני שני עשורים על ידי הקצב ושפרינגר, הובילו למודל הרב שלבי המתאר את התהליך של TEM 4,5. מודל זה עדיין נכון, למרות שחלקם המודעהצעדי ditional נכללו 6. אלון et al. תאר את הצורך בנוכחות של כמוקינים משותקים על פני השטח של האנדותל 7. לאחרונה, הם הראו כי האנדותל עצמו מייצר כמוקינים המוצגים במשטח פסגת אנדותל 8. יתר על כן, אותה הקבוצה הציגה את החשיבות של תנאי זרימה במהלך 7 TEM. לאחרונה, מספר פרסומים התמקדו בשתי כדוריות הדם לבנות מסלולים שונים יכולים לקחת בשלב diapedesis הסופי של TEM. הם יכולים לעבור את תאי תאי צמתים, כלומר, מסלול נדידת paracellular, או לעבור בגוף התא האנדותל, הידוע במסלול נדידת transcellular 9. קרמן ועמיתיו חקרו מסלולים אלה בפירוט והגיעו למסקנה כי לויקוציטים מעדיפים לבחור את מסלול נדידת paracellular (90%) על פני מסלול transcellular (10%) בעת חציית monolayer אנדותל וריד טבור 10.עם זאת, כאשר תאי אנדותל ממקורות אחרים שמשו, למשל, מוח או microvasculature, יותר לויקוציטים משמש מסלול transcellular (30%) 11. קבוצת Vestweber לאחרונה הראתה שכאשר תאי תאי צמתים לא הצליחו לנתק את זה מזה באמצעות דפיקה-במודל חיה, החלפת אנדוגני VE-cadherin לVE-cadherin-alpha-catenin כימרה, TEM יקוציט נחסם 12 באופן מלא . באופן מפתיע, החוקרים שמו לב שTEM נחסם בכמה, אבל לא כולם, רקמות. בסך הכל, ניסויים האלגנטיים אלה הצביעו על כך שכדוריות דם לבנות העדיפו את מסלול paracellular על ציר transcellular, למרות אותות הרגולציה שמפעילים החלטה זו עדיין אינם ידועים. למרות שהרוב המכריע של לויקוציטים מעדיף מסלול נדידת paracellular, זה עדיין קשה להבחין בין שני המסלולים. בנוסף לכך, למרות מספר מחקרים המתמקדים בתפקידו של junct תאי תאי אנדותליונים, הדינמיקה של צמתים אלה, בפרט חלבוני junctional VE-cadherin וPECAM-1, במהלך המעבר ליקוציט עדיין בדיון. פיתחנו assay פשוט יחסית שבו ניתן לנטר מולקולות הצומת האלה בזמן אמת במהלך diapedesis יקוציט תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים באמצעות נוגדני fluorescently שכותרתו. נוגדנים אלה לא להפריע או לחסום שלמות או ניידות junctional של החלבונים הממוקדים. assay זה מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה של חלבוני junctional במהלך התהליך של TEM paracellular. בנוסף, assay זה גם מאפשר להפלות בין מסלולי נדידת הטפילים וtranscellular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

במהלך דלקת, כדוריות דם לבנות לעזוב את מחזור הדם ולחצות את האנדותל להילחם פולש פתוגנים ברקמות בסיסיים. תהליך זה ידוע כהגירת transendothelial יקוציט. שני מסלולים לויקוציטים לחצות את monolayer אנדותל תוארו: מסלול paracellular, כלומר, באמצעות תאי תאי צמתים ומסלול transcellular, כלומר, דרך גוף התא האנדותל. עם זאת, זה כבר קשה מבחינה טכנית להפלות בין הטפילים ומסלול transcellular. פיתחנו assay במבחנה פשוט ללמוד חלוקת אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial נויטרופילים תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים. לפני זלוף נויטרופילים, טופלו תאי האנדותל קצר עם נוגדני fluorescently שכותרתו נגד VE-cadherin וPECAM-1. נוגדנים אלה לא מפריעים לתפקוד של שני החלבונים, כפי שנקבע על ידי תא substra החשמלימדידות חישת עכבת te וFRAP. שימוש assay זה, היינו מסוגל לבצע את חלוקת אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial תחת תנאי זרימה ולהיפלות בין מסלולי טפילים וההגירה transcellular של לויקוציטים פני האנדותל.

בדקנו קודם אם הנוגדנים לא הפריעו לתפקוד המחסום של האנדותל. מדדנו את ההתנגדות של monolayers אנדותל באמצעות חישה חשמלית תא מצע עכבה (ECIS). לפרטים, ראה ואן Buul et al. 13 אין שינוי בהתנגדות נצפה כאשר הנוגדן אנטי-VE-cadherin fluorescently שכותרתו התווסף לתאים (איור 2 א). נוגדן אנטי VE-cadherin-שמוכר היטב לחסום VE-cadherin הפונקציה הפחיתה את ההתנגדות באופן דרמטי (איור 2 א). כמו כן, הנוגדנים המשמשים להדמיה אינו משנה את הדינמיקה של VE-cadherin, כפי שהוערך על ידי מדידת התאוששות ניאון לאחר צילום הלבנה (FRAP) של VE-cadherin-GFP (איור 2). אחרי 1-2 דק &#39;, נויטרופילים דבקו monolayer האנדותל הופעל כיכול להיות דמיינו בערוץ דסק&quot;ש (איור 3 א). לאחר הזחילה ל5-30 seג, הרוב המכריע של נויטרופילים transmigrated דרך monolayer האנדותל באמצעות תאי תאי צמתים שתויגו עם הנוגדנים המכוונים נגד PECAM-1 וVE-cadherin. במהלך התהליך של diapedesis, חלוקת-VE cadherin וPECAM-1 המיושמת בזמן אמת (איור 3 ב). באתרים של diapedesis נויטרופילים, שובש באופן מקומי וPECAM-1 הראה מבנה דמוי טבעת יותר-cadherin VE. לאחר השלמת diapedesis, צמתים הקרובים וPECAM-1 עברו באתרים של diapedesis (איור 3 ג) בבירור-cadherin VE. שים לב שחלקים של הנוגדן אנטי PECAM-1 התגלו על פני השטח של נויטרופילים פעם נויטרופילים הגיעו לצד baso הצדדי של האנדותל. עם זאת, זה לא מנע נויטרופילים מחוצים את האנדותל. הדינמיקה שנצפתה של VE-cadherin בזמן אמת במהלך נדידת transendothelial נויטרופילים היו בהסכם עם העבודה על ידי שו ועמיתים שהראה, באמצעות מיקרוסקופ confocal ותאי האנדותל, שמתפזר לצדדים כאשר כדוריות דם לבנות חצו את צמתים תאי תאי אנדותל 14 cadherin-GFP-VE-cadherin-GFP-transfected VE. כמו כן עבודה על ידי סו ועמיתים לעבודה הדגישו התצפיות של PECAM-1 שלנו. הם הראו דיפוזיה ש, ליד לרוחב VE-cadherin על מעבר ליקוציט, PECAM-1 מחדש באופן מקומי לתוך טבעת סביב נויטרופילים transmigrating 15. <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> איור 1 בתא זרימת מבחנה. () חץ מציין את המאגר שממנו בינוני צריך להיות רעננים. צינורות (ב) סיליקון שמחבר את תא הזרימה עם יציאת הזרקת Luer אונליין הבמשמשת להזרקת PMNs מבלי לנתק את הצינור (ראש החץ). (C) קונטיקטשיקוף של זרימת מחסנית ריקה לבקבוק המאגר מלא ב37 מעלות זרימת חיץ C (ראש חץ). חיבור (D) של הזרימה קאמרית עם HUVECs TNF-α שטופל בצינור זרימה המכיל חיץ והניח בבמת מיקרוסקופ (ראש החץ). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 נוגדנים לא להפריע לדינמיקה או פונקצית junctional-cadherin VE. () עכבת monolayer תא האנדותל נמדדה באמצעות ECIS. ציר Y מבטא עכבה באוהם וציר x מייצג את הזמן בשעות. שיבוט VE-cadherin נוגדן 55-7H1, שכותרתו עם Alexa647 (קו כחול) או אלוטיפ שליטת IgG-Alexa647 (קו אדום) אינו משנה עכבת monolayer תא אנדותל, ואילו VE-cadherin חסימת CL75 נוגדן (קו שחור) לא להקטין את העכבה . (B </strong&gt;) בא לידי הביטוי בHUVEC-cadherin-GFP VE וניתוח FRAP באמצעות מיקרוסקופ confocal עולה כי אין שינוי בהתאוששות הקרינה בנוכחותו או היעדריו של VE-cadherin 55-7H1 נוגדן. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> () נויטרופילים (מסומן בקו לבן) והקפדה על האנדותל וחוצה את צומת תאי תאים מבלי להשפיע על חלוקת איור 3 VE-cadherin וPECAM-1 הפצה בTEM נויטרופילים בזמן אמת. VE-cadherin וPECAM -1. (ב) נויטרופילים חוצים את monolayer האנדותל באמצעות תאי תאי צמתים. פיזור מקומי של וPECAM-1 ניתן להבחין כאשר נויטרופילים בולט באמצעות תאי תאי צמתים cadherin-VE. קו לבן ממחיש נוכחות נויטרופילים עדיין בחלק העליון של האנדותל. צהוב קו מראה tha קרום נויטרופיליםכבר לא הוא מתחת האנדותל. (ג) נויטרופילים חצו monolayer האנדותל באופן מלא. -VE cadherin וPECAM-1 עברו באתרים של diapedesis. קו צהוב ממחיש גבולות של נויטרופילים transmigrated. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow at JoVE.com

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.4K Views.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול. 

Video: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

בזמן אמת הדמיה של leukotriene B 4 Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...