Bu çalışma, bu makalenin içeriği mutlaka Sağlık Ulusal Enstitüleri resmi görüşlerini yansıtmamaktadır PHM için Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Yaşlanma Enstitüsü hibe R00AG031911 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Medya ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> Maya özü-pepton-glikoz (YPD) standart protokol için zengin bir ortam kullanarak hücreleri büyütün. % 2 Bacto-pepton,% 1 maya özütü, YPD ortamında% 2 glükoz çözeltisi hazırlayın ve 19 katı bir ortam için% 2 Bacto-agar ekleyin. Sterilize etmek otoklavlayın. Belirli bir büyüme durumu veya mutant maya suşu test etmek için, gerekirse, alternatif bir ortamı kullanın. </li><li> Kanavanin dirençli mutantların seçmek için 60 mg / L canavanine (SC-Arg + kanavanin) arginin eksik bir katı sentetik tam orta olun. Arginin (Bırakma karışımı) amino asitleri,% 2 glikoz,% 0.2 tamamlandı ek karışımı ya% 0.67 bakto-maya azot baz,% 2 Bacto-agar 19 olan bir çözelti hazırlayın. Otoklav ve 20 mg / ml stok çözeltisinden kanavanin ilave edilmeden önce soğukta 19 (4 ° C&#39;de saklanır, filtre ile sterilize edilmiş). <ol><li> 5-fluoroorotik asit (5-FOA) içeren katı sentetik tam orta olun. 500 hazırlayınamino asitler olmadan% 1.34 bakto-maya azot baz,% 4 glükoz,% 0.4 tam ek karışımını ve% 0.2 5-FOA ve bir çözelti 19 ml filtre-sterilize edin. Otoklav daha sonra 500% 4 Bacto ağar çözeltisi ilave edildi, kısa bir süre, serin ve 500 mi filtre ile sterilize edilmiş besleyici çözelti ile karıştırın. Diğer mutasyon deneyleri için uygun alternatif medyayı kullanın. </li></ol></li><li> Biotin ile etiketlenmesinde, 500 mi 1 x fosfat, 137 mM sodyum klorid, 2.7 mM potasyum klorid, 10.14 mM sodyum fosfat dibazik, ve 1.77 mM potasyum fosfat dibazik, pH içeren tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi 8 deposu 4 ° C olmak ve devam Kullanım sırasında buz. </li><li> Steril, ultra saf su taze 5 mM biyotin stok yapmak. </li><li> , Biyotin etiketleme söndürme 1x PBS 500 mi, 100 mM glisin yapmak. 4 ° C&#39;de saklayın ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak. </li><li> Ikinci hücreler ve deney süresi sayısına bağlı olarak, 1 x PBS, 2 mM EDTA,% 0.5 Bovi içeren boncuk işaretleme tamponu, 1-2 L yapmayane serum albümin. Filtre sterilize ve de gaz tampon. 4 ° C&#39;de saklayın ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak. </li><li> Hücre canlılığı ölçümlerde kullanmak için, oda sıcaklığında bir 1x PBS içinde% 0.4 tripan mavi bir çözelti, filtre sterilize ve mağaza hazırlayın. </li><li> Bir buğday tohumu aglutinin (WGA) ile floresan konjügat alikosu küçük hacimler (~ 100 | il), hücre yaş belirlenmesinde kullanım için sarılmış folyo (ya da opak) mikrosantrifüj tüpleri içinde, -20 ° C de saklamak için. </li></ol> Mutasyon Oranı ve Sıklığı 2. belirlenmesi <ol><li> Standart kültür koşulları altında yetiştirilen hücreler için dalgalanma testleri kullanılarak hücre üretimi başına temel bir mutasyon oranını kurmak. On erken sabit fazda (~ 10 8 hücre / ml) 1000-5000 hücre / ml&#39;lik bir başlangıç ​​yoğunluğunda 1 mi kültürleri çoğaltmak için yedi büyütün. <ol><li> 2000 ve koloni oluşturucu birimler / ml belirlemek için seçici olmayan ortam (YPD) üzerine 1-4 ul Aralığı: Her suret kültürü için, hücreler 1 seyreltin. Pelet ~ 2.400 x, kalan hücreler100 ul su içinde tekrar süspansiyon ve bir mikrosantrifüj içinde 1 dakika boyunca gr mutantlann tespit edilmesi için seçici bir ortam üzerine yaymak. Kolonilerin sayılması önce 30 ° C&#39;de üç gün boyunca (hücre büyüme oranına göre gerektiğinde inkübasyon zamanı ayarlamak) için inkübe edin. </li><li> Seçici bir ortam üzerinde elde edilen mutant koloni (r) sayısına göre araştırmada ortaya çıkan bağımsız mutasyon (m) sayısını belirler. 9, aşağıdaki formülde r mutant kolonilerin ortalama sayısı ile ikame m bulmak için Lea-Coulson medyan tahminleyicisini. Denklemin sol tarafı neredeyse sıfır oluncaya kadar Sonra m değerlerini yerine. <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg" /></li><li> Mutasyon oranını belirlemek için, ilk olarak suret kültürleri ve hacminin ortalama koloni oluşturan birimler / ml çarparak seçici ortam üzerine yayıldı yaşayabilir hücrelerin ortalama sayısını hesaplamakseçici ortam üzerine yayıldı mi kültür ile aşılandı. Hücre üretimi başına mutasyon oranını elde etmek için canlı hücreler bu ortalama sayısına göre adım 2.1.2 m değeri bölün. </li></ol></li><li> Aşama 2.1.3 tarif edildiği gibi ayrı ayrı bir deneyde, her kültür için suret seçici ortam üzerine yayıldı canlı hücre sayısını hesaplayın. Mutasyon frekansı elde etmek için seçici bir ortam üzerine yayıldı canlı hücre sayısına göre bir kültür elde edilen mutant koloni (r) sayısı bölün. Bazal mutasyon frekansı olarak aşama 2.1 &#39;de replike kültürden tek tek mutasyonlan frekansların ortalama veya medyan kullanın. </li><li> Mutasyon birikimi yaşa özgü değişiklikler için test ederken ihtiyacınız olacak mutasyonların sıklığında herhangi bir değişiklik etiketleme adım sonuçları dikkate olmadığını belirlemek için biotin etiketleme hücrelerinin (3.2 ve 3.4 adımları) öncesi ve sonrası frekans ölçümlerini yapmak. </li></ol> 3. biotin ile etiketlenmesinde <ol><li> Streak S. cerevisiae YPD ortamı üzerine, -80 ° C&#39;de, bir gliserol stokundan ve 1-3 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Steril bir pipet kullanarak, su tutma 1 ml (veya daha fazla) çizgi plaka transfer hücreleri akılda çizgisinin bir kalın yetiştirilen kısmının 1-1.5 cm yaklaşık 10 8 hücreleri verecektir. Hemasitometre kullanarak tam hücre yoğunluğu belirlemek. </li><li> Suşu (veya tedavi durumu) toplama noktası başına mutasyon sıklığı belirlenecek olan veya seçici ortam üzerinde örnekleme başına en az 5-10 mutant koloniler elde etmek için yeterli bir nüfus büyüklüğüne göre 10 8 hücreleri etiketlemek (adım 2.2 mutasyon frekansa göre). Suş / durumuna göre temel ölçümler için ek bir 10 8 hücreleri içerir. </li><li> Üreticisinden, 5 mM biotin reaktif stoğunu kullanmak ve hafifçe inkübasyon sırasında kaya dışında standart prosedüre göre biotin etiketi. Tüm santrifüj adımları 3000 x g hızında, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj s,4 ° C&#39;den yüksek sıcaklıklarda eğirme ince artan hücre kaybına yol açabilir. Son yıkamadan sonra, su içinde 10 8 etiketli hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar hücrelerin süspansiyonu. </li><li> Tripan mavi boya kullanılarak hücrelerin yaşayabilirliği kontrol edin. 23 ul su ve 1 x PBS içinde% 0.4 tripan mavisi ile 67 ul hücre 10 ul seyreltin. Hemasitometre kullanılarak canlı (boyasız) ve ölü (boyanmış) hücrelerini puanlama önce oda sıcaklığında en az 40 dakika bekletilir. </li><li> Genom istikrarsızlık, hücre yaş, ve diğer ilgili özellikleri için başlangıç ​​değerleri ölçün (bölümler 5, 6 görmek ve 7). </li><li> Bir Erlenmeyer şişesine (yaklaşık 5 x 10 6 hücre / ml) içinde 10 8 hücre başına YPD ortamında 20 ml biyotin-etiketli hücreler aktarın. 10 8 hücre / ml (4-5 hücre kuşakları) yaklaşık bir yoğunluğa kültür (ler), 20 ° C&#39;de 16-18 saat büyümeye ama Hücreler durağan aşamaya ulaşmak için izin yoktur. 30 ° C&#39;de büyüme için kısa bir kuluçkalama süresi kullanın. , Biyotin-etiketli c tutunboyunca 4 ° C&#39;de arşın ile birkaç saat önce orta ilave edilmeden önce, büyüme süresi ve toplama zamanlamasını optimize etmek için gerekli olursa. </li></ol> 4. Boncuk Etiketleme ve Manyetik Ayırma <ol><li> Büyüme aşamasından sonra, bir hemositometre kullanılarak, hücre kültürünün yoğunluğunu belirlemek için bir kısım seyreltin. 3000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatantı dökün. </li><li> Daha sonra, boncuk işaretleme tamponu, 30 ml pelet askıya vorteks santrifüj ve 4.1 bölüm olarak süpernatant dökülerek hücreleri yıkayın. Tekrar yıkayın. </li><li> Tamamen vorteks ile 10 8 toplam hücre başına 50 ul boncuk-etiketleme tampon hücreleri tekrar süspansiyon. Karıştırmak için kısaca 10 8 toplam hücre ve vorteks başına 2 ul manyetik boncuk ekleyin. Bir online protokol modifiye (karıştırmak için periyodik tersini, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/ A&gt;). </li><li> Boncuk etiketleme tamponu, 30 ml hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Hücreler yeniden süspanse sadece kadar orta ayarda 10 8 toplam hücre başına 0.5 ml boncuk-etiketleme tampon ve kısaca vorteks pelet ekleyin. Kalan hücre kümeleri kaldırmak için bir 50 ml tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden dökün. Gerekirse, önce kolonu üzerinde yükleme 1-2 saat boyunca buz üzerinde hücreleri bırakın. </li><li> Manyetik sütun, bağlanan yıkama ve manyetik boncuk etiketli ana hücrelerin elüt edilmesi için üreticinin tavsiye ettiği protokol takip edin. Işaretli hücrelerin artış elde edilmesi için, 2 x 10 9 toplam hücre başına en az bir sütun kullanılır. <ol><li> Onlar akışını engellemek gibi, sütunları yüklerken oluşabilecek kabarcıklarını çıkarın. Çıkarın ve bir online protokolü modifiye boncuklar (arasında sıkışma hücreleri önlemek için yıkamalar arasında ayırıcı üzerinde sütun yerine <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf). </li><li> Arzu edildiği takdirde, ana hücreler tarafından üretilen genç hücrelerin analiz bağlanabilen ve yıkama aşamaları arasından akar kaydedin. Adım 4.7 açıklandığı gibi hücrelerin konsantre. </li><li> Bir seferde birden fazla örnekleri işlemek için çoklu-sütun ayırıcılar kullanın. Aynı toplama tüpünün içine aynı numunenin birden çok sütun elute kullanma süresinin azaltılması ve hücre kaybını azaltmak için. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile elüt ana hücreler konsantre edilir. Aspire 1 ama tüm 10 8 orijinal biyotin-etiketli hücre başına tampon ml. Vortex kısaca tampon kalan hücreleri askıya. </li><li> Bir kısım hücreler seyreltin ve hücre yoğunluğu ve bir hemositometre kullanılarak hücre canlılığı, tripan mavisi belirlemek için boyanmayan (adım 3.5). Geri kazanılan toplam hücre sayısını hesaplayın. <ol><li> Hücrelerin sayısı beklenenden önemli ölçüde daha yüksek olması durumunda, genç hücreler kirlenmesine bertaraf edilmesini denemek için bir sütunu içinden elüsyon örnek geçmektedir.Hücrelerin sayısı beklenenden önemli ölçüde daha düşük olması halinde, ana hücrelerin verimini iyileştirmek için diğer bir kolon boyunca numune boyunca kaydedilen akış geçmektedir. </li></ol></li><li> Alternatif bölümleri 5 ve 6&#39;da tarif edildiği gibi olmadan yine kendi replikatif yaş (adım 3.7) artırmak ve boncuk etiketlenmesi ve (adım 4.1-4.8.1) sıralayarak takip YPD çorbasının hücrelerin büyümesi, daha fazla analiz için hücreleri kullanarak biyotin etiketleme tekrarlamanız gerekir. </li></ol> Replika Çağı 5. Belirlenmesi <ol><li> Bu bölümde yer alan tüm adımlar için oda sıcaklığında 5000 x g&#39;de 2 dakika boyunca hücreler dönerler. 1.5 ml santrifüj tüpüne elde edilen hücreler (~ 10 8 hücre / ml) 25 ul koyun ve PBS 1x 1 ml ile iki kez yıkayın. Süpernatant aspire. <ol><li> WGA-konjugat bir kısım çözülme, girdap mix ve protein agrega ortadan kaldırmak için kısaca dönmeye. Th yüzeyinde tomurcuk izleri etiketlemek için PBS 1x 180 ul ve bir fluoresan moleküle konjuge WGA 20 ul süspanseE hücreleri. Folyo ile 1.5 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü Kapak ve yumuşak bir 30 dakika boyunca 30 ° C&#39;de çalkalanarak inkübe edin. </li><li> 1 mi 1X PBS ile üç kez yıkayın. </li></ol></li><li> Floresan mikroskopi, etiket slaytlar ve bir anti-solmaya ajanı kullanılarak standart protokol başına monte edin. Tamamen görüntüleme sırasında hücre hareketi önlemek için coverslip sızdırmazlık önce karanlıkta (birkaç güne kadar) slaytlar tedavi. Hücre yaşı temsili bir ölçümünün elde edilmesi için, numune başına en az 50 hücrelerinde tomurcuk yara sayısı. Yukarı gerekirse, tomurcuk izleri görüntüleme için aylık 1 için Mağaza slaytlar. <ol><li> Alternatif olarak, aşama 5.1.2 sonra PBS 1x 1 ml suspensiyon halindeki hücreler üzerinde akış sitometresi gerçekleştirerek, WGA-birleşikten flüoresan sinyal yoğunluğunu belirler. WGA-Alexa 488. için 505 nm uzun geçiş filtresi ile 405 nm uyarma lazer ve 530/30 nm emisyon filtresi kullanın, her toplama noktası için bir boyanmamış denetimi ekleyin. </li></ol></li><li> Üzerinde mikroskopisiyle sayılır genç hücrelerde ve yaşlanmış hücrelerde grafikte tomurcuk izlerix-ekseni üzerinde aynı hücre popülasyonlarından WGA-konjügat floresans normalize geometrik ortalama karşı Y ekseni (geometrik ortalama lekeli / boyasız geometrik ortalama). Bu ilişki için doğrusal bir eğilim çizgisinin denklemi edinin. Takip eden deneyler için, denklemde x için bir hücre popülasyonunun WGA-konjügat floresan yoğunluğunun normalize geometrik ortalama ile değiştirin ve bir numunenin ortalama hücre yaşını belirlemek için y çözer. </li></ol> 6. Mutasyon Frekans <ol><li> Adım 2.1.1 anlatıldığı gibi yayılmış YPD orta ve seçici bir ortam üzerine adım 4,7 tampon içinde yeniden süspanse anne hücreleri sıralanır. 1 dakika boyunca 5.000 xg&#39;de seçici orta ve spin hücreleri için yeniden süspanse ana hücrelerinde 1 ml kullanın. NOT: hücreler büyük toplumlarda cansız ve yaşlanmış hücreler artan sayıda telafi etmek için yaş arttıkça YPD ortamında üzerine seyreltilmiş hücrelerin daha büyük hacimli yayıldı. <ol><li> YPD orta ve seçici orta inkübesırasıyla, 3 ve 4 gün boyunca 30 ° C &#39;de 6.1 dur. Çok eski hücreler veya yavaş büyüyen suşlar için bir hafta inkübasyon süresi bitti artırın. Adım 2.2 açıklandığı gibi mutasyon sıklığı hesaplayın. </li></ol></li></ol> 7. Verilen Replikatif Çağ için Öngörülen Mutasyon Frekansı Hesaplanması <ol><li> İlgili sıralama için kriteri ana hücrelerin ortalama yaş başlangıç ​​hücre popülasyonunun ortalama yaşı çıkarılarak deney boyunca biyotin etiketli hücrelerin replikatif yaş ortalama artışa hesaplayın. Adım 5.2 hesaplanan hücre yaşlarını kullanın ya 5.2.2 adım. </li><li> Adım 7.1 hesaplanan ortalama hücre yaş artışı adım 2.1.3 elde mutasyon oranını çarpın. İlgili Replikatif yaş hücreler için öngörülen mutasyon sıklığını belirlemek adım 2.2 hesaplanan ilk nüfus için temel mutasyon sıklığı için bu değeri ekleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability,+cancer+and+aging.">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).</li><li>Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+DNA+replication+and+recombination+activities+in+the+maintenance+of+genome+stability.">Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability.</a> J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).</li><li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metab. 16, 18-31 (2012).</li><li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer.">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li><li>Madia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11, 599-606 (2012).</li><li>McMurray, M. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-induced+switch+to+a+hyper-recombinational+state.">An age-induced switch to a hyper-recombinational state.</a> Science. 301, 1908-1911 (2003).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5&amp;#34;-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5&amp;#34;-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).</li><li>Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAN1+locus+of+Saccharomyces+cerevisiae:+fine-structure+analysis+and+forward+mutation+rates.">The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates.</a> Genetics. 91, 35-51 (1979).</li><li>Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother+enrichment+program:+a+genetic+system+for+facile+replicative+life+span+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 183, 413-422 (2009).</li><li>Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+age+induces+mitotic+recombination+in+the+ribosomal+RNA+gene+cluster+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).</li><li>Feser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+histone+expression+promotes+life+span+extension.">Elevated histone expression promotes life span extension.</a> Mol Cell. 39, 724-735 (2010).</li><li>Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+circuit+for+selectively+arresting+daughter+cells+to+create+aging+populations.">A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).</li><li>Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+transcriptional+silencing+causes+sterility+in+old+mother+cells+of+S.+cerevisiae.">Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae.</a> Cell. 84, 633-642 (1996).</li><li>Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+reactive+oxygen+species+begin+early+during+replicative+aging+of+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).</li><li>Dang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+lysine+16+acetylation+regulates+cellular+lifespan.">Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.</a> Nature. 459, 802-807 (2009).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14, 115-132 (1998).</li><li>Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+is+associated+with+genome+instability+during+chronological+aging.">Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).</li><li>Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+analysis+CalculatOR:+a+web+tool+for+the+determination+of+mutation+rate+using+Luria-Delbruck+fluctuation+analysis.">Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis.</a> Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+estimator+of+mutation+rates.">A robust estimator of mutation rates.</a> Mutat Res. 661, 101-109 (2009).</li><li>Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+inheritance+of+oxidatively+damaged+proteins+during+cytokinesis.">Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.</a> Science. 299, 1751-1753 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, kaynak için birden çok yöntem ve verimli bir şekilde bir araya mitotik hücre yaşlanmada genom istikrarsızlık çalışma uygulanacak olan S. cerevisiae, Saccharomyces model sistemi kullanılabilir yaklaşımlar. Deneylerinin çok çeşitli fenotipik seçim ile genom istikrarsızlık farklı formları ölçmek için mutasyonlar ya da kromozom yeniden düzenleme biçimlerine birikimi mümkün yaşa özel değişiklikleri incelemek için manyetik sıralama ile birleştirilebilir. Bütün-genom dizileme yaklaşımlar yaş ile bir genom içinde meydana gelen değişikliklerin genel türleri hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir ederken, mutasyon hızı ölçümleri elde etmek için fenotipik seçim sistemlerini kullanmak ve tercihen genetik değişikliklerin belirli türleri izole etmek yeteneği mekanik eğitimi için önemli avantajları yaşlanma ile ilgili genom istikrarsızlık yönleri. Hücre yaş belirlenmesi ve potansiyelini düzene physiologi paralel ölçümler yapmak içinakışı ile cal değişiklikler sitometri belirli yaş aralıklarında sırasında diğer hücresel değişiklikler ile genom istikrarsızlık korelasyon etkili bir yoldur. Biriken mutasyonlar oranlarında potansiyel yaşa bağlı değişikliklerin belirlenmesi için gereken: 1) dikkatli genç hücre popülasyonlarında oranlarının belirlenmesi, hücre yaş 2) doğru belirlenmesi, ve 3) güvenilir bir şekilde ölçmek için yeniden üretilebilir ana hücrelerin yeterince büyük popülasyonlarının zenginleştirilmesi için yeteneği Yaşlılıkta genom istikrarsızlık. Bu yaklaşım, maya model sistem oranları ve / veya mitotik aktivite gösteren hücrelerde genom istikrarsızlık frekanslarında yaşa bağlı değişikliklerden sorumlu altında yatan mekanizmaların tanımlanması katkıda bulunmaya olanak sağlamaktadır. Ayrıca, genetik ve çevresel etkenler hızla yaşa bağımlı genom istikrarsızlık katkıları için değerlendirilebilir. Sonuçta, bu karakterizasyonlar mutasyonlar Replikatif yaşlanma sırasında birikir hangi şekilde hesap modellerinin gelişmesine neden olabilir. Bu yöntem, bu tür olayların oranını ölçmek için seçilebilir fenotip görünümüyle mutasyonları ya da genom istikrarsızlık diğer tür tespit etme yeteneğine bağlıdır. Ancak, deney tasarımı yaratıcılık genom istikrarsızlık birçok yönleri incelenecek izin verebilir. Örneğin, URA3 genlerinin ve CAN1 sonuçlarına genomik konumu hakkında herhangi bir etkilerini test etmek için farklı bir genomik bölgelere yerleştirilmiş olabilir. Fonksiyonel gen allelleri özgü işlevsel olmayan gen allel Reversiyon belirli mutasyon süreçleri test edebilir. Aynı zamanda, bir gen ya da tekrar sıraları ile bir gen eteklenen çoklu aktif olmayan allel giriş sırasıyla restorasyon ya da gen fonksiyon kaybı ile rekombinasyon olayları incelemek için kullanılabilir. Dalgalanma testleri bu çeşitli genom istikrarsızlık olayları 9 oranlarını belirlemek için standart yaklaşım vardır. Protokol muta belirlemek için iyi kabul ve nispeten basit Lea-Coulson medyan tahmincisi kullanılarak yazılıryon oranı MSS-maksimum olabilirlik tahmin yöntemi mutasyon oranları 9 belirlemek için en iyi yaklaşım olarak kabul edilir olsa da, farklı araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek için. MSS-maksimum olabilirlik tahmincisi önce detaylı 9 gözden geçirilmiştir ve alternatif bir yöntem olarak kullanılabilir, ancak daha sofistike hesaplamalar gerektirir. Alternatif olarak, bu yöntem ile mutasyon oranlarını hesaplamak için ücretsiz yazılım 22 elde edilmiştir. Mutasyon oranları tekrarlanabilir tedbirleri alması, yeterli suret kültürleri kullanılarak yeterince düşük başlangıç ​​hücre yoğunluklarında kültürleri aşılamak dahil deneysel tasarım, birkaç yönlerine dikkat gerektirdiğini 10.000 kat veya daha fazla, ve seçilmesinin uygun kültür hacimleri ile nüfus büyüklüğü artar tüm böylece hücre popülasyonları seçici ortam üzerine yayılır. İkinci nokta için, daha önce tarif edilen formül kültür teste fraksiyonuna dayanan mutasyon oranını ayarlamak için kullanılabilend 9. Kültürlerin büyüme oranında varyasyon tekrarlanabilir bir mutasyon oranı belirlenmesi ve son zamanlarda 23 tarif edilmiştir böyle durumlarda daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar doğurabilir değiştirilmiş medyan tabanlı tahmincisi karmaşık hale getirebilir. Doğru hücre yaşı ölçmek için yeteneği eski hücrelerin genomu dengesizlik nedeniyle genç hücrelere Frekanslar olayların oranı beklenen değerlerle farklı olup olmadığı kurulması için önemli olan diğer bir faktördür. WGA farklı floresan moleküllerine konjuge kullanılabilir beri, arka plan ve esneklik açısından hem de beyaz lekeleme Kalkofluor kıyasla tercih edilir olarak WGA, lekeleme bulduk. Bu esneklik floresan reaktif ile diğer hücre özelliklerinin ölçümleri için daha fazla fırsat sağlayabilir. Ilk iş sonra daha fazla yol açabilir sinyal WGA boyama için yoğunluğu ve hücrelerin tomurcuk izleri tekabül sayısı arasında bir ilişki kurmak içinakış sitometrisi yoluyla hücre yaşı hızlı belirlenmesi. Bu yaklaşım, aynı zamanda, tipik olarak ölçümlerin daha iyi bir reprodüksiyon için mikroskopla incelenmiş göre daha büyük nüfus büyüklüklerinin kullanımına izin vermektedir. Tüm yaş tayinleri hücrelerin mikroskobik muayene ile yapılabilir olabilir iken, biz yaklaşımı sitometri akış yaşa bağlı genom istikrarsızlık etkileyen faktörlerin hızlı tarama kolaylaştırır hissediyorum. Güvenilir bir hücre yaşı ölçülmesine ek olarak, değerlendirme ana hücre büyümesi ve hücre sıralama her bir ardışık yuvarlak geçmesi için izin verilen hücre bölünmesini sayısına dikkat etmek gerekmektedir. Hücreleri istenen hücre yoğunluğu ulaşmadan önce daha fazla hücre bölünmesi geçmesi olanak sağlayan bir küçük başlangıç ​​popülasyon boyutu ya da daha büyük bir kültür hacminin kullanın. Örneğin, diğer araştırmacılar daha az experime eski hücrelerini elde bariz bir avantaja sahiptir çok eski maya hücreleri 16, elde etmek için sıralama sadece iki mermi kullanmışntal adım. Hücreler sıralama öncesinde daha fazla hücre bölünmeleri tamamlamak için izin kültür hacmini artırmak olmadığını düşünürken, aklında tek bir sütunda işlenebilir hücrelerinin toplam sayısı sınırı tutmak. Bir hücre popülasyonu sıralamak için birden çok sütun kullanılmasını gerektirebilen daha büyük bir kültür hacminin kullanın. Hücre çeşitleri / toplama noktaları arasındaki hücre bölünmesinin az mermi geçmesi Ayrıca, eğer, daha sonra ömrü boyunca farklı zaman noktalarında beklenen mutasyon frekansları sapmaları gözlemlemek için daha fazla fırsat vardır. Örneğin, ömrü boyunca sadece erken örnekleme ve geç zaman noktalarında veri mutasyon sıklığı sürekli bir artış gösteren, ama çabuk ve daha sonra yaylalar bu mutasyon sıklığı artar gösterebilir ömrü boyunca ek ara zamanlarda örnekleme üretebilir. Bu protokol yaşlı anne hücreleri izolatları Ancak, yaşla birlikte mutasyon oranlarındaki değişimlerin daha doğrudan bir ölçümünü elde etmek için bir fırsat var. Dalgalanma testleri olabilir be mutasyon oranı, genç hücreler kullanılarak elde edilen orandan farklı olup olmadığını belirlemek için farklı yaşlarda annesi hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi. Büyüdükçe bu dalgalanmaları deney kültürleri yaşlı ve genç hücrelerin bir karışımı olacak olsa da, genç hücreler ile başlanarak elde oranlarından herhangi bir sapma eski bir başlangıç ​​popülasyonunun kullanımı ile bağlanabilir. Tekrarlanabilir doğru genom istikrarsızlık ölçmek için yaşlı anne hücreleri yeterince büyük bir nüfus elde etmek için yeteneği, bu yaklaşımın başarısı için kritik öneme sahiptir. Protokol, bu amaç için özel bir manyetik ayırma sisteminin kullanımını tarif etmekle beraber, başka gruplar da alternatif sistemler 14,18 (Malzeme Tabloya bakınız) maya hücreleri ana kriteri var. Üreticilerin bazı protokoller optimizasyon gerekli olabilir ama böyle bir alternatif sistemleri de, bu yöntem ile çalışması gerekir. Ne olursa olsun kullanılan özel sistem, nüfus büyüklüğü gerektirirÇalışma için seçilen bir mutasyon ya da genom yeniden düzenleme tipinin frekansına bağlı olarak d farklıdır. En azından, yeterli ana hücreler, mutasyon frekansı hesaplamak için kişi başına en azından bir mutant koloni elde etmek için olmalıdır. Sadece sıfır ila beş koloni, mutant nüfusta ve popülasyon boyutu daha küçük bir artış beklenmektedir eğer 5-10 mutan koloniler tahmin edilen, büyük ölçüde tekrarlanabilirliği artırabilir böylece uygulamada, sonuçlar oldukça değişken olabilir. Biotin bir başlangıç ​​nüfusu etiketleme, her tür için kurtarma verimlilik yaşındaki annesi hücrelerde mutasyon frekansını ölçmek için gerekli uygun nüfus büyüklüğü belirlemenize yardımcı olmak için dikkate alınması gerekiyor. Her sıralama sonra ana hücrelerinde% 90 iyileşme ile, orijinal nüfusun sadece% 59 büyüme ve sıralama beş tur sonra kurtarıldı olacaktır. Bu ~% 33 büyüme beş turdan sonra asıl nüfusun geri kazanımı ve etiketli anne hücrelerin sadece% 80&#39;i geri eğer sıralama düşerHer çeşit sırasında ed. Nüfus büyüklüğü iki üç kat azalma kolayca nüfus başına mutant kolonilerin güvenilmez numaraları neden olabilir, çünkü düşük frekanslı olayları ölçerken Ölçme ve kurtarma maksimize önemlidir. Genişletilmesi veya mitotik hücre yaşlanma sırasında genom istikrarsızlık daha geniş bir anlayış elde etmek için bu protokolü değiştirerek için çok sayıda seçenek vardır. Basit örnekler gen fonksiyonlarının, ortam değişiklikleri veya diğer çevresel durumu değişiklikleri değişiklikler yaşla birlikte mutasyonların birikimi nasıl değiştirdiğini analiz içerir. Değiştirilmiş gen fonksiyonu ile veya uygun durumda, genç hücreler için Mutasyon oranı ölçülmüş ve kontrol hücre popülasyonlarında daha farklı hızı değerleri ile tahmin ve daha farklı mutasyonların birikmesine olup olmadığını belirlemek için kullanılacaktır. Replikatif yaşlanma sırasında farklı noktalarda Hücre popülasyonları, reaktif oksijen türleri veya DNA hasar verme ajanları gibi özel baskı uygulayıcılar maruz olabilir. Biroksidatif strese geçici ve hafif maruziyet esasen hücre sıralama (Şekil 3) gerçekleştirme yeteneğini değiştirmek değil, ama sert gerilmeler hücrelerin iyileşmesini komplike edebilir. Ön deneyler anne hücreleri hala belirli stresleri sonra bir şekilde geri doğrulamak için gerekli olacaktır. Ayrıca, izole anne hücrelerinin hücresel özellikleri 3 yaşlanma ile ilişkili reaktif oksijen türlerinin, mitokondriyal ve vakuolar morfolojisi ve diğer fizyolojik özelliklerinin düzeyleri dahil olmak üzere, ayrıntılı olarak analiz edilebilir. Ayrıca ana hücreleri bir tedavi ya da bir işlem için bir başlangıç ​​popülasyonu olabilir. Anne ve kızı hücreleri fiziksel işlem sırasında ayrılır yana, kızı hücreleri yine de analiz için mevcuttur. Örneğin, çocuk hücrelere veya maya anne ve ikincil hücreler arasında hasarlı makro moleküllerin asimetrik miras fizyolojik değişiklikleri <s&gt; 24 mutasyon frekansları / oranlarında herhangi bir ilginç değişiklikler zamanlamasına göre olabilir kadar. Kızı hücre popülasyonlarının mutasyon frekansları da Replikatif yaşlanma sırasında mutasyonların asimetrik miras olup olmadığını modellemek için denemek için elde edilebilir. Özet olarak, dalgalanma testleri ile manyetik hücre sıralama yoluyla ana hücrelerin zenginleştirilmesi birleştiren S. avantajlarını mümkün kılmaktadır cerevisiae model sistem verimli mitotik hücre yaşlanma sırasında genetik değişikliklerin birikimi sorumlu mekanizmaların araştırılması için uygulanacak.

Bu tür maya Saccharomyces cerevisiae gibi mikroorganizmalar, mutasyon hızı incelemek için mükemmel bir model olan, ancak tam olarak bu modeller, hücrelerin mitotik yaşlanma sırasında mutasyonların birikimine araştırmak için kullanılan edilmemiştir. Nükleer genomu içerisinde, mutasyon birikimi gen fonksiyonlarının 1 (veya varyasyonun) ilerleyen kaybıyla sonuçlanan yaşlanma katkıda sürülmüştür. Büyük ölçüde çünkü uyduruk genetik sistemlerin bu süreci etkileyen genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi ve mikroorganizmalar nadir fenotipik değişiklikleri nicel kolaylığı hızlandırabilir yaşlanma sırasında mekanizmaları ve mutasyon birikimi sonuçlarını incelemek için bir mikrobiyal sistemi kullanmak için yeteneği. DNA onarım faktörler ve DNA hasar cevabı proteinler de farklı türlerin 2 boyunca korunduğu, ve organizma yaşlanma temel benzerlikler S. gibi çeşitli organizmaların tespit edilmiştir cerevisiae birmuhtemelen bu hale d memeliler 3, maya çalışmalardan elde edilen sonuçlar, birçok organizmada yaşlanma ile ilgili olacaktır. S. yaşlanma Çalışmaları cerevisiae kronolojik yaşlanma veya hücre kopyelenebilir yaşlanmasını ölçen iki yaşlanma modelleri faydalanmak. Kronolojik yaşlanma nedeniyle besin tüketme 3&#39;e bölünmeyen durumu (sabit faz) olan maya hücre popülasyonlarında canlılığının ilerleyen kaybıyla karakterize edilir. Kronolojik yaşlanma modeli, büyük hücre popülasyonları kolayca mutant hücrelerin fenotipik seçim yapmak için bu modelde elde edildiğinden mutasyonlar, yaş arttıkça 4 birikir olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu durumda, mutasyon birikimi büyüme sinyal yolları ve oksidatif stres 5 tarafından etkilenmiş gibi görünüyor, ve bu faktörlerin her biri çok hücreli ökaryotlarda 3 yaşlanma anlaşılması için uygun olduğu. Replikatif yaşlanma modeli kullanan asimetrik DiViSiS. ile ilgili ardışık hücre nesiller 3 ile oluşur yaşlanmayı araştıran cerevisiae anne ve kızı hücreler. Maya Replikatif yaşlanma sık microfluidic cihazlar 6,7 maya hücreleri küçük popülasyonlar video mikroskobu ile anne ve kızı hücreleri, ya da daha yakın zamanda, küçük popülasyonlarının mikromanipülasyon ile ölçülmüştür. Sınırlı popülasyon boyutları tam genom bilgileri tek hücre elde edilen ya da çok yüksek frekanslı genetik değişiklikler 8 ölçülür sürece mitotik yaşlanmada mutasyon birikimi araştırılması için, bu yaklaşımlar kötü uygun hale gelir. Tek tek hücrelerin tam genom sekanslama gibi sahalarda mutasyon birikimi araştırmak için büyük ölçüde veri setleri sağlar, ancak fenotipik seçim sistemleri, altta yatan mutasyonun birikimi incelemek için mutasyon oranlarını ölçmek için bir araç sağlayan büyük avantajlara sahiptir. Çalışmalar haploi fenotipik seçimleri yoluyla mutasyon frekansları ve oranlarını incelemek içinReplikatif yaşlanma sırasında d maya suşları henüz rapor edilmemiştir. Mutasyon oranları yaygın dalgalanma testleri 9 kullanılarak ölçülür. Mutasyon frekans değerleri bir popülasyonda bir gen sekansı içerisinde bir mutasyon taşıyan hücrelerin toplam sayısını yansıtmaktadır. Bu bağımsız mutasyonların meydana geleceği hücreler ve sadece önceden mevcut olan mutasyonları taşıyan bu hücrelerin herhangi bir soyunu kapsar. Bunun aksine, dalgalanma testleri vasıtasıyla ölçülen bir mutasyon oranı, yeni nesil her bir hücre ile ortaya çıkan mutasyonlar bağımsız sayısını temsil eder. Bu testler tipik olarak, bir hedef dizisi daha önceden var olan mutasyonlar ile hücrelerin ilave yakın doyması kültürlerinin yetiştirilmesine ve seçici ortam üzerinde büyüme mutant hücreler tanımlama olasılığını azaltmak için, düşük hücre yoğunluklarında kültür aşılamak çok tekrarlanan içerir. Suret popülasyonunda tespit mutant hücrelerin sayısı daha sonra i sayısını tahmin etmek için çeşitli matematiksel modeller biri kullanılırbüyüme 9 sırasında ortaya ndependent mutasyonlar. Ortalama nüfus büyüklüğü bağımsız mutasyonların sayısını karşılaştırarak mutasyon oranı bir ölçü sağlar. S., Bu genlerin kaybı fonksiyon-mutasyonlar seçilebilir fenotiplerini üretmek beri cerevisiae, mutasyon frekansları ve oranları sık sık, URA3 ve CAN1 genleri kullanarak ölçülür. URA3 tarafından kodlanan protein molekülü toksik 10 içine 5-FOA dönüştürür yana bir URA3 fonksiyon kaybı, 5-fluoroorotik asit (5-FOA) dirençli hücre oluşturur. CAN1 şifrelediği protein, hücrelere 11 içine arginin ve kanavanin taşıma yana CAN1 fonksiyon kaybı, hücreler canavanine, toksik bir arginin analogunun dirençli olmayı sağlar. Hem genetik hem de fiziksel sıralama stratejileri başarıyla S. geniş popülasyonları elde etmek için istihdam edilmiştir cerevisiae anne hücreleri Replikatif yaşlanma soruşturmaları kolaylaştırmak için. Genetik stratejileri bir popülasyonda kızı hücre hayatta karşı seçim zeki yaklaşımları içermektedir. Annesi zenginleştirme programı (MEP) loxp siteleri 12 içerecek şekilde tasarlanmıştır edilen iki temel genlerin kızı özgü bozulmasına yol açan, sadece kız hücrelerde Cre yeniden ifade beta-östradiol indüklenmesini içerir. MEP suşlar, uyarıcının yokluğunda normal olarak yetiştirilebilir, ancak anne kız hücreler hücreler, hücre siklüsü boyunca 12 ilk ilerlemesi sırasında tipik olarak, M-fazında tutuklama olurken, indüksiyonundan sonra bölünmeye devam edecektir. Bu sistem, genel olarak yaşlanma sırasında mutasyon birikimi incelemek için kullanılmış olsa da, bu yaşlanma ana hücrelerinde 13,14 heterozigosite kaybı, diploit maya suşlarında genom istikrarsızlık nispeten sık bir formu, hem de biyokimyasal değişiklikler incelemek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, kızı-deşarj sistemi S. kızı özgü ifadesini içerir cereviSIAE URA3 geninin 15. 5-FOA hangi URA3 ifade noktası yavru hücre ölür, ortamına ilave edilene kadar ana hücreler 15 büyümeye devam eder kızı-deşarj suşları, normal büyümeyi sürdürmüştür. Bu ana hücreler için kullanışlı ettirecek sistemleri, ancak seçim sistemi oluşturan gen fonksiyonlarının korunması bağlıdır. Seçim sistemi bir ya da daha çok bileşen olarak rastgele mutasyonların seçimi kaçış ve katlanarak çoğalmasına kız hücrelerde neden olabilir. MEP suşların gelişimi sırasında, uygun nüfus büyüklükleri seçimi 12 kaçış olabilir mutant kızı hücrelerin görünümünü önlemek için kararlı idi. Ancak, nüfus büyüklüğü bu sınır Replikatif yaşlanma sırasında genom istikrarsızlık nadir formları algılama ödün. Nüfus büyüklüğüne Bu kısıtlama kısmen her genin iki kopyası çünkü çoğu, seçim sistemi katkıda diploid maya suşları kullanılarak üstesinden gelinebilirmutasyonlar büyük olasılıkla 12 çekinik olacaktır. Bununla birlikte, Diploid suşların kullanımı kolay uygulanabilen, haploit maya hücrelerinde tespit edilebilir kıyasla tespit edilebilir mutasyon olayları türlerini kısıtlar. Fiziksel sıralama stratejileri ana hücrelerinde büyük nüfuslu zenginleştirmek için etiketsiz kızı hücrelerden etiketli bir hücre yüzeyi ile anne hücrelerin izolasyonu bulunmaktadır. S. hücre yüzeyi proteinleri olduğu şeklindeki gözlem, (hücre duvarı) cerevisiae kızı hücreler yeni onlar 16 üretmek kızı hücrelerin etiketlenmesi olmadan anne hücreleri etiketlemek için istismar edilmiştir tomurcuklanma sırasında sentezlenir. Örneğin, biyotin ile etiketlenmiş yüzey üzerinde maya hücrelerinin bir ilk popülasyon yetiştirilebilir ve daha sonra, başlangıç ​​popülasyonu tarafından üretilen yavru hücre yüzeyinde biyotin içermez, çünkü 16 sıralama, anti-biyotin ve manyetik mikro-boncuklar kullanılarak kız hücrelerde izole . Seri büyüme veayırma ana hücrelerin giderek daha büyük popülasyonları elde edilmiş ve analiz edilmesini sağlar. Bu prosedür maya 13,14,17,18 kopyelenebilir yaşlanma sırasında hücre fizyolojisi ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Mevcut yöntem, potansiyel olarak nadir mutasyonlar veya fenotipik tahlil seçimleri arasında genom istikrarsızlık diğer formları birikiminin ölçülmesi amacı ile ana hücreleri zenginleştirmek üzere bu biotin ile etiketlenmesinde ve manyetik ayırma tekniği uyarlar. Seri büyüme ve fiziksel ayrıştırma giderek daha büyük hücrelerinde de mutasyon birikimi analizi, hem de kendi kızı hücre popülasyonu sağlar. Nesil başına mutasyon oranlarının belirlenmesi öngörülen mutasyon frekans hücre bölünmeleri belli bir sayıda uğramıştır anne hücreleri için hesaplanacak izin verir. Tahmin frekans değerleri nedeniyle gözlenen Mutati hücre bölünmesinin ek mermi, önemli sapmalar beklenen artış dayalı olduğundantahmin edilen değerlerle karşılaştırıldığında frekanslar üzerinde biriken değişim oranından yaşa özel değişiklikler kanıtlarıdır. Bu protokolü kullanarak, akış sitometri analizi ile birleştiğinde anne hücreleri üzerinde hücre bölünmeleri sitelerine karşılık tomurcuk izleri floresan boyama hızla sıralı ve sıralanmamış nüfusun yaş dağılımını belirlemek için kullanılabilir. Bu tür reaktif oksijen türlerini tespit etmek için kullanılanlar gibi floresan ilave reaktifler, aynı zamanda Bu protokol uygulamasında kullanılabilir. Genel olarak, bu protokol yaşlanma ile ilgili genom istikrarsızlık etkileyen genetik ve çevresel faktörleri araştırmak için uygun bir model organizma yaşa bağlı hücre fizyolojik değişikliklere korelasyon potansiyeli ile genom istikrarsızlık yaşa bağlı değişikliklerin etkili analiz sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:359px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:359px;">100mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Biotin Microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td style="width:359px;">2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS LS columns</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:359px;">25 columns suitable for QuadroMACS separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuadroMACS separator</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td style="width:359px;">Separator Only</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">QuadroMACS Starting Kit</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-051</td>
			<td style="width:359px;">Includes:&#160; QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD Falcon Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:359px;">40 &#181;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes.&#160; 50 per pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td style="width:359px;">Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">W11261</td>
			<td style="width:359px;">Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae mekanizmaları ve genom istikrarsızlık sonuçlarını incelemek için mükemmel bir model sistem olmuştur. DNA onarımı ve DNA tamir faktörler tam olarak çeşitli türlerin boyunca korunduğu için, bu maya modelden elde edilen bilgiler, insanlar dahil olmak üzere bir çok organizmada, ile ilgilidir. Bununla birlikte S. cerevisiae henüz tam olmadığını yaş artan Replikatif (mitoz) ile mutasyonlar değişiklikleri biriken oranı teknik zorlamalar nedeniyle hitap kullanılan olmamıştır. Örneğin, mikromanipülasyon yoluyla maya Replikatif ömrü ölçümleri nadir mutasyonları tespit yasaklayan hücrelerinin çok küçük nüfus kapsayabilir. Kızı hücrelerinin ölümünü uyararak toplumlarda anne hücreleri zenginleştirmek üzere genetik yöntemler geliştirilmiştir, ancak nüfus büyüklükleri yine seçim sistemleri tehlikeye rastgele mutasyonların meydana geldiği ile frekansı ile sınırlıdır. Geçerli protokol manyetik Sorti yararlanıryüzey-etiketli maya anne hücreleri ng fenotipik seçimleri arasında nadir mutasyonları ölçmek için anne hücreleri yaşlanma yeterince büyük popülasyonları elde etmek. Dalgalanması testleri ile ölçülen mutasyon oranları, ve mutasyon frekansları ilk genç hücreler için kurulan ve çeşitli Replikatif yaş annesi hücrelerinde mutasyonların sıklığını tahmin etmek için kullanılır. Mutasyon frekanslar sıralanmış bir ana hücreler için belirlenir, ve ana hücrelerin yaş hücre bölünmesi esnasında, hücre yüzeyleri üzerinde oluşturulan tomurcuk izleri tespit eden bir flüoresan tepkime maddesi, ile boyama ile akış sitometrisi kullanılarak belirlenir. Deneysel olarak, belirli bir replikatif yaş ana hücrelerde gözlemlenen frekanslara hücre bölünmesini sayısına göre tahmin mutasyon frekansın karşılaştırılması daha sonra biriken değişim oranından yaşa bağlı değişiklik olup olmadığını belirleyebilir. Bu temel protokolün Varyasyonları özgü gen işlevlerinde değişikliklerin etkisini araştırmak için araçları sağlamak veyamutasyon birikimi belirli çevresel koşullar Replikatif yaşlanma sırasında mekanizmalar yatan genom istikrarsızlığı gidermek için.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.c

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır.

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.4K Görüntüleme.  Rensselaer Polytechnic Institute.  Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır. 

Video: Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).