עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק R00AG031911 מהמכון הלאומי להזדקנות של המכונים הלאומיים לבריאות לPHM התוכן של מאמר זה אינו משקף בהכרח דעות רשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

<ol><li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability%2C+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).</li>
<li>Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+DNA+replication+and+recombination+activities+in+the+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability.</a> J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).</li>
<li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metab. 16, 18-31 (2012).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Madia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11, 599-606 (2012).</li>
<li>McMurray, M. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+age-induced+switch+to+a+hyper-recombinational+state%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An age-induced switch to a hyper-recombinational state.</a> Science. 301, 1908-1911 (2003).</li>
<li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).</li>
<li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5%26%2334%3B-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast%3A+5-fluoro-orotic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">A positive selection for mutants lacking orotidine-5&#34;-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).</li>
<li>Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CAN1+locus+of+Saccharomyces+cerevisiae%3A+fine-structure+analysis+and+forward+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates.</a> Genetics. 91, 35-51 (1979).</li>
<li>Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mother+enrichment+program%3A+a+genetic+system+for+facile+replicative+life+span+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 183, 413-422 (2009).</li>
<li>Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+age+induces+mitotic+recombination+in+the+ribosomal+RNA+gene+cluster+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS Genet. 7, e1002015(2011).</li>
<li>Feser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+histone+expression+promotes+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Elevated histone expression promotes life span extension.</a> Mol Cell. 39, 724-735 (2010).</li>
<li>Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+circuit+for+selectively+arresting+daughter+cells+to+create+aging+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).</li>
<li>Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+transcriptional+silencing+causes+sterility+in+old+mother+cells+of+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae.</a> Cell. 84, 633-642 (1996).</li>
<li>Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+reactive+oxygen+species+begin+early+during+replicative+aging+of+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).</li>
<li>Dang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H4+lysine+16+acetylation+regulates+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.</a> Nature. 459, 802-807 (2009).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14, 115-132 (1998).</li>
<li>Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+is+associated+with+genome+instability+during+chronological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).</li>
<li>Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+analysis+CalculatOR%3A+a+web+tool+for+the+determination+of+mutation+rate+using+Luria-Delbruck+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis.</a> Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+estimator+of+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A robust estimator of mutation rates.</a> Mutat Res. 661, 101-109 (2009).</li>
<li>Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+inheritance+of+oxidatively+damaged+proteins+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.</a> Science. 299, 1751-1753 (2003).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה משלב מספר שיטות כדי לאפשר משאבים וגישות זמינים בSaccharomyces מערכת מודל cerevisiae להיות מיושם ביעילות למחקר של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic. מגוון רחב של מבחני לכמת צורות שונות של חוסר יציבות הגנום באמצעות בחירת פנוטיפי יכול להיות משולב עם מיון מגנטי ללמוד אפשריים ספציפי לגיל שינויים בהצטברות של צורות מסוימות של מוטציות או שחלופי כרומוזום. בעוד גישות רצף הגנום יכולות לספק מידע נוסף על הסוגים הכלליים של שינויים המתרחשים בגנום עם גיל, את היכולת להשתמש במערכות בחירת פנוטיפי להשיג מדידות שיעור מוטציות וכדי לבודד מעדיף סוגים מסוימים של שינויים גנטיים הם יתרונות חשובים ללימוד מכניסטית היבטים של חוסר יציבות הגנום הקשורות להזדקנות. התייעלות קביעת גיל תא והפוטנציאל לבצע מדידות מקבילות של physiologiשינויי קלוריות באמצעות cytometry זרימה לספק אמצעים יעיל כדי לתאם חוסר יציבות הגנום עם שינויים תאיים אחרים בזמן טווחי גיל ספציפיים. קביעת פוטנציאל תלוי גיל שינויים בשיעורים של מוטציות מצטברות דורשת: 1) קביעה מדוקדקת של שיעורים באוכלוסיות תאים צעירים, 2) קביעה מדויקת של גיל תא, ו3) היכולת להעשיר באופן מהימן אוכלוסיות גדולות מספיק של תאי אם למדוד reproducibly חוסר יציבות הגנום בגיל המבוגר. גישה זו מאפשרת למערכת שמרי המודל לתרום להגדרת מנגנונים אחראים לתלוי גיל שינויים בשיעורים ו / או תדרים של חוסר יציבות הגנום בתאי mitotically פעילים שבבסיס. יתר על כן, גורמים גנטיים וסביבתיים ניתן להעריך במהירות לתרומות לחוסר יציבות הגנום תלוי גיל. סופו של דבר, אפיונים אלה יכולים להוביל לפיתוח מודלים המסבירים את האופן שבו מוטציות מצטברות במהלך הזדקנות replicative. שיטה זו תלויה ביכולת לזהות מוטציות או סוגים אחרים של חוסר יציבות הגנום באמצעות הופעתו של פנוטיפים לבחירה למדידת שיעורים של אירועים כאלה. עם זאת, יצירתיות בעיצוב assay יכולה להרשות להיבטים רבים של חוסר יציבות הגנום להיחקר. לדוגמא, URA3 וגני CAN1 יכולים להיות ממוקמים באתרים גנומיים שונים כדי לבדוק את כל השפעות של מיקום גנטי על תוצאות. חזרה של אללים של גן שאינו פונקציונליים ספציפיים לאללים גן פונקציונליים יכול לבדוק תהליכי מוטציה מסוימים. כמו כן, כניסתה של אללים פעילים מרובים של גן או איגוף גן עם רצפים חוזרים יכולה לשמש כדי לבחון אירועי רקומבינציה דרך שיקום או אובדן של תפקוד גן, בהתאמה. בדיקות תנודות הן הגישה סטנדרטית לקביעת שיעורי אלה אירועי חוסר היציבות הגנום השונים 9. הפרוטוקול נכתב באמצעות האומדן החציוני לאה-Coulson המקובל היטב ופשוט יחסית כדי לקבוע mutaשיעור tion כדי להפוך אותו נגיש יותר לחוקרים מגוונים, למרות ששיטת אומדן סבירות MSS-מקסימום נחשבת הגישה הטובה ביותר לקביעת שיעורי מוטציה 9. אומדן סבירות MSS-המרבי נבדק בעבר בפירוט 9, ויכול לשמש כשיטת חלופית, אבל דורש חישובים מתוחכמים יותר. לחלופין, תוכנה חופשית לחישוב שיעורי מוטציה בשיטה זו הפכה לזמינה 22. קבלת אמצעים לשחזור של שיעורי מוטציה דורשת תשומת לב לכמה היבטים של תכנון ניסוי, כוללים שימוש בתרבויות לשכפל מספיק, ייחסו תרבויות בצפיפות תא נמוכה מספיק ראשונית שעולה גודל אוכלוסייה על ידי כרכי תרבות המתאימים 10,000 פי או יותר, ובחירה, כך שכל אוכלוסייה של תאים ניתן להפיץ על גבי מצע סלקטיבי. לנקודה האחרונה, נוסחה שתוארה לעיל יכולה לשמש כדי להתאים את שיעור מוטציות המבוססות על חלק קטן של טסט התרבותד 9. וריאציה בקצב צמיחה של תרבויות יכולה לסבך את קביעת שיעור מוטציות לשחזור, ואומדן המבוסס על חציון שונה שעשויים להניב תוצאות לשחזור יותר במצבים כאלה תוארו 23 לאחרונה. היכולת למדוד גיל תא בצורה מדויקת היא גורם נוסף שהוא חשוב לקביעה אם תדרי חוסר יציבות הגנום בתאים ישנים שונים מהערכים הצפויים בשל שיעור האירועים בתאים צעירים. מצאנו כתמי WGA להיות עדיף על calcofluor צביעה לבנה, הן מבחינת רקע וגמישות, מאז WGA זמין מצומדות למולקולות ניאון שונות. גמישות זו יכולה לספק יותר הזדמנויות למדידות בו זמניות של מאפייני תא אחרים עם ריאגנטים ניאון. עבודה ראשונית ליצור מערכת יחסים בין עוצמת האות לצביעת WGA והמספר המתאים של צלקות ניצן על תאים ולאחר מכן יכול להוביל ליותרקביעה מהירה של גיל תא דרך cytometry זרימה. גישה זו גם מאפשרת שימוש בגדלי אוכלוסייה גדולים יותר ממה שאפשר בחן בדרך כלל על ידי מיקרוסקופ לשחזור משופר של מדידות. ניתן אמנם עשו את כל קביעות הגיל באמצעות בדיקה מיקרוסקופית של התאים, אנחנו מרגישים שזרימת גישת cytometry מאפשרת סינון מהיר של גורמים המשפיעים על חוסר יציבות הגנום תלוי גיל. בנוסף למדידת גיל תא באופן מהימן, שיקול צריך להיות נתון למספר חלוקות תא תאי אמא מותר לעבור עם כל סיבוב של גידול ומיון תאים רצוף. השתמש בגודל קטן יותר ראשוני אוכלוסייה או גדול יותר נפח תרבות יכול לאפשר לתאים לעבור יותר חלוקות תא לפני שהגיע לצפיפות התאים הרצויה. לדוגמא, חוקרים אחרים השתמשו רק בשני סבבי מיון להשיג תאים ישנים מאוד שמרים 16, שבו יש יתרון הברור של קבלת תאים ישנים עם פחות experimeצעדי פתיחות opening סגירות closures. כאשר שוקלים האם להגדיל נפח התרבות כדי לאפשר את התאים כדי להשלים יותר חלוקות תא לפני המיון, יש לזכור את המגבלה על המספר הכולל של תאים שיכולים להיות מעובד בעמודה אחת. השתמש של גדול יותר נפח תרבות עשוי להצריך שימוש בעמודות מרובות כדי למיין אוכלוסיית תא אחד. כמו כן, אם תאים עוברים פחות סיבובים של חלוקת תא בין נקודות מיני / אוסף, אז יש יותר הזדמנויות לצפות חריגות מתדרי מוטציה צפויות בנקודות זמן שונות במהלך תוחלת חיים. לדוגמא, דגימה רק בתחילה ונקודות זמן מאוחר במהלך תוחלת חיים עשויה לייצר נתונים המצביעים על עלייה מתמדת בשכיחות מוטציה, אבל דגימה בזמנים ביניים נוספים במהלך תוחלת חיים עשויים להראות כי עלייה בתדירות מוטציה במהירות ולאחר מכן מישורים. עם זאת, מאז פרוטוקול זה מבודד את תאי אמא ישנים, יש הזדמנות להשיג מדד ישיר יותר של שינויים בשיעורי מוטציה עם גיל. בדיקות תנודות יכולות bדואר מתבצע באמצעות תאי אמא בגילים שונים כדי לקבוע אם שיעור המוטציות יהיה שונה מהשיעור שהושג תוך שימוש בתאים צעירים. בעוד התרבויות לבדיקות תנודות אלה תהפוך לתערובת של תאים זקנים וצעירים כאשר הם גדלים, כל חריגה משיעורים שהושגו החל מתאים צעירים אפשר לייחס לשימוש באוכלוסיית המוצא מבוגר. היכולת להשיג reproducibly מספיק אוכלוסייה גדולה של תאי אמא של גילאים עד למדוד חוסר יציבות הגנום מדויק היא קריטית להצלחה של גישה זו. בעוד הפרוטוקול מתאר את השימוש במערכת מיון מגנטי מסוימת למטרה זו, קבוצות אחרות שמסודרות על תאי אמא של שמרים עם מערכות חלופיות 14,18 (ראה טבלה של חומרים). מערכות חלופיות כגון צריכה גם לעבוד בשיטה זו, אם כי עשויה להידרש כמה אופטימיזציה של הפרוטוקולים של היצרנים. ללא קשר למערכת הספציפית בשימוש, גודל האוכלוסייה דורשנבדל ד בהתאם לתדר של הסוג של סידור מחדש מוטציה או הגנום שנבחר למחקר. לכל הפחות, חייבת להיות מספיק תאי אם להשיג מושבה מוטציה אחת לפחות לכל אוכלוסייה לחישוב תדירות מוטציה. בפועל, תוצאות יכולות להיות די משתנים ולו רק אפס עד חמש מושבות מוטציה צפויות מגודל האוכלוסייה, ואפילו עלייה קטנה בגודל אוכלוסייה, ולכן כי חמישה עד עשר מושבות מוטציה צפויות, יכול לשפר את שחזור באופן משמעותי. כאשר יוטין תיוג אוכלוסייה מתחילה, התאוששות היעילות עבור כל סוג צריכה להילקח בחשבון כדי לסייע בזיהוי גודל האוכלוסייה המתאים דרוש כדי למדוד תדירות מוטציה בתאי אמא ישנות. עם התאוששות 90% מתאי אם לאחר כל סוג, רק 59% מהאוכלוסייה המקורית היו להיות התאוששו לאחר חמישה סבבים של צמיחה ומיון. זה יורד ל ~ התאוששות 33% מהאוכלוסייה המקורית לאחר חמישה סבבים של צמיחה ומיון אם רק 80% מתאי אמא שכותרתו להתאוששed במהלך כל סוג שהוא. מדידה ולמקסם את ההתאוששות היא חיונית כאשר מודדים אירועים בתדירות נמוכים, שכן 2:58 ירידה של פי גודל אוכלוסייה יכולה בקלות להוביל למספרים לא אמינים של מושבות מוטציה לאוכלוסייה. ישנם מספר רב של אפשרויות להרחבה או שינוי בפרוטוקול זה כדי להשיג הבנה רחבה יותר של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic. דוגמאות פשוטות כוללות ניתוח איך שינויים בפונקציות גן, שינויים בתקשורת, או שינויי מצב סביבתי אחרים לשנות את ההצטברות של מוטציות עם גיל. שיעורי מוטציה בתאים צעירים עם תפקוד גן שעבר שינוי או במצב המתאים יהיו נמדדו ומשמשים כדי לקבוע אם מוטציות מצטברות באופן שונה מהצפוי על ידי ערכי השיעור ואופן שונה מאשר באוכלוסיות תאי שליטה. אוכלוסיות תאים בנקודות שונות במהלך הזדקנות replicative עלולות להיחשף לגורמי לחץ מסוימים, כגון מיני חמצן תגובתי או סוכנים מזיקים DNA.חשיפה חולפת וקלה לסטרס חמצונים משמעותי לא שינתה את היכולת לבצע מיון תא (איור 3), אבל לחצים קשים יותר עלולים לסבך התאוששות של תאים. ניסויים ראשוניים יהיו צורך לוודא שעדיין יכולים להיות התאוששו תאי אמא ביעילות אחרי לחצים ספציפיים. בנוסף, המאפיינים התאיים של תאי אם מבודדים יכולים להיות מנותחים בפירוט, כוללים רמות של מיני חמצן מגיבים, מורפולוגיה של המיטוכונדריה וvacuolar, ומאפיינים פיסיולוגיים אחרים הקשורים להזדקנות 3. יתר על כן, תאי אמא יכולים להיות אוכלוסייה מתחילה לטיפול או מניפולציה נוסף. מאחר ותאים אם ובתה מופרדים פיזי במהלך ההליך, תאי הבת הם גם עדיין זמינים לניתוח. לדוגמא, שינויים במאפיינים פיסיולוגיים של תאי בת או הירושה סימטרית של מקרומולקולות הפגומה בין שמרי אם ותאי בת <sעד&gt; 24 יכולים להיות בהשוואה לעיתוי של שינויים מעניינים בתדרים / שיעורי מוטציה. יכולים גם להיות מושגת תדרי מוטציה לאוכלוסיות תאי בת על מנת לנסות לדגמן אם יש ירושה סימטרית של מוטציות במהלך הזדקנות replicative. לסיכום, שילוב של ההעשרה של תאי אם דרך תא מגנטי מיון עם בדיקות תנודות מאפשר את היתרונות של ס מערכת מודל cerevisiae להיות מיושמת ביעילות לחקר מנגנונים אחראים להצטברות של שינויים גנטיים במהלך הזדקנות תא mitotic.

מיקרואורגניזמים, כגון שמרי Saccharomyces cerevisiae, הם מודלים מצוינים לחקירת שיעורי מוטציה, אבל מודלים אלה לא נוצלו במלוא לחקור את ההצטברות של מוטציות במהלך הזדקנות mitotic של תאים. הצטברות מוטציות בגנום הגרעיני כבר שיערו לתרום להזדקנות על ידי וכתוצאה מכך אובדן ההדרגתי של (או וריאציה) פונקציות גן 1. היכולת להשתמש במערכת של חיידקים כדי לחקור את המנגנונים והשלכות של הצטברות מוטציות במהלך ההזדקנות עלול להאיץ את זיהוי של גורמים גנטיים וסביבתיים משפיעים על התהליך הזה, משום שמערכות גנטיות קלילה וקל לכימות שינויי פנוטיפי נדירים במיקרואורגניזמים רב. גורמי תיקון דנ&quot;א וחלבוני תגובת נזק לדנ&quot;א נשמרים היטב על פני מינים שונים 2, ודמיון יסודי בהזדקנות האורגניזם זוהה עבור אורגניזמים מגוונים כמו ס &#39; cerevisiaeיונקי ד 3, שהופכים אותו סביר להניח כי תוצאות שהתקבלו ממחקרים בשמרים יהיו רלוונטיות להזדקנות באורגניזמים רבים. מחקרים של ההזדקנות בס cerevisiae לעשות שימוש בשני מודלים הזדקנות המודדים הזדקנות כרונולוגית או הזדקנות replicative של תאים. הזדקנות כרונולוגית מאופיינת באובדן ההדרגתי של יכולת קיום באוכלוסיות שמרי תא שנמצאות במצב (שלב נייח) החלוקה הלא בשל דלדול מזין 3. מודל ההזדקנות הכרונולוגי כבר בשימוש על מנת להוכיח כי מוטציות מצטברות עם עלייה בגיל 4, שכן אוכלוסיות תאים גדולות מתקבלות בקלות במודל זה כדי לבצע בחירות פנוטיפי לתאים שעברו מוטציה. במקרה זה, הצטברות מוטציה מופיעה להיות מושפעת מסלולי איתות צמיחה וסטרס חמצונים 5, וכל אחד מהגורמים הללו הוא רלוונטי להבנת הזדקנות אאוקריוטים רב תאיים 3. מודל הזדקנות replicative מנצל divisi סימטריעל בין ס תאים אם ובתה cerevisiae לחקירת הזדקנות המתרחשת עם דורות תא רצופים 3. הזדקנות replicative שמרים כבר נמדדה לעתים קרובות באמצעות מיקרומניפולציה של אוכלוסיות קטנות של אמא ותאי בת, או יותר לאחרונה, באמצעות וידאו מיקרוסקופי של אוכלוסיות קטנות של תאי שמרים במכשירי microfluidic 6,7. גודל אוכלוסייה מוגבל לעשות גישות אלה אינם מתאימים לחקירת הצטברות מוטציה במהלך הזדקנות המיטוטי אלא אם כן מידע כלל הגנום מתקבל מהתאים בודדים או שינויים גנטיים גבוהה מאוד בתדירות נמדדים 8. רצף הגנום של תאים בודדים מספק ערכות נתונים משמעותיות לחקירת הצטברות מוטציות, אבל יש לי מערכות בחירת פנוטיפי היתרון החשוב של מתן אמצעי למדידת שיעורי מוטציה ללמוד מנגנוני צבירת מוטציה בסיסית. מחקרים כדי לבחון תדרי מוטציה ושיעורים דרך בחירות פנוטיפי בhaploiזני שמרי ד במהלך הזדקנות replicative טרם דווח. שיעורי מוטציה נפוצה נמדדים באמצעות בדיקות תנודות 9. ערכי תדירות מוטציה משקפים את המספר הכולל של תאי מחסה מוטציה ברצף גן באוכלוסייה. זה כולל תאים בי מוטציות עצמאיות להתרחש וכל צאצאים של אותם תאים שפשוט יורשים מוטציות קיימות מראש. בניגוד לכך, שיעורי מוטציה נמדדו באמצעות בדיקות תנודות מייצגים את מספר המוטציות עצמאיות שזה עתה להתעורר עם כל דור תא. בדיקות אלו בדרך כלל כרוכים בלחסן תרבויות לשכפל רבות בצפיפות תא נמוכה כדי להקטין את הסיכוי של הוספת תאים עם קיימות מראש מוטציות ברצף יעד, גדלו תרבויות לרוויה ליד, וזיהוי תאים שעברו מוטציה על ידי צמיחה במצע סלקטיבי. מספרם של תאים שעברו מוטציה שזוהו באוכלוסיות לשכפל משמש לאחר מכן באחד מכמה מודלים מתמטיים כדי להעריך את המספר שלימוטציות ndependent שעלו במהלך הצמיחה 9. השוואת מספר המוטציות עצמאיות לגודל האוכלוסייה הממוצע מספקת מדד של שיעור המוטציות. בס cerevisiae, תדרים ושיעורי מוטציה לעתים קרובות נמדדו באמצעות גני URA3 וCAN1, מאז מוטציות אובדן של פונקציה בגנים אלה לייצר פנוטיפים לבחירה. אובדן תפקוד URA3 הופך תאים עמידים ל5-fluoroorotic חומצה (5-פואה), מאז החלבון מקודד על ידי URA3 ממיר 5-פואה למולקולה רעילה 10. אובדן התפקוד של CAN1 מאפשר לתאים להפוך לעמידים בפני canavanine, אנלוגי ארגינין רעיל, מאז החלבון מקודד על ידי CAN1 משלוחי ארגינין וcanavanine לתאים 11. שני אסטרטגיות המיון הגנטיות ופיסיות כבר מועסקות בהצלחה להשיג אוכלוסיות גדולות יותר של ס &#39; תאי אם cerevisiae כדי להקל על חקירות של הזדקנות replicative. אסטרטגיות גנטיות כוללות גישות חכמות שתבחרנה נגד הישרדות תא בת באוכלוסייה. תכנית העשרת אמא (חבר הפרלמנט האירופי) כרוכה אינדוקציה בטא אסטרדיול ביטוי recombinase Cre רק בתאי בת, שמובילה לשיבוש בתו הספציפי של שני גנים חיוניים שהונדסו כדי להכיל אתרי loxP 12. ניתן לגדל זני חבר הפרלמנט האירופי, בדרך כלל בהיעדר inducer, אלא רק את תאי האם ימשיכו לחלק הבאים אינדוקציה, בעוד שתאי בת יעצרו בM-שלב בדרך כלל במהלך ההתקדמות הראשונה שלהם דרך מחזור 12 התא. בעוד מערכת זו לא נעשתה שימוש כדי ללמוד באופן רחב הצטברות מוטציה במהלך הזדקנות, זה כבר נעשה שימוש כדי ללמוד אובדן הטרוזיגוטיות, צורה תכופה יחסית של חוסר יציבות הגנום בזני שמרי דיפלואידי, כמו גם שינויים ביוכימיים בתאי אמא של הזדקנות 13,14. באופן דומה, מערכת הכלה arrester כרוך ביטוי בתו הספציפי של ס &#39; cereviגן siae URA3 15. זני הכלה arrester לגדול בדרך כלל עד 5-פואה מתווספת לבינונית, שבו תאי בת הנקודה להביע URA3 ימותו, ואילו תאי אם ימשיכו לגדול 15. אלה הם מערכות שימושיות להעשרה לתאי אמא, אבל הם תלויים בתחזוקה של פונקציות הגן, המהוות את מערכת הבחירה. מוטציות אקראיות ברכיב אחד או יותר של מערכת הבחירה עלולות לגרום לתאי בת שלהימלט הבחירה ולהתרבות באופן אקספוננציאלי. במהלך פיתוח של זני חבר הפרלמנט האירופי, בגדלים אוכלוסייה מתאימים היו נחושים בדעתו להימנע ממראית העין של תאי בת מוטציה שיכל לברוח הבחירה 12. עם זאת, מגבלה זו בגודל אוכלוסייה פוגעת בזיהוי של צורות נדירות של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות replicative. הגבלה זו על גודל אוכלוסייה ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש בזני שמרי דיפלואידי עם שני עותקים של כל גן תורמים למערכת הבחירה, שכן רובמוטציות עלולות להיות רצסיבי 12. עם זאת, שימוש בזני דיפלואידי מגביל את סוגי אירועי מוטאציות שניתן לאתר בקלות בהשוואה לאלו שניתן לאתר בקלות בתאי שמרים הפלואידים. אסטרטגיות מיון פיזיות כוללות בידוד של תאי אמא עם תא שטח שכותרתו מתאי בת ללא תווית להעשיר לאוכלוסיות גדולות של תאי אמא. התצפית שחלבוני פני השטח תא (דופן תא חלבונים) של ס &#39; תאי בת cerevisiae מסונתזים חדשים בניצנים נוצל לתייג תאי אמא בלי תיוג תאי הבת שהם מייצרים 16. לדוגמא, אוכלוסייה ראשונית של תאי שמרים שכותרתו על פני השטח שלהם עם ביוטין ניתן לגדל ולאחר מכן מבודדת מתאי הבת שלהם באמצעות microbeads אנטי ביוטין והמגנטי מיון 16 כי תאי הבת שנוצרו על ידי האוכלוסייה הראשונית לא יכילו ביוטין על פני השטח שלהם . וצמיחה סידורימיון מאפשר אוכלוסיות בהדרגה ישנות יותר של תאי אמא שתתקבל וינותחו. הליך זה שמש בהצלחה לבחינת שינויים בפיזיולוגיה של תא וביטוי גנים במהלך הזדקנות replicative של שמרים 13,14,17,18. השיטה הנוכחית מתאים את עצמו תיוג ביוטין זה וטכניקת מיון מגנטית להעשיר עבור תאי אמא עם צורך מדידת ההצטברות של מוטציות שעלולים להיות נדירות או צורות אחרות של חוסר יציבות הגנום assayed באמצעות בחירות פנוטיפי. צמיחה סידורי ומיון פיזי מאפשרים ניתוח של הצטברות מוטציות בתאי אמא בהדרגה מבוגרת, כמו גם באוכלוסיות תאי הבת שלהם. קביעת שיעורי מוטציה לדור מאפשרת תדירות מוטציה צפויה תחושב עבור תאי אמא שעברו מספר מסוים של חלוקות תא. מאחר וערכי תדירות חזו מבוססים על הגידול הצפוי בשל סיבובים נוספים של חלוקת תא, סטיות משמעותיות בmutati נצפהעל תדרים בהשוואה לערכים החזויים לספק ראיות לגיל ספציפי שינויים בשער של מוטציות מצטברות. שימוש בפרוטוקול זה, מכתים ניאון של צלקות ניצן שמתאימות לאתרים של חלוקות תא בתאי אמא בשילוב עם ניתוח על ידי cytometry זרימה יכול לשמש כדי לקבוע את התפלגות הגילים של אוכלוסייה ממוינת ולא ממוינת במהירות. ריאגנטים נוספים ניאון, כגון אלו המשמשים לאיתור מיני חמצן תגובתי, יכולים גם להיות מנוצלים במהלך פרוטוקול זה. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח יעיל של גיל תלוי שינויים בחוסר יציבות הגנום עם הפוטנציאל למתאם הלקשורות לגיל שינויים פיסיולוגיים תא באורגניזם מודל מתאים ללימוד הגורמים הגנטיים וסביבתיים המשפיעים על חוסר יציבות הגנום הקשורות להזדקנות.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td></tr><tr><td>MACS LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>25 columns suitable for QuadroMACS separator</td></tr><tr><td>QuadroMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>Separator Only</td></tr><tr><td>QuadroMACS Starting Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td>Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>40 &amp;micro;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td><td>Life Technologies</td><td>W11261</td><td>Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td></tr></tbody></table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae כבר מערכת מודל מצוינת לבחינת מנגנונים והשלכות של חוסר יציבות הגנום. המידע שנצבר משמרי מודל זה הוא רלוונטי לאורגניזמים רבים, כולל בני אדם, שכן גורמי תיקון DNA ותגובת הנזק לדנ&quot;א נשמרים גם בין זנים שונים. עם זאת, ס &#39; cerevisiae עדיין לא היה בשימוש כדי לטפל באופן מלא אם שיעור צבירת מוטציות שינויים עם replicative (mitotic) עלייה בגיל עקב אילוצים טכניים. לדוגמא, מדידות של אורך חיים replicative שמרים באמצעות מיקרומניפולציה כרוכות אוכלוסיות קטנות מאוד של תאים, האוסרות על גילוי של מוטציות נדירות. שיטות גנטיות כדי להעשיר לתאי אמא באוכלוסיות על ידי גרימת מוות של תאי בת פותחו, אבל בגדלים אוכלוסייה עדיין מוגבלים על ידי התדירות שבה מוטציות אקראיות שתתפשרנה מערכות הבחירה להתרחש. הפרוטוקול הנוכחי מנצל sorti המגנטיng של תאי שמרי אמא שכותרתו משטח להשיג מספיק אוכלוסיות גדולות של הזדקנות תאי אם לכמת מוטציות נדירות דרך בחירות פנוטיפי. שיעורי מוטציה, שנמדדו באמצעות בדיקות תנודות, ותדרי מוטציה הוקמו ראשון לתאים צעירים ומשמשים כדי לחזות את תדירות מוטציות בתאי אמא של גילאי replicative שונים. תדרי מוטציה לאחר מכן נקבעו לתאים ממוינים אמא, והגיל של תאי אמא נקבע באמצעות cytometry זרימה על ידי צביעה עם מגיב ניאון שמזהה צלקות ניצן נוצרו על משטחי התא שלהם בעת חלוקת תא. השוואה של תדרי מוטציה חזו מבוססים על מספר חלוקות תא לתדרים בניסוי נצפו עבור תאי אמא של גיל replicative נתון יכולה אז לזהות אם יש הקשורות לגיל שינויים בשער של מוטציות מצטברות. וריאציות של פרוטוקול בסיסי זה מספקות את האמצעים כדי לחקור את ההשפעה של שינויים בפונקציות גן ספציפיים אותנאים סביבתיים ספציפיים על הצטברות מוטציות כדי לטפל במנגנוני חוסר יציבות הגנום בסיסי במהלך הזדקנות replicative.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.c

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

שיעורי מוטציה בתאי cerevisiae Saccharomyces הצעיר נמדדו באמצעות בדיקות תנודות משמשים כדי לחזות תדרי מוטציה בתאי אמא של גילאי replicative שונים. מיון וcytometry זרימה מגנטי משמש לאחר מכן למדידת תדרי מוטציה בפועל וגיל של תאי אם לזהות כל חריגה מתדרי מוטציה חזו.

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.5K Views.  Rensselaer Polytechnic Institute.  שיעורי מוטציה בתאי cerevisiae Saccharomyces הצעיר נמדדו באמצעות בדיקות תנודות משמשים כדי לחזות תדרי מוטציה בתאי אמא של גילאי replicative שונים. מיון וcytometry זרימה מגנטי משמש לאחר מכן למדידת תדרי מוטציה בפועל וגיל של תאי אם לזהות כל חריגה מתדרי מוטציה ח?...

Video: Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Bioengineering

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

Genetics

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Developmental Biology

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

בידוד תאי גזע ממעיים למבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Midguts ידי FACS ללמוד את התנהגות תאי גזע במהלך הזדקנות

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב

Summary

Explore More Videos