وأيد هذا العمل في جزء من منحة R00AG031911 من المعهد الوطني للشيخوخة التابع لمعاهد الصحة الوطنية لحركة صحة الشعوب محتويات هذا المقال لا تعكس بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

<ol>
	<li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability,+cancer+and+aging.">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).</li><li>Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+DNA+replication+and+recombination+activities+in+the+maintenance+of+genome+stability.">Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability.</a> J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).</li><li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metab. 16, 18-31 (2012).</li><li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer.">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li><li>Madia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11, 599-606 (2012).</li><li>McMurray, M. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-induced+switch+to+a+hyper-recombinational+state.">An age-induced switch to a hyper-recombinational state.</a> Science. 301, 1908-1911 (2003).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).</li><li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5&amp;#34;-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast:+5-fluoro-orotic+acid+resistance.">A positive selection for mutants lacking orotidine-5&amp;#34;-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).</li><li>Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CAN1+locus+of+Saccharomyces+cerevisiae:+fine-structure+analysis+and+forward+mutation+rates.">The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates.</a> Genetics. 91, 35-51 (1979).</li><li>Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother+enrichment+program:+a+genetic+system+for+facile+replicative+life+span+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 183, 413-422 (2009).</li><li>Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+age+induces+mitotic+recombination+in+the+ribosomal+RNA+gene+cluster+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).</li><li>Feser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+histone+expression+promotes+life+span+extension.">Elevated histone expression promotes life span extension.</a> Mol Cell. 39, 724-735 (2010).</li><li>Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+circuit+for+selectively+arresting+daughter+cells+to+create+aging+populations.">A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).</li><li>Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+transcriptional+silencing+causes+sterility+in+old+mother+cells+of+S.+cerevisiae.">Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae.</a> Cell. 84, 633-642 (1996).</li><li>Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+reactive+oxygen+species+begin+early+during+replicative+aging+of+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).</li><li>Dang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+lysine+16+acetylation+regulates+cellular+lifespan.">Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.</a> Nature. 459, 802-807 (2009).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14, 115-132 (1998).</li><li>Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+is+associated+with+genome+instability+during+chronological+aging.">Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).</li><li>Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+analysis+CalculatOR:+a+web+tool+for+the+determination+of+mutation+rate+using+Luria-Delbruck+fluctuation+analysis.">Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis.</a> Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+estimator+of+mutation+rates.">A robust estimator of mutation rates.</a> Mutat Res. 661, 101-109 (2009).</li><li>Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+inheritance+of+oxidatively+damaged+proteins+during+cytokinesis.">Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.</a> Science. 299, 1751-1753 (2003).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هذا البروتوكول يجمع بين أساليب متعددة لتمكين الموارد والنهج تتوفر في خميرة الخباز نظام نموذجي ليتم تطبيقها بكفاءة لدراسة الجينوم عدم الاستقرار خلال شيخوخة الخلايا الإنقسامية. مجموعة واسعة من فحوصات لقياس أشكال مختلفة من عدم استقرار الجينوم من خلال اختيار المظهرية يمكن الجمع بين الفرز المغناطيسي لدراسة التغيرات في سن معينة ممكنة في تراكم أشكال معينة من الطفرات أو إعادة ترتيب الكروموسومات. بينما نهج كامل الجينوم التسلسل يمكن أن توفر مزيد من المعلومات حول أنواع الشاملة للتغيرات التي تحدث في الجينوم مع التقدم في العمر، والقدرة على استخدام النظم اختيار المظهرية للحصول على قياسات معدل الطفرات وعزل تفضيلي أنواع معينة من التغيرات الجينية من المزايا الهامة لدراسة الآلية جوانب المتعلقة بالشيخوخة الجينوم عدم الاستقرار. تبسيط تحديد عمر الخلية والقدرة على جعل قياسات موازية من physiologiالتغييرات كال من خلال توفير تدفق الخلوي سيلة فعالة لربط الجينوم عدم الاستقرار مع التغيرات الخلوية الأخرى خلال نطاقات عمرية محددة. تحديد التغييرات التي تعتمد على سن المحتملة في معدلات الطفرات تتراكم يتطلب: 1) تحديد دقيق لمعدلات السكان في خلية الصغار، 2) تحديد دقيق لعمر الخلية، و3) القدرة على تخصيب موثوق أعداد كبيرة بما فيه الكفاية للخلايا الأم لقياس بتكاثر عدم استقرار الجينوم في سن الشيخوخة. هذا النهج يسمح للنظام نموذجي الخميرة للمساهمة في تحديد الآليات الكامنة المسؤولة عن التغيرات التي تعتمد على سن في معدلات و / أو الترددات من عدم استقرار الجينوم في الخلايا النشطة ميتوتيكلي. وعلاوة على ذلك، والعوامل الوراثية والبيئية يمكن تقييم سريع للمساهمات التي تعتمد على سن الجينوم عدم الاستقرار. في نهاية المطاف، يمكن لهذه الأوصاف تؤدي إلى تطوير النماذج التي تمثل الطريقة التي الطفرات تتراكم خلال الشيخوخة تنسخي. يعتمد هذا الأسلوب على القدرة على الكشف عن الطفرات أو أنواع أخرى من عدم الاستقرار الجينوم من خلال ظهور الظواهر اختيار لقياس معدلات مثل هذه الأحداث. ومع ذلك، يمكن الإبداع في تصميم فحص تسمح العديد من جوانب عدم الاستقرار الجينوم للتحقيق معهم. على سبيل المثال، يمكن وضع URA3 والجينات CAN1 في مواقع الجينومية مختلفة لاختبار أي تأثيرات موقع الجيني على النتائج. الارتداد من الأليلات محددة الجين غير وظيفية لالأليلات الجينات الوظيفية اختبارا خاصة عمليات طفرية. أيضا، يمكن استخدام إدخال الأليلات الخاملة متعددة من الجين أو الجينات المرافقة مع تكرار تسلسل الأحداث لدراسة إعادة التركيب من خلال استعادة أو فقدان وظيفة الجين، على التوالي. اختبارات تذبذب هي نهج موحد لتحديد معدلات مختلف هذه الأحداث عدم استقرار الجينوم 9. هو مكتوب بروتوكول باستخدام ليا-كولسون مقدر متوسط ​​قبلت جيدا واضحة نسبيا لتحديد مؤتةمعدل نشوئها لجعلها في متناول الباحثين متنوعة، على الرغم من MSS-الحد الأقصى لطريقة احتمال مقدر يعتبر أفضل طريقة لتحديد معدلات الطفرة 9. تم استعراض MSS-الحد الأقصى لاحتمال مقدر سابقا بالتفصيل 9، ويمكن استخدامها كطريقة بديلة، ولكن يتطلب حسابات أكثر تعقيدا. بدلا من ذلك، أحرز البرمجيات الحرة لحساب معدلات الطفرات مع هذا الأسلوب متاح 22. الحصول على تدابير استنساخه من معدلات الطفرة يتطلب الانتباه إلى عدة جوانب التصميم التجريبي، بما في ذلك استخدام الثقافات تكرار كافية، بتلقيح الثقافات في كثافة منخفضة بما فيه الكفاية الخلية الأولية التي يزداد حجم السكان حسب الكميات المناسبة ثقافة 10،000 أضعاف أو أكثر، واختيار بحيث كامل يمكن أن ينتشر السكان من الخلايا على المتوسطة انتقائية. لهذه النقطة الأخيرة، وهي صيغة سبق وصفها يمكن استخدامها لضبط معدل الطفرات على أساس جزء من الثقافة بصدد إجراء تجاربد 9. التباين في معدل نمو الثقافات يمكن تعقيد تحديد معدل الطفرات استنساخه، وتعديل مقدر القائم على الوسطية التي قد تسفر عن نتائج أكثر استنساخه في مثل هذه الحالات وصفت مؤخرا 23. القدرة على قياس بدقة عمر الخلية هي عامل آخر مهم لتحديد ما إذا ترددات عدم الاستقرار في جينوم الخلايا القديمة تختلف عن القيم المتوقعة بسبب معدل الأحداث في الخلايا الشابة. لقد وجدنا WGA تلطيخ لتكون أفضل من تلطيخ calcofluor الأبيض، سواء من حيث الخلفية والمرونة، منذ WGA متاحة مترافق لجزيئات الفلورسنت مختلفة. يمكن هذه المرونة توفر المزيد من الفرص للقياسات في وقت واحد من خصائص الخلايا الأخرى مع الكواشف الفلورسنت. العمل الأولي لإقامة علاقة بين كثافة إشارة لتلطيخ WGA وعدد المقابلة من ندوب برعم على خلايا يمكن بعد ذلك أن يؤدي إلى المزيدتقرير سريع من العمر الخلية من خلال التدفق الخلوي. هذا النهج يسمح أيضا استخدام أحجام أكبر من السكان سيتم فحصها بواسطة المجهر عادة لتحسين استنساخ القياسات. بينما يمكن إجراء جميع القرارات العمر من خلال الفحص المجهري للخلايا، ونحن نشعر أن التدفق الخلوي نهج يسهل الكشف السريع للعوامل التي تؤثر تعتمد على سن الجينوم عدم الاستقرار. بالإضافة إلى قياس عمر الخلايا بشكل موثوق، يحتاج إلى النظر إلى عدد من انقسامات الخلية يسمح خلايا الأم إلى الخضوع مع كل جولة متتالية من النمو وفرز الخلايا. استخدام لحجم السكان الأولي أصغر أو أكبر حجم الثقافة يمكن أن تسمح للخلايا للخضوع لمزيد من انقسامات الخلية قبل الوصول إلى كثافة الخلية المطلوبة. على سبيل المثال، استخدم باحثون آخرون جولتين فقط من فرز للحصول على خلايا الخميرة قديمة جدا 16، والتي لديها ميزة واضحة للحصول على الخلايا القديمة مع عدد أقل من experimeخطوات ntal. عند النظر في ما إذا كانت زيادة حجم الثقافة للسماح للخلايا لاستكمال المزيد من انقسامات الخلية قبل الفرز، ونأخذ في الاعتبار الحد على العدد الكلي للخلايا التي يمكن معالجتها في عمود واحد. استخدام وحدة تخزين الثقافة أكبر قد يتطلب استخدام أعمدة متعددة لفرز السكان خلية واحدة. أيضا، إذا الخلايا تخضع لجولات أقل من انقسام الخلايا بين نقاط أنواع / جمع، ثم هناك المزيد من الفرص لمراقبة الانحرافات عن الترددات الطفرة المتوقعة في نقاط زمنية متميزة خلال العمر. على سبيل المثال، وأخذ العينات فقط في وقت مبكر ونقاط الوقت خلال أواخر العمر قد تنتج البيانات مما يشير إلى زيادة مطردة في وتيرة الطفرة، ولكن أخذ العينات في أوقات مستقطعة إضافية خلال عمر قد تبين أن زيادة تواتر الطفرات بسرعة ثم الهضاب. ومع ذلك، لأن هذا البروتوكول يعزل خلايا الأم القديمة، هناك فرصة للحصول على قياس أكثر مباشرة التغيرات في معدلات الطفرات مع تقدم العمر. اختبارات تذبذب يمكن بالبريد أجريت باستخدام الخلايا الأم من مختلف الأعمار لتحديد ما إذا كان معدل التحور سوف تختلف عن معدل الحصول عليها باستخدام الخلايا الشابة. في حين أن الثقافات لهذه الاختبارات تذبذب سيصبح خليط من الخلايا القديمة والشابة لأنها تنمو، ويمكن أن يعزى أي انحرافات عن المعدلات التي تم الحصول عليها بدءا من خلايا شابة لاستخدام السكان انطلاق السن. القدرة على الحصول على بتكاثر عدد كبير من السكان ما يكفي من خلايا الأم الذين تتراوح أعمارهم بين لقياس بدقة الجينوم عدم الاستقرار أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا النهج. بينما يصف بروتوكول استخدام نظام الفرز المغناطيسي معين لهذا الغرض، وفرز المجموعات الأخرى خلايا الخميرة الأم مع أنظمة بديلة 14،18 (انظر جدول المواد). وينبغي لهذه النظم البديلة أيضا العمل مع هذه الطريقة، على الرغم من بعض التحسين من البروتوكولات الصانعين قد تكون مطلوبة. بغض النظر عن نظام معين المستخدمة، وحجم السكان تتطلبد تختلف تبعا للتردد من نوع الطفرات أو إعادة ترتيب الجينوم المختارة للدراسة. على الأقل، يجب أن يكون هناك ما يكفي من خلايا الأم للحصول على مستعمرة متحولة واحد على الأقل لكل السكان لحساب تردد الطفرة. في الواقع، يمكن أن تكون النتائج مختلفة تماما إذا كان من المتوقع من حجم السكان، وحتى زيادة صغيرة في حجم السكان فقط صفر إلى خمسة المستعمرات متحولة، بحيث 09:55 المستعمرات متحولة من المتوقع، يمكن أن تحسن كثيرا التكاثر. عندما البيوتين وصفها السكان بدءا، وكفاءة الانتعاش لكل نوع بحاجة إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار للمساعدة في تحديد حجم السكان المناسب ضروري لقياس تردد طفرة في الخلايا الأم القديمة. مع استعادة 90٪ من الخلايا الأم بعد كل نوع، سيتم استرداد 59٪ فقط من السكان الأصلي بعد خمس جولات من النمو والفرز. تنخفض هذه النسبة إلى 33٪ ~ التعافي من السكان الأصلي بعد خمس جولات من النمو والفرز إذا فقط 80٪ من خلايا الأم وصفت واستردادإد خلال كل نوع. قياس وتعظيم الانتعاش أمر بالغ الأهمية عند قياس الأحداث التردد المنخفض، منذ 2-3 أضعاف الانخفاض في حجم السكان يمكن أن يؤدي بسهولة إلى أرقام يمكن الاعتماد عليها من المستعمرات متحولة في السكان. هناك العديد من الخيارات لتوسيع أو تعديل هذا البروتوكول للحصول على فهم أوسع من عدم الاستقرار خلال الجينوم شيخوخة الخلايا الإنقسامية. وتشمل أمثلة بسيطة تحليل كيفية إحداث تغييرات في وظائف الجينات، التغيرات وسائل الإعلام، أو غيرها من التغييرات البيئية تغير حالة تراكم الطفرات مع تقدم العمر. سيتم قياس معدلات الطفرات للخلايا الشابة مع وظيفة الجينات المتغيرة أو في حالة ملائمة واستخدامها لتحديد ما إذا كانت الطفرات تتراكم بشكل مختلف من المتوقع في قيم معدل ومختلف عن السكان في خلية السيطرة. يمكن أن يتعرض السكان الخلية في نقاط مختلفة خلال الشيخوخة تنسخي لضغوطات معينة، مثل أنواع الاكسجين التفاعلية أو وكلاء ضررا DNA. ولم تعرض عابرة وخفيفة الى الاكسدة لا يغير كثيرا من القدرة على أداء الخلية الفرز (الشكل 3)، ولكن أقسى الضغوط قد تعقد الانتعاش من الخلايا. أن التجارب الأولية تكون ضرورية للتحقق من أن خلايا الأم ما زالت قائمة يمكن استردادها بكفاءة بعد ضغوط معينة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل الخصائص الخلوية للخلايا الأم المعزولة في التفاصيل، بما في ذلك مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية، مورفولوجيا الميتوكوندريا وفجوي، والخصائص الفسيولوجية الأخرى التي ترتبط مع الشيخوخة 3. وعلاوة على ذلك، يمكن للخلايا الأم أن يكون السكان بدءا لمزيد من العلاج أو التلاعب. منذ يتم فصل الخلايا الأم وابنتها جسديا أثناء الإجراء، والخلايا الوليدة لا تزال متاحة أيضا للتحليل. على سبيل المثال، التغيرات في الخصائص الفسيولوجية للخلايا ابنة الميراث أو غير المتماثلة من الجزيئات التالفة بين الأم الخميرة والخلايا الوليدة <sحتى يمكن مقارنة&gt; 24 إلى توقيت أي تغييرات مثيرة للاهتمام في طفرة الترددات / أسعار الفائدة. كما يمكن الحصول على ترددات تحور للسكان الخلية ابنته في محاولة لنمذجة ما إذا كان هناك وراثة غير المتماثلة من الطفرات أثناء الشيخوخة تنسخي. وخلاصة القول، والجمع بين تخصيب الخلايا الأم من خلال الخلايا المغناطيسية الفرز مع اختبارات تذبذب يتيح مزايا S. نظام نموذجي الخباز ليتم تطبيقها بكفاءة في التحقيق الآليات المسؤولة عن تراكم التغيرات الجينية خلال شيخوخة الخلايا الإنقسامية.

الكائنات الدقيقة مثل الخميرة خميرة الخباز، هي نماذج ممتازة للتحقيق معدلات الطفرة، ولكن هذه النماذج لم استخداما كاملا لتحقيق تراكم الطفرات أثناء الشيخوخة الإنقسامية من الخلايا. وقد افترض تراكم الطفرات في الجينوم النووي للمساهمة في الشيخوخة قبل مما أدى إلى فقدان التدريجي لل(أو التباين في) وظائف الجينات 1. القدرة على استخدام نظام الميكروبي لدراسة الآليات والنتائج المترتبة على تراكم الطفرة خلال الشيخوخة يمكن أن تسرع إلى حد كبير تحديد العوامل الوراثية والبيئية التي تؤثر على هذه العملية، لأن النظم الوراثية السطحية وسهولة قياس التغيرات المظهرية نادرة في الكائنات الحية الدقيقة. عوامل إصلاح الحمض النووي والبروتينات استجابة الحمض النووي من التلف والحفاظ عليها جيدا عبر الأنواع المتنوعة 2، وتم تحديد أوجه التشابه الأساسية في الشيخوخة عضوي للكائنات متنوعة مثل S. الخباز ود 3 الثدييات، مما يجعل من المرجح أن النتائج التي تم الحصول عليها من دراسات في الخميرة سوف تكون ذات صلة الشيخوخة في العديد من الكائنات الحية. دراسات الشيخوخة في S. الخباز الاستفادة من نموذجين الشيخوخة التي تقيس الشيخوخة الزمني أو الشيخوخة تنسخي من الخلايا. وتتميز الشيخوخة الزمني من الفقدان التدريجي للبقاء السكان في خلية الخميرة التي هي في حالة (الطور الثابت) غير تقسيم بسبب نضوب المغذيات 3. وقد استخدم نموذج الشيخوخة الزمني لإثبات أن الطفرات تتراكم مع زيادة العمر 4، حيث يتم الحصول عليها السكان الخلية بسهولة كبيرة في هذا النموذج لإجراء التحديدات المظهرية للخلايا متحولة. في هذه الحالة، يظهر تراكم الطفرات أن تتأثر مسارات، مما يشير إلى النمو والاكسدة 5، ولكل من هذه العوامل هو ذات الصلة لفهم الشيخوخة في حقيقيات النوى المتعددة الخلايا 3. نموذج الشيخوخة تكاثري يستغل divisi غير المتماثلةعلى بين S. خلايا الأم وابنتها الخباز عن التحقيق الشيخوخة الذي يحدث مع الأجيال المتعاقبة خلية 3. وكثيرا ما تقاس الخميرة الشيخوخة تنسخي من خلال المجهرية للسكان صغير من الخلايا الأم وابنتها، أو أكثر في الآونة الأخيرة، من خلال المجهر الفيديو من السكان صغيرة من خلايا الخميرة في أجهزة ميكروفلويديك 6،7. أحجام السكان محدودة تجعل هذه الأساليب ملاءمة سيئة للتحقيق تراكم الطفرة خلال الشيخوخة الإنقسامية ما لم يتم الحصول على المعلومات كامل الجينوم من الخلايا واحد أو يتم قياس التغيرات الجينية ذات تردد عال جدا 8. كامل الجينوم تسلسل الخلايا واحد يوفر مجموعات البيانات الكبيرة للتحقيق تراكم الطفرات، ولكن النظم اختيار المظهرية لديها ميزة هامة لتوفير وسيلة لقياس معدلات الطفرات لدراسة آليات تراكم الطفرات الكامنة. دراسات لدراسة الترددات طفرة ومعدلات من خلال التحديدات المظهرية في haploiحتى الآن لم يتم الإبلاغ عن سلالات الخميرة د أثناء الشيخوخة تنسخي. يتم قياس معدلات الطفرات عادة باستخدام اختبارات تذبذب 9. قيم تردد طفرة تعكس العدد الكلي للخلايا إيواء طفرة في تسلسل الجينات في عدد السكان. وهذا يشمل الخلايا التي تحدث طفرات مستقلة وأي ذرية من تلك الخلايا أن مجرد وراثة الطفرات الموجودة مسبقا. في المقابل، ومعدلات الطفرة من خلال اختبارات قياس تذبذب تمثل عدد من الطفرات المستقلة التي تنشأ حديثا مع كل جيل الخلية. تشمل هذه الاختبارات عادة بتلقيح العديد من الثقافات تكرار بكثافة خلية منخفضة للحد من احتمالات مضيفا مع خلايا موجودة مسبقا الطفرات في تسلسل الهدف، وتزايد الثقافات إلى تشبع القريب، وتحديد خلايا متحولة من النمو في المتوسط ​​انتقائية. ثم يتم استخدام أعداد خلايا متحولة المحددة في تكرار السكان في واحد من عدة نماذج رياضية لتقدير عدد طndependent الطفرات التي نشأت أثناء نمو 9. مقارنة عدد من الطفرات مستقلة لمتوسط ​​حجم السكان يوفر مقياسا لمعدل الطفرات. في S. الخباز، كثيرا ما تقاس الترددات طفرة ومعدلات استخدام URA3 وCAN1 الجينات، منذ الخسارة من وظيفة الطفرات في هذه الجينات تنتج الظواهر اختيار. فقدان وظيفة URA3 يجعل خلايا مقاومة لل5 fluoroorotic حمض (5 FOA)، لأن البروتين المشفرة بواسطة URA3 تحويل 5 FOA في جزيء السامة 10. فقدان وظيفة خلايا CAN1 يسمح لتصبح مقاومة للcanavanine، وهو أرجينين التناظرية السامة، لأن البروتين المشفرة بواسطة CAN1 ينقل أرجينين وcanavanine إلى خلايا 11. وقد استخدمت كل من استراتيجيات الفرز الوراثية والبدنية بنجاح للحصول على السكان أكبر من S. خلايا خميرة الأم لتسهيل التحقيقات الشيخوخة تنسخي. وتشمل الاستراتيجيات الوراثية النهج ذكية حدد ضد بقاء الخلية ابنة في عدد السكان. برنامج تخصيب الأم (MEP) ينطوي بيتا استراديول تحريض لجنة المساواة العرقية recombinase التعبير فقط في الخلايا الوليدة، مما أدى إلى تعطل ابنة محددة من اثنين من الجينات الضرورية التي تم هندستها لاحتواء المواقع loxP 12. يمكن زراعة سلالات MEP عادة في غياب محفز، ولكن سوف تستمر الخلايا الأم فقط لتقسيم التالية الاستقراء، في حين أن الخلايا ابنة سوف القبض على M-المرحلة عادة في أول تطور من خلال دورة الخلية 12. في حين أن هذا النظام لم يستخدم على نطاق واسع لدراسة تراكم الطفرة خلال الشيخوخة، قد تم استخدامها لدراسة فقدان تغاير الزيجوت، وهو شكل متكرر نسبيا من عدم الاستقرار في الجينوم سلالات الخميرة مضاعفا، فضلا عن التغيرات البيوكيميائية في الخلايا الأم الشيخوخة 13،14. وبالمثل، فإن النظام ابنة صواعق ينطوي التعبير ابنة محددة من S. cereviSIAE URA3 الجين 15. سلالات ابنة صواعق تنمو بشكل طبيعي حتى يتم اضافة 5-FOA إلى المتوسطة، في الخلايا الوليدة التي تعبر عن نقطة URA3 سوف يموت، بينما تستمر الخلايا الأم في النمو 15. هذه النظم مفيدة لإثراء للخلايا الأم، لكنها تعتمد على الحفاظ على وظائف الجينات التي تشكل نظام اختيار. الطفرات العشوائية في واحد أو أكثر من مكونات نظام اختيار يمكن أن يؤدي إلى الخلايا الوليدة التي تفلت اختيار وتتكاثر باطراد. خلال تطوير سلالات الهندسة الكهربائية والميكانيكية، وكانت أحجام السكان المناسبة مصممة على تجنب ظهور الخلايا الوليدة الطافرة التي يمكن الهروب من اختيار 12. ومع ذلك، هذا الحد في حجم السكان التنازلات الكشف عن أشكال نادرة من عدم استقرار الجينوم أثناء الشيخوخة تنسخي. هذه قيود على حجم السكان يمكن التغلب جزئيا باستخدام سلالات الخميرة مضاعفا مع نسختين من كل جين تسهم في نظام اختيار، لأن معظمأن الطفرات المتنحية من المرجح أن تكون 12. ومع ذلك، واستخدام سلالات مضاعفا يقيد أنواع الأحداث طفرية التي يمكن الكشف بسهولة مقارنة مع تلك التي يمكن الكشف عنها بسهولة في خلايا الخميرة فرداني. وتشمل استراتيجيات الفرز المادية عزل الخلايا الأم مع سطح الخلية المسمى من خلايا ابنة غير المسماة إلى إثراء للسكان كبير من الخلايا الأم. ملاحظة أن بروتينات سطح الخلية (البروتينات جدار الخلية) من S. وتوليفها الخلايا الوليدة حديثا الخباز خلال مهدها تم استغلالها لتسمية الخلايا الأم دون وصفها الخلايا الوليدة التي ينتجونها 16. على سبيل المثال، السكان الأولي من خلايا الخميرة المسمى على سطحها مع البيوتين يمكن زراعتها ثم عزل من خلايا ابنتهما باستخدام بلي مكافحة البيوتين ومغناطيسية فرز 16 لأن الخلايا الوليدة الناتجة عن السكان الأولي لن يحتوي على البيوتين سطحها . النمو التسلسلي ويسمح الفرز السكان كبار السن تدريجيا الخلايا الأم التي يمكن الحصول عليها وتحليلها. وقد استخدم هذا الإجراء بنجاح لدراسة التغيرات في الخلية وعلم وظائف الأعضاء التعبير الجيني أثناء الشيخوخة تنسخي من الخميرة 13،14،17،18. الطريقة الحالية يتكيف هذا التوسيم البيوتين وتقنية الفرز المغناطيسي لإثراء للخلايا الأم مع غرض قياس تراكم الطفرات يمكن أن تكون نادرة أو عدم استقرار الجينوم أشكال أخرى يعاير من خلال التحديدات المظهرية. النمو التسلسلي والفرز المادي يسمح تحليل تراكم الطفرات في الخلايا الأم تدريجيا القديمة، وكذلك في سكانها خلية ابنة. تحديد معدلات طفرة في الجيل يسمح تردد طفرة المتوقع أن تحسب للخلايا الأم التي خضعت لعدد معين من الانقسامات الخلوية. منذ تستند القيم تردد توقع على الزيادة المتوقعة نتيجة للجولات إضافية من انقسام الخلايا، وانحرافات كبيرة في mutati احظعلى ترددات مقارنة مع القيم المتوقعة تقديم أدلة لإجراء تغييرات في سن معينة في معدل الطفرات تتراكم. باستخدام هذا البروتوكول، وتلطيخ الفلورسنت الندوب برعم التي تتوافق مع مواقع انقسامات الخلية على الخلايا الأم إلى جانب تحليل التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتحديد بسرعة التوزيع العمري للسكان فرزها والتي لم يتم فرزها. ويمكن أيضا الكواشف فلوري إضافية، مثل تلك المستخدمة للكشف عن أنواع الاكسجين التفاعلية، أن تستخدم خلال هذا البروتوكول. عموما، هذا البروتوكول يتيح تحليل الفعال للتغييرات التي تعتمد على العمر في عدم استقرار الجينوم مع احتمال ارتباط إلى خلية التغيرات الفسيولوجية المرتبطة بالسن في كائن نموذج مناسبة تماما لدراسة العوامل الوراثية والبيئية التي تؤثر المتعلقة بالشيخوخة عدم الاستقرار الجينوم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:359px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:359px;">100mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Biotin Microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td style="width:359px;">2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS LS columns</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:359px;">25 columns suitable for QuadroMACS separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuadroMACS separator</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td style="width:359px;">Separator Only</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">QuadroMACS Starting Kit</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-051</td>
			<td style="width:359px;">Includes:&#160; QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD Falcon Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:359px;">40 &#181;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes.&#160; 50 per pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td style="width:359px;">Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">W11261</td>
			<td style="width:359px;">Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

كانت خميرة الخباز نظام نموذجا ممتازا لدراسة آليات وعواقب عدم الاستقرار الجينوم. المعلومات المكتسبة من هذا النموذج الخميرة هي ذات الصلة لكثير من الكائنات الحية، بما فيها الإنسان، منذ إصلاح الحمض النووي والاستجابة الحمض النووي من التلف العوامل يتم حفظها جيدا عبر الأنواع المختلفة. ومع ذلك، S. لم يتم استخدامها لمعالجة الخباز تماما ما إذا كان معدل تراكم الطفرات التغييرات مع زيادة تنسخي (الإنقسامية) سن بسبب القيود التقنية. على سبيل المثال، والقياسات من الخميرة عمر تكاثري خلال المجهرية تشمل السكان صغيرة جدا من الخلايا، التي تحظر الكشف عن الطفرات النادرة. وقد تم تطوير أساليب الوراثية لإثراء للخلايا الأم في السكان عن طريق إحداث موت الخلايا الوليدة، ولكن لا تزال أحجام السكان محدودة بسبب التردد الذي الطفرات العشوائية التي تضر النظم اختيار تحدث. البروتوكول الحالي يستفيد من sorti المغناطيسينانوغرام من خلايا الخميرة الأم المسمى السطح للحصول على عدد كبير من السكان ما يكفي من شيخوخة الخلايا الأم لتحديد الطفرات النادرة من خلال التحديدات المظهرية. وأنشأت معدلات الطفرة، من خلال اختبارات قياس تذبذب، والترددات الطفرة الأولى للخلايا الشابة وتستخدم للتنبؤ وتيرة الطفرات في الخلايا الأم من مختلف الأعمار تنسخي. ثم يتم تحديد الترددات طفرة للخلايا الأم فرزها، ويتم تحديد سن الخلايا الأم باستخدام التدفق الخلوي بواسطة تلطيخ مع كاشف الفلورسنت التي يكشف الندوب برعم شكلت على سطوح الخلايا أثناء انقسام الخلية. يمكن مقارنة الترددات تحور توقع على أساس عدد من انقسامات الخلية إلى ترددات وحظ تجريبيا للخلايا الأم في سن تكاثري معين ثم تحديد ما إذا كانت هناك التغيرات المرتبطة بالعمر في معدل الطفرات تتراكم. أشكال مختلفة من هذا البروتوكول الأساسي توفر وسيلة لدراسة تأثير التغيرات في وظائف جينات معينة أوالظروف البيئية المحددة على تراكم الطفرات آليات لمعالجة عدم الاستقرار الكامن الجينوم أثناء الشيخوخة تنسخي.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.c

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

وتستخدم معدلات الطفرات في خلايا خميرة الخباز الشباب من خلال اختبارات قياس تذبذب التنبؤ الترددات تحور الخلايا الأم من مختلف الأعمار تنسخي. ثم يتم استخدام الفرز المغناطيسي والتدفق الخلوي لقياس الترددات الطفرة الفعلية وعمر الخلايا الأم لتحديد أي انحرافات من الترددات الطفرة المتوقعة.

الجمع بين الفرز المغناطيسي للخلايا الأم والاختبارات تذبذب لتحليل الجينوم عدم الاستقرار خلال الإنقسامية شيخوخة الخلايا في<em&gt; خميرة الخباز</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.4K Views.  Rensselaer Polytechnic Institute.  وتستخدم معدلات الطفرات في خلايا خميرة الخباز الشباب من خلال اختبارات قياس تذبذب التنبؤ الترددات تحور الخلايا الأم من مختلف الأعمار تنسخي. ثم يتم استخدام الفرز المغناطيسي والتدفق الخلوي لقياس الترددات الطفرة الفعلية وعمر الخلايا الأ...

Video: Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

دراسة السن التي تعتمد على عدم الاستقرار الجيني باستخدام س. خميرة يفسبن الزمني النموذجي

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).