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미디어 및 솔루션의 1 준비 <ol><li> 효모 추출물 - 펩톤 - 포도당 (YPD) 표준 프로토콜에 대한 다양한 매체를 이용하여 세포를 성장. 2 % 박토 - 펩톤, 1 % 효모 추출물, YPD 배지 대 2 % 글루코스 용액을 제조하고 고체 매질 (19)에 대해 2 % 박토 - 한천을 추가한다. 살균 압력솥. 특정 성장 조건이나 돌연변이 효모를 테스트하기 위해, 필요한 경우, 다른 매체를 사용합니다. </li><li> canavanine 내성 돌연변이에 대한 선택 60 ㎎ / ℓ의 canavanine (SC-인수 + canavanine)와 아르기닌 부족 고체 합성 완전 배지를 확인합니다. 아르기닌 (강하 믹스)가없는 아미노산, 2 % 글루코스, 0.2 % 완전한 보완 혼합물없이 0.67 % 박토 효모 질소베이스, 및 2 % 박토 한천 19 인 용액을 제조 하였다. 오토 클레이브 및 20 ㎎ / ㎖ 원액에서 canavanine을 추가하는 멋진 전에 19 (4 ° C에 저장, 필터 소독). <ol><li> 5 - 플루오로 오로 산 (5-FOA)를 포함하는 고체 합성 완전 배지를 확인합니다. 500 준비아미노산없이 1.34 % 박토 효모 질소베이스, 4 % 포도당, 0.4 % 완전한 보완 혼합물 및 0.2 % 5-FOA이며 용액을 19 ㎖의 필터 - 멸균. 그 다음, 오토 클레이브 (500) 4 % 박토 한천 용액 ㎖, 차가운 짧게, 그리고 500 ㎖의 필터 - 멸균 양액과 혼합한다. 다른 돌연변이 분석에 대한 적절한 대체 용지를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 비오틴 라벨링, 500ml의 1X 포스페이트 137 mM 염화나트륨, 2.7 mM의 염화칼륨, 10.14 mM의 인산 나트륨, 및 1.77 mM의 인산 칼륨 이염, pH가 함유 완충 식염수 (PBS) 용액 8 스토어 4 ° C를 만들고에 유지 사용하는 동안 얼음. </li><li> 멸균, 초순수에서 새로운 5 밀리미터 비오틴 재고를 확인하십시오. </li><li> , 비오틴 라벨을 해소 1X PBS의 500 ML, 100 mM의 글리신을 확인하십시오. 4 ° C에서 저장하고 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> 사용 된 세포 및 실험 기간의 수에 따라, 1X PBS, 2 mM의 EDTA, 0.5 %를 함유하는 비드 BOVI 표지 버퍼 1-2 L 할NE 혈청 알부민. 필터 소독 및 탈 가스 버퍼입니다. 4 ° C에서 저장하고 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> 세포 생존율 측정에 사용하기위한 RT에서 1X PBS에 0.​​4 %의 트리 판 블루 용액, 필터 소독, 저장을 준비한다. </li><li> 밀 배아 응집소 (WGA) 형광 복합체 나누어지는 작은 볼륨 (~ 100 μL)는 세포 나이를 결정하는 데 사용하기 위해 포장 호일 (또는 불투명)의 microcentrifuge 튜브에서 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol> 돌연변이 속도 및 주파수의 2 결정 <ol><li> 표준 배양 조건에서 성장한 세포 변동 테스트를 이용하여 셀 당 생성 기준선 돌연변이율을 확립한다. 열한 초기 정지상 (~ 10 8 세포 / ㎖)에 1000 ~ 5000 세포 / ml의 초기 밀도에서 1 ㎖의 문화를 복제에 칠을 성장. <ol><li> 2000 및 집락 형성 - 단위 / ㎖를 결정하기 위해 비 선택 배지 (YPD)에 1-4 μl를 확산 각 복제 문화를 들면, 세포 하나를 희석한다. 펠렛 ~ 2400 X에서 세포를 나머지100 ㎕의 물에 마이크로 원심 및 재현 탁에서 1 분 g는 돌연변이를 식별하는 선택적 매체에 전파합니다. 식민지를 계산하기 전에 30 ° C에서 삼일 (세포의 성장 속도에 따라 필요에 따라 배양 시간을 조정)에 대한 번호판을 품어. </li><li> 선택 배지에 수득 된 돌연변이 콜로니 (R)의 수에 기초하여 상기 시험에서 발생한 독립적 돌연변이 (m)의 수를 결정한다. 9 아래의 식 연구에 대한 돌연변이 식민지의 평균 수를 대입하여 m를 찾기 위해 레아 - Coulson 평균 추정을 사용합니다. 수학 식의 좌측 거의 0이 될 때까지 그런 m의 값을 대체. <img alt="식 (1)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg" /></li><li> 돌연변이 비율을 판단하기 위해, 먼저 복제 배양과 부피 평균 콜로니 - 형성 단위 / ㎖를 곱하여 선택 배지 상에 확산 가능한 세포 수의 평균을 계산선택적 매체에 ml의 확산에 문화. 셀 당 생성 돌연변이율을 수득 가능한 세포의 평균 숫자로 본 단계 2.1.2에서 m의 값을 나눈다. </li></ol></li><li> 단계 2.1.3에서 설명 된 바와 같이 개별적으로 시험 각 복제에 선택적 배양 용 매체 상에 확산 가능한 세포의 개수를 계산한다. 돌연변이 빈도를 얻기 위해 선택 배지 상에 확산 가능한 세포의 수에 의해 얻어진 배양 돌연변이 콜로니 (R)의 수를 나눈다. 기준 돌연변이 주파수와 2.1 단계에서 복제 문화에서 개별 돌연변이 주파수의 평균 또는 중간 값을 사용합니다. </li><li> 돌연변이 축적 연령별 변화를 테스트 할 때 필요 돌연변이 빈도의 변화에​​ 라벨링 공정 결과가 고려되어야하는 경우를 결정하기 위해 비오틴 라벨링 세포 (3.2 및 3.4 단계) 전후의 주파수 측정을 수행. </li></ol> 3 비오틴 라벨링 <ol><li> 세인트reak S. cerevisiae의 YPD 매체에 -80 ° C에서 글리세롤에서 1-3 일 동안 30 ° C에서 배양한다. </li><li> 멸균 피펫 팁을 사용하여, 물 보관 1 ㎖ (또는 그 이상)의 연속 판에서 전송 세포를 염두에 행진의 두껍게 성장 부분의 1 ~ 1.5 cm 약 10 8 세포를 줄 것이다. 혈구를 사용하여 정확한 세포 밀도를 결정합니다. </li><li> 변형 (또는 처리 조건) 컬렉션 포인트 당 돌연변이 빈도가 결정되는 또는 선택 배지에 샘플링 당 적어도 5-10 돌연변이 콜로니를 수득하기에 충분한 모집단 크기 당 10 8 세포 레이블 (단계 2.2에서 돌연변이 빈도에 기초하여). 변형 / 조건 별 기준 측정을위한 추가 열 여덟 세포를 포함합니다. </li><li> 제조 업체에서, 5 mM의 비오틴 시약 스톡을 사용 부드럽게 배양 동안 바위를 제외하고 표준 절차에 따라 비오틴 레이블입니다. 모든 원심 분리 단계에 대한 3000 XG에 4 ° C에서 5 분 동안 스핀,이야4 ° C 이상의 온도에서 회전 인스 증가 세포의 손실로 이어질 수 있습니다. 최종 세척 후, 물에 10 8 표지 세포 / ml의 농도로 세포를 일시. </li><li> 트리 판 블루 염색을 이용하여 세포의 생존 능력을 확인합니다. 물 23 μL 및 1X PBS에 0.​​4 % 트리 판 블루의 67 μL와 세포의 10 μl를 희석. 혈구를 사용하여 라이브 (흠) 죽은 (염색) 세포를 득점하기 전에 실온에서 적어도 40 분 동안 품어. </li><li> 게놈 불안정성, 나이 셀 및 기타 관련 특성에 대한베이스 라인 값을 측정한다 (섹션 5, 6 참조, 및 7). </li><li> 삼각 플라스크 (약 5 × 106 세포 / ml) 10 8 세포 당 YPD 배지 20 ㎖에 비오틴 - 표지 된 세포 이동. 10 8 세포 / ml (4-5 셀 세대)의 대략적인 밀도 문화 (들) 20 ° C에서 16 ~ 18 시간 성장하지만, 세포가 정지 단계에 도달 할 수 없습니다. 30 ° C에서 성장을위한 짧은 배양 시간을 사용합니다. 바이오틴 표지 다 유지4 ° C에서 ELL 학생까지 몇 시간 전에 매체에 첨가, 성장기 및 수집의 타이밍을 최적화하기 위해 필요한 경우. </li></ol> 4 구슬 라벨링 및 자기 정렬 <ol><li> 성장기 후, 혈구를 이용하여 세포 밀도를 결정하는 문화의 분취 액을 희석한다. 3,000 X g에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠렛 세포. 상층 액을 붓고. </li><li> 다음, 비드 라벨 ​​버퍼의 30 ㎖에 펠렛을 일시 중단 텍싱 원심 분리 및 4.1 절에서와 같이 상층 액을 주입하여 세포를 씻으십시오. 씻어 반복합니다. </li><li> 완전 소용돌이로 교반하여 10 총 8 개 세포 당 50 ㎕의 비드 라벨 버퍼에 세포를 재현 탁. 혼합하기 위해 잠시 열 여덟 총 세포와 소용돌이 당 2 μL에게 자석 구슬을 추가합니다. 에서 온라인 프로토콜에서 수정 (혼합 주기적으로 반전, 10 분 동안 얼음에 품어 <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/&gt;). </li><li> 비드 라벨 ​​버퍼의 30 ㎖의 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 세포를 재현 탁 아르 단지 때까지 중간 설정에 10 총 8 개 세포 당 0.5 ㎖의 비드 라벨 버퍼와 잠시 소용돌이 펠렛을 추가합니다. 남아있는 세포 덩어리를 제거하기 위해 50 ML 튜브로 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 부어. 필요한 경우, 이전 컬럼에로드 1-2 시간 동안 얼음에 세포를 둡니다. </li><li> 자기 열이 바인딩 세척, 자기 비드 표지 어머니 세포를 용출 제조업체의 권장 프로토콜을 따르십시오. 표지 세포의 증가 복구의 경우, 2 × 10 9 총 세포 당 하나 이상의 열을 사용합니다. <ol><li> 그들은 흐름을 차단하므로, 열을로드 할 때 발생하는 거품을 제거합니다. 제거에 온라인 프로토콜에서 수정 구슬 (사이에 갇혀되는 것을 세포를 방지하기 위해 세척 사이의 구분에 열을 대체 <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf). </li><li> 원하는 경우, 머더 세포에 의해 생성 젊은 세포를 분석하는 바인딩 및 세정 단계에서 흐를 저장한다. 단계 4.7에 설명 된대로 세포를 집중. </li><li> 한 번에 여러 개의 샘플을 처리하기 위해 다중 열 구분 기호를 사용합니다. 같은 포집 관에 동일한 샘플의 용출 여러 열은 처리 시간 감소 및 세포의 손실을 감소시킵니다. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 3,000 XG에서 원심 분리하여 용출 어머니 세포를 집중. 대기음은 1 만 모두 10 8 원래 바이오틴 표지 세포 당 버퍼 ML. 소용돌이가 잠시 버퍼를 남아있는 세포를 일시 중단합니다. </li><li> 세포의 분취 액을 희석하고 셀 밀도 및 혈구를 사용하여 세포 생존율을 결정 트리 판 블루로 염색하고 (단계 3.5 참조). 회수 된 세포의 총 수를 계산한다. <ol><li> 세포의 수는 예상보다 실질적으로 높은 경우, 젊은 세포 오염을 제거하려고하는 다른 칼럼을 통해 용출 샘플을 통과한다.세포의 수는 예상보다 실질적으로 낮은 경우, 머더 세포의 수율을 개선하기 위해 시도하는 또 다른 칼럼을 통해 샘플을 통해 저장된 유동을 전달한다. </li></ol></li><li> 섹션 5 또는 6에 설명 된대로하지 않고, 다시 자신의 증식 및 연령 (단계 3.7)을 증가시키고 비드 표시하고 (단계를 4.1-4.8.1) 정렬하여 수행하는 YPD 배지에서 세포를 성장, 추가 분석을 위해 세포를 사용하여 비오틴 라벨을 반복해야합니다. </li></ol> 증식 및 연령 (5) 결정 <ol><li> 이 섹션의 모든 단계에 대한 RT에서 5,000 XG에서 2 분 동안 세포를 스핀. 1.5 ㎖의 원심 분리 관에 복구 세포 (~ 10 8 세포 / ml) 25 μl를 넣고 PBS 1X 1 ㎖로 두 번 씻는다. 상층 액을 기음. <ol><li> WGA 공역의 나누어지는 해동, 와류 믹스, 단백질 응집체를 제거하기 위해 잠시 회전합니다. 차의 표면에 꽃 봉오리 흉터에 라벨을 PBS 1 배 180 ㎕의 형광 분자에 결합 WGA의 20 μL에서 세포를 일시 중단전자 셀. 호일로 1.5 ㎖의 원심 분리 관을 덮고 부드러운 30 분 동안 30 ° C에서 락을 함께 품어. </li><li> 1 ㎖의 1X PBS로 3 회 세척 할 것. </li></ol></li><li> 형광 현미경, 라벨 슬라이드 들어 안티 퇴색 방지제를 이용 표준 프로토콜 당 마운트. 완전 이미징 동안 세포의 움직임을 방지하기 위해 커버 슬립을 밀봉하기 전에 어둠 속에서 (몇 일까지) 슬라이드를 치료. 셀 시대의 대표적인 측정을 얻기 위해 샘플 당 적어도 50 세포에 꽃 봉오리 흉터를 계산합니다. 최대 필요한 경우, 새싹 흉터를 볼 1개월에 대한 저장 슬라이드. <ol><li> 대안 적으로, 단계 5.1.2 후 PBS 1X 1 ㎖에 현탁 세포를 유세포 분석기를 수행하여 WGA-공액로부터 형광 신호의 강도를 결정. WGA - 알렉사 488에 대한 505 nm의 긴 패스 필터와 405 nm의 여기 레이저와 30분의 530 nm의 방출 필터를 사용하여 각 수거 장소에 대한 흠없는 컨트롤을 포함합니다. </li></ol></li><li> 에 현미경으로 계산 젊은 세포와 세 세포에 대한 그래프 봉오리 흉터x 축에 동일한 세포 집단에서 WGA-공액 형광 정규화 기하 평균에 대하여 y 축 (염색 등비 / 흠 기하 평균). 이 관계에 대한 선형 추세선의 방정식을 구하십시오. 후속 실험에서, 식 X 용 세포 집단의 WGA-공액 형광 강도의 정규화 기하 평균을 대체하여 시료의 평균 기포 나이를 결정하기 위해 Y 해결. </li></ol> 6 돌연변이 주파수 <ol><li> 단계 2.1.1에 설명 된대로 확산은 YPD 매체와 선택적 매체에 단계 4.7에서 완충액 어머니 세포를 분류. 1 분 동안 5,000 XG에서 선택 배지와 스핀 셀에 대한 재현 탁 어머니 세포 1 ㎖를 사용합니다. 참고 : 세포가 나이가 인구에 비 실행 가능하고 노화 세포의 수를 증가를 보상하기 위해 연령 증가로 YPD 매체에 희석 세포의 큰 볼륨을 확산. <ol><li> YPD 배지로부터 선택 배지 플레이트 부화각각 3, 4 일 동안 30 ° C에서 6.1 단계. 아주 오래된 세포 또는 느리게 성장하는 균주 일주에 배양 시간을 위로 늘립니다. 단계 2.2에 설명 된대로 돌연변이 주파수를 계산합니다. </li></ol></li></ol> 7 감안할 때 증식 및 연령에 대한 예측 돌연변이 주파수를 계산 <ol><li> 중요한 정렬을위한 정렬 머더 세포의 평균 연령에서 초기 셀 모집단의 평균 연령을 감산함으로써 실험 과정 위에 비오틴 표지 된 세포의 증식 및 연령의 평균 증가를 계산한다. 단계 5.2에서 계산 된 세포 나이를 사용하거나 5.2.2 단계. </li><li> 단계 7.1에서 계산 된 평균 세포 연령의 증가에 의해 단계 2.1.3에서 얻어진 돌연변이 속도를 곱하십시오. 관련된 세포 증식 및 연령에 대한 예측값 돌연변이 빈도를 결정하는 단계 2.2에서 계산 된 초기 모집단의 기준 변이 주파수에이 값을 추가한다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 자원을 사용하기 위해 여러 가지 방법을 조합하고 효율적으로 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성의 연구에 적용 할 cerevisiae의 모델 시스템에서 사용할 수있는 사카로 접근한다. 분석의 다양한 표현형이 선택을 통해 게놈 불안정성의 다른 형태를 정량화하는 돌연변이 또는 염색체 재 배열의 특정 형태의 축적이 가능 연령별 변화를 연구하기 위해 자기 정렬과 결합 될 수있다. 전체 게놈 시퀀싱 방법은 나이와 게놈에 발생하는 변화의 전체 유형에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있지만, 돌연변이 레이트 측정을 얻기 위해 표현형 선택 시스템을 사용하기 위해 우선적으로 유전 적 변화의 특정 유형을 분리하는 능력은 역학적 연구를위한 중요한 장점은 노화 관련 유전자 불안정성의 측면. 나이 세포의 결정 및 전위 합리화 physiologi 병렬 측정을 수행 할흐름을 통해 학적 변화는 세포 계측법 특정 연령대 동안 다른 세포 변화와 게놈 불안정성의 상관 관계를하는 효율적인 수단을 제공합니다. 축적 돌연변이의 비율의 잠재적 연령에 의존하는 변화의 결정이 필요합니다 1)주의 젊은 세포 인구의 비율의 결정, 세포 연령이) 정확한 결정, 3) 안정적으로 재현성있게 측정 할 수있는 어머니 세포의 충분히 큰 개체군을 풍부하게 할 수있는 능력 노년 게놈 불안정성. 이 접근법은 효​​모 모델 시스템은 요금 및 / 또는 mitotically 활성 세포 게놈 불안정성의 주파수에 의존 연령 변화에 책임 기전을 형성에 기여할 수있다. 또한, 유전 적, 환경 적 요인이 빠르게 연령에 의존 게놈의 불안정성에 공헌 평가 될 수있다. 궁극적으로, 이러한 특성화는 돌연변이가 증식 및 노화 과정에 누적되는 방식을 설명 모델의 개발로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 이러한 사건의 속도를 측정하기 위해 선택 가능 표현형의 모양을 통해 돌연변이 또는 게놈 불안정성의 다른 유형을 검출 할 수있는 능력에 달려있다. 그러나, 분석 설계의 창의성은 게놈 불안정성의 여러 측면을 조사 할 수 있도록 할 수 있습니다. 예를 들어 URA3 및 CAN1 유전자는 게놈 위치 결과에 어떠한 영향을 테스트하기 위해 다른 게놈 위치에 배치 될 수있다. 기능 유전자의 대립 유전자에 특정 비 기능 유전자 대립 형질의 복귀는 특정 돌연변이 프로세스를 테스트 할 수 있습니다. 또한, 유전자 또는 반복 서열을 가진 유전자를 플 랭킹 여러 비활성 대립 유전자의 도입은 각각 복원 또는 유전자 기능의 손실을 통해 재조합 사건을 조사하는데 사용될 수있다. 변동 시험이 다양한 게놈 불안정성 이벤트 (9)의 속도를 결정하기위한 표준 접근법이다. 프로토콜은 무타을 결정하기 위해 잘 받아 들여 비교적 간단 레아 - Coulson 중간 추를 사용하여 작성기 속도는 MSS-최우 추정기 방법 돌연변이율 구를 결정 최상의 접근 간주 되더라도, 다양한 연구에 더 접근 할 수 있도록한다. MSS-최우 추정기는 이전에 상세히 9에서 검토되었으며, 다른 방법으로 사용될 수 있지만,보다 복잡한 계산을 필요로한다. 또한,이 방법으로 돌연변이 비율을 계산하는 무료 소프트웨어는 22 사용할 수있게되었습니다. 돌연변이 비율의 재현 조치를 구하기 충분한 복제 문화를 사용하여 충분히 낮은 초기 세포 밀도에서 문화 접종을 포함하여 실험 설계의 몇 가지 측면에주의를 요구하는 만 배 이상, 선택 적절한 문화 볼륨 인구의 크기가 증가하여 전체 있도록 세포의 인구는 선택 배지에 확산 될 수 있습니다. 후자의 지점에 대해, 앞서 설명한 공식 배양 teste의 분율에 기초한 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 사용될 수있다D 구. 배양의 성장 속도의 변동이 재현 돌연변이율의 판정, 및 최근 23를 설명 하였지만 이러한 상황에서 더욱 재현 가능한 결과를 산출 할 수 개질 중앙값 기반 추정기를 복잡하게 할 수있다. 정확하게 셀 나이를 측정 할 수있는 능력은 오래 세포 게놈 불안정성 주파수 인한 젊은 세포의 이벤트 레이트에 기대 값과 다른 여부를 설정하기위한 또 다른 중요한 인자이다. WGA는 서로 다른 형광 분자 접합 사용할 수 있기 때문에 우리는 배경과 유연성의 측면에서 모두 흰색 염색을 calcofluor하는 것이 바람직 할 WGA 염색을 발견했다. 이러한 유연성은 형광 시약과 다른 세포의 특성을 동시에 측정을 위해 더 많은 기회를 제공 할 수 있습니다. 초기 작업은 더 이어질 수 신호 WGA 염색에 대한 강도 및 세포 봉오리 흉터의 수 사이의 대응 관계를 설정하는유동 세포 계측법을 통해 세포 연령의 신속한 결정. 이 방법은 또한 전형적으로 측정의 재현성 향상을위한 현미경으로 관찰되는 것보다 큰 크기 개체군의 사용을 허용한다. 모든 연령의 결정이 세포의 현미경 검사를 통해 할 수 있지만, 우리는 접근 유동 세포 계측법 연령에 의존 게놈의 불안정성에 영향을 미치는 요인의 신속한 선별을 용이하게 느낀다. 안정적으로 세포 나이를 측정하는 것 외에도, 고려 머더 세포 성장 및 세포의 정렬 각 연속 라운드로 받도록 허용하는 세포의 분할 수에 부여 될 필요가있다. 세포가 원하는 세포 밀도에 도달하기 전에 더 많은 세포 분열을 겪게 할 수있는 작은 초기 인구 크기 또는 더 큰 문화의 볼륨을 사용합니다. 예를 들어, 다른 연구자들은 적은 experime 오래 된 세포를 얻는 명백한 장점을 가지고 아주 오래된 효모 세포 (16)을 얻기 위해 정렬의 두 라운드를 사용했다ntal 단계. 세포를 선별하기 전에 더 많은 세포 분열을 완료 할 수 있도록 배양 부피를 증가 여부를 고려할 때 염두에 단일 열에서 처리 될 수있는 셀들의 총 개수에 대한 제한을 유지한다. 하나의 세포 집단을 정렬하기 위해 여러 컬럼의 사용을 필요로 할 수있는 더 큰 문화의 볼륨을 사용합니다. 세포 종류 / 수집 지점 사이의 세포 분열의 적은 라운드를 받아야하는 경우 또한, 다음의 수명 동안 별개의 시점에서 예상 돌연변이 주파수의 편차를 관찰 할 더 많은 기회가있다. 예를 들어, 수명 동안에 만에 초기 샘플링 늦은 시점은 데이터 돌연변이 빈도가 꾸준히 증가를 나타내는, 그러나 신속하고 고원이 돌연변이 주파수가 증가를 표시 할 수 있습니다 수명 동안 추가 중간 시간에 샘플링을 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이전 머더 세포를 분리하기 때문에, 연령 돌연변이율 변화의 더 직접적인 측정치를 얻을 수있는 기회가있다. 변동 시험은 ㄱ 수E는 돌연변이율이 젊은 세포를 사용하여 얻은 속도 다를 여부를 결정하기 위해 서로 다른 연령의 어머니 세포를 사용하여 수행. 그들이 성장이 변동 시험에 대한 문화가 오래되고 젊은 세포의 혼합물이 될 것입니다 동안, 젊은 세포로 시작 획득 속도에서 어떤 편차는 이전 시작 인구의 사용에 기인 할 수있다. 정확하게 재현 게놈 불안정성을 측정하기 위해 세 머더 셀 충분히 큰 집단을 수득하는 능력은 이러한 접근법의 성공에 매우 중요하다. 프로토콜은 이러한 목적을 위해 특히 자기 정렬 시스템의 사용을 설명하지만, 다른 그룹은 다른 시스템 (14, 18) (자재 도표 참조) 어머니 효모 세포를 분류 하였다. 제조 업체의 일부 프로토콜 최적화가 요구 될 수 있지만 이러한 대안이 시스템은 또한,이 방법으로 작동합니다. 에 관계없이 사용 된 특정 시스템의 인구 크기는 필요연구를 위해 선택된 돌연변이 또는 게놈 재 배열 된 형태의 주파수에 따라 D 다르다. 최소한 충분히 머더 세포 돌연변이 빈도를 계산하는 인구 당 적어도 하나의 돌연변이 콜로니를 얻을​​ 수있을한다. 만 0-5 돌연변이 식민지가 인구 크기 및 인구 규모도 작은 증가를 기대하는 경우 5-10 돌연변이 식민지가 예상되어, 크게 재현성을 향상시킬 수 있도록 실제로, 결과는 매우 변수가 될 수 있습니다. 비오틴 라벨링 인구 시작되면, 각각의 정렬을위한 회수 효율 구 모 세포의 돌연변이 빈도를 측정하기 위해 필요한 적절한 모집단 크기를 식별하기 위해 고려 될 필요가있다. 각 정렬 후 어머니 세포의 90 % 회복, 원래 인구의 59 %는 성장과 정렬의 5 라운드 이후에 복구 할 수있다. 이것은 ~ 33 % 성장의 5 라운드 후 원래 인구의 복구 및 표시 어머니 세포의 80 %를 복구하는 경우 정렬에 떨어각 종류의시 에드. 인구의 크기가 2-3 배 감소가 쉽게 인구 당 돌연변이 식민지의 신뢰할 수없는 번호로 이어질 수 있기 때문에, 저주파 이벤트를 측정 할 때 측정 및 복구를 극대화하는 것이 중요합니다. 에 확대 또는 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성의 폭 넓은 이해를 얻기 위해이 프로토콜을 수정하기위한 수많은 옵션이 있습니다. 간단한 예는 유전자 기능, 미디어 변경, 또는 다른 환경 조건 변화의 변화는 나이와 돌연변이의 축적을 분석하는 방법을 변경하는 등. 변형 된 유전자의 기능 또는 적절한 조건에서 젊은 세포 돌연변이 비율을 측정 및 제어 세포 집단에서 다르게 속도 값에 의해 예측 된 것보다 돌연변이와 다르게 축적 여부를 결정하기 위해 사용될 것이다. 증식 및 노화 동안 다른 지점에서 세포 집단은 반응성 산소 종 또는 DNA 손상 에이전트와 같은 특정 스트레스에 노출 될 수있다.산화 적 스트레스에 노출 과도 중성 실질적 정렬 셀 (도 3)를 수행하는 능력을 변화시키지 않았지만, 가혹한 응력은 세포의 회복을 복잡있다. 예비 실험은 어머니 세포가 여전히 특정 스트레스 후 효율적으로 복구 할 수 있는지 확인하기 위해 필요하다. 또한, 절연 어머니 세포의 세포질 특성 3 노화와 연관되는 활성 산소 종, 미토콘드리아와 액포 형태 및 기타 생리 학적 특성의 수준을 포함하여 상세하게 분석 될 수있다. 또한, 머더 세포 또는 추가 처리 조작 개시 인구 수 있었다. 엄마와 딸 세포가 물리적으로 절차를 수행하는 동안 분리되어 있기 때문에, 딸 세포는 여전히도 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 딸 세포 또는 효모 어머니와 딸 세포 사이 손상 거대 분자의 비대칭 상속의 생리 학적 특성의 변화 <s&gt; (24)는 돌연변이 주파수 / 속도의 흥미로운 변화의 타이밍에 비교 될 수까지. 딸 세포 집단에 대한 돌연변이 빈도도 증식 및 노화 동안 돌연변이 비대칭 상속이 있는지 모델링하려고하기 위해 얻어 질 수있다. 요약하면, 변동 테스트를 정렬 자기 셀을 통해 머더 세포의 농축을 조합하면 S.의 이점을 가능하게 cerevisiae의 모델 시스템은 효율적으로 세포 유사 분열 동안 노화 유전자 변화의 축적에 대한 책임을 조사기구에 적용될 수있다.

이러한 효모 사카로 미세스 세 레비 시아와 같은 미생물, 돌연변이율을 조사하는 우수한 모델이지만,이 모델은 완전히 유사 분열 세포의 노화 동안 돌연변이의 축적을 조사하는 데에 이용되지 않았다. 핵 게놈에서 돌연변이의 축적은 유전자의 기능을 하나 (또는 변형) 진보의 손실이 발생하여 노화에 기여하는 가설이있다. 크게 때문에 손쉬운 유전 시스템이 프로세스에 영향을 미치는 유전 적 및 환경 적 요인들의 식별 및 미생물 희귀 표현형 변화를 정량화의 용이성을 촉진 할 수 노화 동안에 메커니즘과 돌연변이 축적의 영향을 연구하기 위해 미생물 시스템을 사용할 수있는 능력. DNA 수리 인자 및 DNA 손상 반응 단백질이 아니라 다양한 종에 걸쳐 보존되고, 유기체 노화 기본적인 유사성 S. 등 다양한 미생물에 대해 식별 된 cerevisiae의의그것은 가능성이 있음을 만드는 D 포유류 3, 효모의 연구에서 얻은 결과는 많은 생물의 노화와 관련됩니다. S. 노화에 관한 연구 cerevisiae의 연대기 노화 또는 세포의 증식 및 노화를 측정하는이 노화 모델을 사용한다. 연대 기적 노화 영양분 고갈 3 비 분할 상태 (정지상)에 효모 세포 집단의 생존 능력의 점진적인 손실을 특징으로한다. 연대 기적 노화 모델은 큰 세포 집단 쉽게 돌연변이 세포 표현형 선택을 수행하기 위해이 모델에서 획득되기 때문에 돌연변이는, 4 세를 축적 증가 함을 입증하기 위해 사용되었다. 이 경우에, 변이 축적이 성장 신호 전달 경로 및 산화 적 스트레스 (5)에 의해 영향을받을 것처럼, 이들 각 요소는 다세포 진핵 3에서 에이징 이해에 중요한 것이다. 증식 및 노화 모델은 비대칭을 divisi 악용S. 사이에 연속 셀 세대 세 발생 노화를 조사하는 cerevisiae의 어머니와 딸 세포. 효모 증식 및 노화는 종종 마이크로 유체 장치 6,7에서 효모 세포의 작은 인구의 비디오 현미경을 통해 어머니와 딸 세포, 또는 최근의 작은 인구의 미세 조작을 통해 측정되었다. 제한된 인구 크기는 전체 게놈 정보가 하나의 세포로부터 얻을 수있다 또는 매우 높은 주파수 유전자 변화가 팔을 측정하지 않는 한 유사 분열 노화 동안 돌연변이의 축적을 조사하는 이러한 접근 방식은 잘못 적합하다. 단일 셀의 전체 게놈 서열은 돌연변이의 축적을 조사위한 실질적인 데이터 세트를 제공하지만 표현형 선택 시스템 메커니즘보기 기본 돌연변이 축적 공부 돌연변이 비율을 측정하는 수단을 제공하는 중요한 이점을 가지고있다. 연구는 haploi의 표현형의 선택을 통해 돌연변이 주파수와 속도를 검사합니다증식 및 노화 동안 D 효모 균주는 아직보고되지 않았다. 돌연변이율 일반적 변동 시험 구를 사용하여 측정된다. 돌연변이 빈도 값은 인구 유전자 서열의 변이를 형질 세포의 총 수를 반영한​​다. 이것은 독립적 인 돌연변이가 발생하는 세포와 단순히 기존의 돌연변이를 상속 그 세포의 자손이 포함되어 있습니다. 반대로, 변동 테스트를 통해 측정 돌연변이율 새롭게 각 전지 발전 발생할 독립적 돌연변이의 수를 나타낸다. 이러한 시험은 일반적으로, 표적 서열에서 기존의 돌연변이 세포를 첨가 가까운 포화 배양 성장하고, 선택 배지에서의 성장에 의해 돌연변이 세포를 식별 할 가능성을 감소시키기 위해 낮은 세포 밀도에 많은 복제 배양 물을 접종 포함한다. 복제 개체군에서 식별 돌연변이 세포의 숫자는 난의 수를 추정하기 위해 여러 수학적 모델 중 하나를 사용성장 9시 발생 ndependent 돌연변이. 평균 모집단 크기에 독립적 돌연변이의 수를 비교하는 것은 돌연변이율의 측정 값을 제공한다. S.에서 이 유전자의 기능 상실 돌연변이가 선택 표현형을 생산 이후로 미세스 세 레비 시아는 돌연변이 주파수 및 요금 자주 URA3 및 CAN1 유전자를 사용하여 측정한다. URA3에 의해 코드되는 단백질은 독성 분자 (10)에 5-FOA 변환 이후 URA3 기능의 손실, 5 - 플루오로 오로 산 (5-FOA)에 내성 세포를 렌더링합니다. CAN1에 의해 코드되는 단백질은 세포 11에 아르기닌 canavanine를 전송하기 때문에 CAN1의 기능의 손실, 세포 canavanine, 독성 아르기닌 아날로그에 내성이 될 수 있습니다. 모두 유전 적, 물리적 정렬 전략이 성공적으로 S.의 큰 인구를 얻기 위해 사용되었다 cerevisiae의 어머니 세포 증식 및 노화의 조사를 용이하게하기 위해. 유전 전략은 인구의 딸 세포 생존에 선택 영리한 방법을 포함한다. 어머니 농축 프로그램 (MEP)는에 loxP 사이트 (12)를 포함하도록 설계되었습니다 두 가지 중요한 유전자의 딸 고유의 중단으로 이어지는, 외동 딸 세포에 Cre 호텔의 재조합 효소의 발현 베타 - 에스트라 디올 유도를 포함한다. MEP 균주 유도제의 부재 하에서 통상적으로 성장 될 수 있지만, 머더 세포 딸 세포는 세포주기 (12)를 통해 처음으로 진행 중에 통상 M-단계에서 체포 반면, 유도 다음 분할 할 것이다. 이 시스템은 크게 노화 중에 돌연변이 축적을 연구하는 데 사용되지는 않았지만, 이는 노화 머더 셀 13,14에서 이형의 손실 배체 효모 균주의 게놈 불안정성 비교적 빈번한 형태뿐만 아니라 생화학 적 변화를 연구하는 데 사용되어왔다. 마찬가지로, 도터 피뢰기 시스템 S. 딸의 특정 식을 포함 cerevisiae URA3 유전자 15. 5-FOA가되는 URA3을 표현하는 점 딸 세포가 죽을 것이다, 배지에 첨가 될 때까지 어머니 세포가 15 성장을 계속하는 동안 딸 - 피뢰기 균주는 일반적으로 성장한다. 이러한 머더 세포 농축 시스템에 유용하지만, 이들은 선택 시스템을 구성하는 유전자 기능의 유지에 의존한다. 선택 시스템의 하나 이상의 구성 요소의 임의의 돌연변이가 선택 벗어나 지수 딸 세포 증식 될 수있다. MEP 균주의 개발 과정에서, 적절한 크기의 인구가 선택 (12)을 벗어날 수있는 돌연변이 딸 세포의 모양을 회피하기로 결정했다. 그러나, 인구 규모에서이 제한 증식 및 노화 동안 게놈 불안정성의 드문 형태의 탐지를 타협. 인구의 크기에 제한이 부분적으로 각 유전자의 두 카피가 가장 때문에, 선택 시스템에 공헌하여 배체 효모 균주를 사용함으로써 극복 될 수있다돌연변이 가능성이 12 열성이 될 것이다. 그러나 이배체 균주의 사용은 쉽게 쉽게 반수체 효모 세포에서 검출 될 수있는 것에 비해 돌연변이를 검출 할 수 이벤트의 유형을 제한한다. 물리적 정렬 전략 어머니 세포의 큰 인구에 풍부하게 레이블이없는 딸 세포에서 레이블이 세포 표면 어머니 세포의 분리를 포함한다. S.의 세포 표면 단백질이 관찰 (세포벽 단백질) cerevisiae의 딸 세포는 새로 그들은 16을 생산 딸 세포 레이블없이 어머니 세포에 라벨을 악용 한 신진 동안 합성된다. 예를 들어, 비오틴과의 표면에 표지 된 효모 세포의 초기 집단을 성장시킬 수 있고, 그 다음 초기 모집단 생성 딸 세포는 그들의 표면 상에 비오틴을 함유하지 않기 때문에 16 정렬 안티 비오틴 마이크로 비드 및 자석을 사용하여 자신의 딸 세포로부터 분리 . 직렬 성장과정렬 어머니 세포의 점진적 이전 인구가 획득하고 분석 할 수 있습니다. 이 절차는 효모 13,14,17,18의 증식 및 세포 노화시 생리 및 유전자 발현의 변화를 조사하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 현재의 방법은 잠재적으로 희귀 한 형질 변이 또는 선택 사항을 정량 게놈 불안정성의 다른 형태의 축적을 측정 할 목적으로 머더 셀이 풍부 비오틴 라벨링 및 자기 정렬 기술을 적응시킨다. 직렬 성장 및 물리적 정렬 점진적 이전 머더 세포에서 돌연변이 축적 분석뿐만 아니라 자신의 딸 세포 집단을 허용한다. 생성 당 돌연변이 비율의 결정은 예측 된 돌연변이 빈도가 세포 분열의 특정한 번호를받은 머더 셀에 대해 계산 될 수있다. 예측 주파수 값으로 인해 관찰 mutati에서 세포 분열의 추가 라운드, 상당한 편차로 예상 증가를 기반으로하고 있기 때문에예측 값과 비교 주파수에 축적 돌연변이의 비율 연령별 변화에 대한 증거를 제공합니다. 이 프로토콜을 이용하여, 유동 세포 계측법에 의해 분석하여 결합 머더 세포 세포 분열 부위에 대응 봉오리 흉터의 형광 염색을 신속하게 정렬 및 정렬되지 않은 집단의 연령 분포를 결정하는데 사용될 수있다. 이러한 반응성 산소 종을 검출하기 위해 사용되는 것과 같은 추가의 형광 시약은 또한이 프로토콜 동안 이용 될 수있다. 전반적으로,이 프로토콜은 노화 관련 유전자의 불안정성에 영향을 미치는 유전 적, 환경 적 요인을 연구에 적합 모델 생물의 노화와 관련된 세포의 생리적 변화에 대한 상관 관계에 대한 가능성이있는 게놈 불안정성 연령에 따라 변화를 효율적으로 분석 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td></tr><tr><td>MACS LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>25 columns suitable for QuadroMACS separator</td></tr><tr><td>QuadroMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>Separator Only</td></tr><tr><td>QuadroMACS Starting Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td>Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>40 &amp;micro;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td><td>Life Technologies</td><td>W11261</td><td>Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td></tr></tbody></table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

사카로 미세스 세 레비 시아는 메커니즘과 게놈 불안정성의 결과를 검사하는 훌륭한 모델 시스템이었다. DNA 수리 및 DNA 손상 반응 인자가 아니라 다양한 종에 걸쳐 보존되어 있기 때문에이 효모 모델에서 얻은 정보는, 인간을 포함한 많은 미생물에 적합하다. 그러나, S. 미세스 세 레비 시아는 아직 완전히 여부 연령 증가 증식 및 (유사 분열)와 돌연변이 변화를 축적의 속도 기술적 제약으로 해결하는 데 사용되지 않았습니다. 예를 들어, 미세 조작을 통한 효모 증식 및 수명의 측정은 드문 돌연변이 검출을 금지하는 세포의 매우 작은 집단을 포함한다. 딸 세포 사멸을 유도함으로써 인구 머더 세포 농축 유전 방법이 개발되어 왔지만, 인구 크기는 여전히 선택 시스템을 손상 무작위 돌연변이가 발생하는 빈도에 의​​해 제한된다. 현재의 프로토콜은 자기 sorti을 활용표면 표지 효모 어머니 세포의 NG는 표현형 선택을 통해 희귀 돌연변이를 계량하는 어머니 세포 노화의 충분한 인구를 얻었다. 변동 테스트를 통해 측정 돌연변이율, 돌연변이 주파수는 제 젊은 세포 확립과 증식 및 다양한 연령대의 어머니 세포에서 돌연변이의 빈도를 예측하는데 사용된다. 돌연변이 빈도는 정렬 된 머더 셀에 대해 결정되며, 셀의 어머니는 나이 세포 분열 동안 그들의 세포 표면에 형성된 봉오리 흉터를 검출하는 형광 시약으로 염색하여 유세포 사용하여 결정된다. 실험적으로 소정의 증식 및 나이 머더 세포 관찰 주파수로 세포 분열의 수에 기초하여 예측 된 돌연변이 주파수의 비교는 축적 돌연변이 비율에 나이 - 관련 변화가 있는지 여부를 식별 할 수있다. 이 기본 프로토콜의 변형이 특정 유전자 기능의 변화의 영향을 조사하는 수단을 제공하거나돌연변이의 축적에 대한 특정 환경 조건 증식 및 노화 동안 메커니즘에게 기본 게놈 불안정성을 해결합니다.

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Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

변동 테스트를 통해 측정 된 사카로 미세스 세 레비 시아 젊은 세포에서 돌연변이 비율이 상이한 연령의 증식 및 모 세포의 돌연변이 빈도를 예측하는데 사용된다. 자기 정렬 및 유동 세포 계측법은 다음 예측 돌연변이 주파수에서 모든 편차를 식별하기 위해 실제 돌연변이 주파수와 어머니 세포의 나이를 측정하는 데 사용됩니다.

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.5K 조회수.  Rensselaer Polytechnic Institute.  변동 테스트를 통해 측정 된 사카로 미세스 세 레비 시아 젊은 세포에서 돌연변이 비율이 상이한 연령의 증식 및 모 세포의 돌연변이 빈도를 예측하는데 사용된다. 자기 정렬 및 유동 세포 계측법은 다음 예측 돌연변이 주파수에서 모든 편차를 식별하기 위해 실제 돌연변이 주파수와 어머니 세포의 나이를 측정하는 데 사용됩니다. 

비디오: Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

연구

생체공학

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

생물학

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

유전학

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

면역학 및 감염병학

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

발생학

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every eukaryotic genome. This process is an important mechanism for generating diversity between and within organisms1-3. The human genome consists of approximately 40% repetitive sequence of retrotransposon origin, including a variety of LINEs and SINEs4. Exchange events between these repetitive elements can lead to genome rearrangements, including translocations, that can disrupt gene dosage and expression that can result in autoimmune and cardiovascular diseases5, as well as cancer in humans6-9.
Exchange between repetitive elements occurs in a variety of ways. Exchange between sequences that share perfect (or near-perfect) homology occurs by a process called homologous recombination (HR). By contrast, non-homologous end joining (NHEJ) uses little-or-no sequence homology for exchange10,11. The primary purpose of HR, in mitotic cells, is to repair double-strand breaks (DSBs) generated endogenously by aberrant DNA replication and oxidative lesions, or by exposure to ionizing radiation (IR), and other exogenous DNA damaging agents. 
In the assay described here, DSBs are simultaneously created bordering recombination substrates at two different chromosomal loci in diploid cells by a galactose-inducible HO-endonuclease (Figure 1). The repair of the broken chromosomes generates chromosomal translocations by single strand annealing (SSA), a process where homologous sequences adjacent to the chromosome ends are covalently joined subsequent to annealing. One of the substrates, his3-&Delta;3', contains a 3' truncated HIS3 allele and is located on one copy of chromosome XV at the native HIS3 locus. The second substrate, his3-&Delta;5', is located at the LEU2 locus on one copy of chromosome III, and contains a 5' truncated HIS3 allele. Both substrates are flanked by a HO endonuclease recognition site that can be targeted for incision by HO-endonuclease. HO endonuclease recognition sites native to the MAT locus, on both copies of chromosome III, have been deleted in all strains. This prevents interaction between the recombination substrates and other broken chromosome ends from interfering in the assay. The KAN-MX-marked galactose-inducible HO endonuclease expression cassette is inserted at the TRP1 locus on chromosome IV. The substrates share 311 bp or 60 bp of the HIS3 coding sequence that can be used by the HR machinery for repair by SSA. Cells that use these substrates to repair broken chromosomes by HR form an intact HIS3 allele and a tXV::III chromosomal translocation that can be selected for by the ability to grow on medium lacking histidine (Figure 2A). Translocation frequency by HR is calculated by dividing the number of histidine prototrophic colonies that arise on selective medium by the total number of viable cells that arise after plating appropriate dilutions onto non-selective medium (Figure 2B). A variety of DNA repair mutants have been used to study the genetic control of translocation formation by SSA using this system12-14.

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

The HO-stimulated translocation assay monitors single-strand annealing following the creation of DNA double-strand breaks at multiple loci in diploid Saccharomyces cerevisiae. This mechanism may model genome rearrangements in somatic cells of higher eukaryotes following exposure to high doses of ionizing radiation.

HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다

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