מחקר זה נתמך על ידי NIH R00HL102154, ואגודה אמריקנית של הפרס חוקר המטולוגיה לP ג&#39;י.

הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת נורת&#39;ווסטרן מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. .1 הכנת בינוני התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיברונקטין. הוסף 1 מ&quot;ל של מים לבקבוקון אחד של פיברונקטין אדם (1 מ&quot;ג). השאר פתרון למכסת המנוע בתרבית הרקמה ל30 דקות ללא תסיסה. העבר את הנוזל הכולל 50 מ&quot;ל של PBS לעשות ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ובעדינות מערבב היטב. הפוך את פתרון פיברונקטין טרי לפני ציפוי הצלחת (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של מדיום Epo חופשי (בינוני SCF). מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 1. הבינוני יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש, כאשר עשו טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של מדיום המכיל Epo. מערבבים את המרכיבים המפורטים בטבלה 2. הבינוני יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש, כאשר עשו טרי. </li></ol&gt; .2 פלייט מצופה פיברונקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון פיברונקטין 1 מ&quot;ל היטב בכל צלחת 6 היטב (או 0.5 מ&quot;ל היטב בכל צלחת גם 12). השאר את הצלחת במכסת המנוע בתרבית רקמה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את בארות עם מים סטריליים פעמיים ואוויר יבשים הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את הצלחת ולשמור בחדר הקר ב 4 ° C.. </li></ol> .3 טיהור Erythroblasts הכבד העוברי הערה: כבדי העובר שימוש מE13 לE15 מתוזמן עכברים בהריון (C57BL / 6). כבדי E13.5 הם העדיפו למקסם את התשואה של אבות CFU-E. כדי להשיג את העכברים בהריון בעיתוי, זכר בן 6 עד 8 שבועות ונקבות עכברים הושמו בכלוב אחד (בדרך כלל זכר אחד עם נקבות אחד או שתיים). תקעי נרתיק נקבה נבדקו למחרת בבוקר כדי לקבוע אם ההזדווגות הייתה מוצלחת. היום הראשון של הריון היה היום אחרי התקע נמצא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של התאים העובריים סה&quot;כ הכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את mouse משאיפת CO 2 ונקע בצוואר הרחם. תרסיס הבטן עם אתנול 70% לחיטוי. פתח את הבטן עם לנתח מספריים כדי להסיר את הרחם. שטוף את הרחם ב1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העוברים בתנאים סטריליים באמצעות מכסה המנוע בתרבית רקמה וכלי autoclaved ולשטוף בPBS 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הכבדים העובריים מהעוברים. החזק את גופו של העובר עם מלקחיים, משוך בעדינות את כבד העובר (בצבע הוורוד) מהגוף עם מלקחיים אחר. נקה את כבד העובר עם המלקחיים כדי להסיר את רקמות fibrotic הקשורות. מניחים את כל הכבדים העובריים לתוך טרי 1x PBS המכילים 10% בסרום שור העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני לשבש כבדים עובריים על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. גלולה התאים ב800 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וresuspend התאים 1 מ&quot;ל PBS עם 10% FBS (כ 8 E13.5 כבדים עוברייםלכל מ&quot;ל). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור של TER119 Erythroblasts שלילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את התאים עם IgG חולדה (0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא שטיפה או צנטריפוגה, להוסיף נוגדן אנטי TER119 biotinylated להשעית התא (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל). דגירה של 15 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ב1x PBS עם 10% FBS (1:10) ו צנטריפוגות ב XG 800 למשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מ&quot;ל של PBS עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75 μl streptavidin מצומדות עם חלקיקים מגנטיים ודגירה של 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפח ל2.5 מ&quot;ל עם PBS המכיל 10% FBS. מעבירים את ההשעיה התא לתוך 5 מ&quot;ל פוליפרופילן עגול צינור תחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצינור לתוך מנגנון מיון תאים מגנטי ודגירה של 10 דקות. תאים חיוביים TER119 יצרפו לצד של הצינור. Erythroblasts השלילי TER119 הפנוי יישאר בהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את ההשעיה התא לתוך 5 מ&quot;ל פוליפרופילן חדש עגול צינור תחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><html> חזור על השלבים 3.2.6 ו3.2.7 כדי להסיר את התאים החיוביים TER119 השיורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב800 XG למשך 5 דקות. לשאוב את supernatant. Resuspend תאי 1 מ&quot;ל PBS המכיל 10 FBS% ולספור תאים חיים עם Trypan הכחול. </li></ol></li></ol> התמרה .4 עם וירוסי הקידוד cDNA או shRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי כבד TER119 המטוהר השליליים העובריים ב3-5 x 10 5 / גם בפיברונקטין מצופה 12 גם צלחת (להתאים את מספר התא, אם באמצעות צלחת שונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף polybrene לריכוז סופי של 10 מ&quot;ל / מיקרוגרם כדי להקל על התמרה ויראלית. ספין להדביק את התאים עם lentiviruses או רטרווירוסים, cDNA קידוד או shRNA, ב800 XG ל1-1.5 שעה על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> .5 תרבות של Erythroblasts העוברי העכבר שלילי transduced TER119 הכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק פונקציות גן בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף (איור 1 קווים מקווקווים).&quot;&gt; </ol.><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol. li=""> תרבות תאי transduced במדיום חופשי (בינוני SCF) EPO לשעה 12 כדי לאפשר הביטוי של גנים והתחזוקה של מדינת אב transduced. </ol.></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב800 XG למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend תאי 1 מ&quot;ל Epo המכילים בינוני בכל אחד גם צלחת 12 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התרבות ל24 או 48 שעות, לקצור את התאים עבור מבחני נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פונקציות גן המבחן בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף (איור 1 קווים מוצקים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי transduced מייד במדיום המכיל Epo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התרבות ל24 או 48 שעות, לקצור את התאים למבחנים נוספים. </li></ol></li></ol> .6 הכתמה של התאים בתרבית עוברי כבד לניתוח תזרים cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף וresuspend תאי 1x PBS. קציר 2 x 10 5 תאים בתרבית לניתוח התזרים cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירההתאים עם נוגדני fluorophore מצומדות- ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. כדי לבדוק בידול, להשתמש נגד TER119 מצומדות APC אנטי CD71 מצומדות וPE. כדי לבדוק אנוקלאציה, להשתמש כתם Hoechst 33342 בנוסף לנוגדנים האחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 1x PBS. Resuspend תאי 0.5 מ&quot;ל PBS המכילים 1% FBS ויודיד propidium (PI) (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) להכתים את התאים המתים ומוציא אותם מניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת התנהלות ניתוח cytrometric. לנתח תאי בקרת צבע המוכתם ובלא כתם הסינגל ראשון להסתגלות ופיצוי של cytometer את הזרימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stem+cell+to+red+cell:+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins,+RNAs,+and+chromatin+modifications.">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li><li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+cells+red:+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin.">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li><li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis:+integrins+in+red+cell+development.">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells.">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li><li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts.">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li><li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival,+proliferation,+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development.">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li><li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods.">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li><li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation.">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li><li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells.">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li><li>Bhatia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acid-mediated+effects+on+erythropoiesis+in+primary+definitive+erythroid+cells.">Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells.</a> Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li><li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells:+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression.">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li><li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes.">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li><li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis:+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor.">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li><li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+erythropoiesis.">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מציגים מערכת ייחודית לניתוח erythropoiesis מסוף כבד העובר עכבר כרונולוגי. באמצעות היישום של תנאי תרבות שונים, נתחנו בהצלחה erythropoiesis מסוף בתחילת וסוף השלבים. הדבר חשוב במיוחד על מנת לקבוע את המנגנונים של גנים עם פונקציות מרובות. לדוגמא, GTPases Rac לשחק תפקידים חשובים בשלב...

Erythropoiesis הוא התהליך של התמיינות של תאי גזע hematopoietic multipotent להבשיל אריתרוציטים. תהליך הדרגתי זה כולל הקמת יחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es), היחידות המתחלקות במהירות erythroid המושבה להרכיב (CFU-Es), ומורפולוגית erythroblasts זיהוי 1,2. erythropoiesis מסוף מתאי אב CFU-E כרוך אריתרופויאטין תלוי רציף ושלבים עצמאיים 2,3. בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, אריתרופואטין (EPO) נקשר לקולטן שלו על פני התא וגורם לסדרה של מסלולי איתות במורד הזרם המונעים אפופטוזיס תא ולקדם חלוקות תא מהירות וביטוי גני 1,4. בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, erythroblasts לעבור יציאת תא מסוף מחזור, הכרומטין ועיבוי גרעין, ושחול של הגרעינים מרוכזים מאוד 5. ההבנה של מסוף שלנוerythropoiesis השתפר מאוד בעשורים האחרונים, שהוא במידה רבה עקב השימוש המוצלח של כמה במבחנה ובמודלים של עכברי vivo 6-9. בין הדגמים הללו, בתרבות במבחנה של erythroblasts כבד עכבר עוברי מספק יתרונות רבים, כולל את הקלות של טיהור תא, התפשטות מהירה ובידול, וקרוב יותר לחקות לerythropoiesis אדם 10,11. במערכת זו, מספר גדול של תאי אב erythroid מכבדים עובריים של עכבר יכול להיות מבודד בקלות על ידי הטיהור היחידה צעד של TER119 (סמן לתאי erythroid הבוגרים) erythroblasts השלילי. במהלך התרבות בת היומיים של erythroblasts, ההתמיינות של תאים אלה יכול להיות במעקב על ידי ניתוח התזרים cytometric מבוסס על ביטוי פני השטח של קולט transferrin (CD71) ואנטיגן TER119 12. בנוסף, אנוקלאציה של erythroblasts בידול סופני יכולה להיות מזוהה על ידי יצרנית DNA (Hoechst 33342) 13. יתר על כן, האבות המטוהרים ניתן מהונדסים גנטי על ידי ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין, המאפשר מחקרים מכניסטית של הפונקציות של ביטוי גנים בerythropoiesis 11,13,14. מצד השני, שיעור צמיחת תאים המהיר יכול להיות חרב פיפיות, שכן קשה לאפיין פונקציות גן בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף. ברוב המקרים, קשה לקבוע אם פונקציות גן ספציפיות בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף מאז על ידי הזמן cDNAs או shRNAs הביע, התאים כבר עברו את השלב המוקדם. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו מערכת ייחודית לנתח המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. עבור השלב המוקדם של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי המהונדס גנטי היה בתרבית במדיום Epo נטול אבל מכיל תאי גזע גורם (SCF), IL-6 וFLT3ליגנד כדי לשמור על מעמד אביהם ולאפשר cDNAs transduced או shRNA לביטוי 13. התאים שונו למדיום המכיל Epo לאחר שעה 12 לגרום התפשטות תאים והתמיינות. בדרך זו, כאשר התאים התחילו להבחין, cDNAs transduced או shRNAs כבר הביעו. עבור השלב מאוחר של erythropoiesis מסוף, TER119 erythroblasts השלילי היו בתרבית בEpo המכיל בינוני מייד לאחר התמרה. לכן, ניתן לנתח את הפונקציות של הגנים של עניין בשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף. לסיכום, יישום רחב של מערכת זו יעזור פונקציות גן לנתח בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.

<table><tbody><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s MediumIMDM (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GEMINI Bio-product</td><td>700-102P</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>14-8001-80</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)&amp;nbsp;</td><td>GEMINI Bio-product</td><td>300-327P</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>STEMCELL TECH</td><td>9300</td><td>10% stock in IMDM</td></tr><tr><td>Erythropoietin(Epo)</td><td>PROCRIT</td><td>NOC 59676-303-00</td><td>3,000 U/ml stock</td></tr><tr><td>Streptavidin particles Plus</td><td>BD Pharmingen</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>STEMCELL TECH</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml</td><td>FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis

Erythropoiesis כרוך בתהליך דינמי שמתחיל ביחידות פרץ erythroid מחויב להרכיב (BFU-Es) ואחריו המתחלק במהירות המושבה erythroid להרכיב יחידות (CFU-Es). לאחר CFU-Es, תאי מורפולוגית לזיהוי ובדרך כלל מכונה erythroblasts מסוף. אחד האתגרים לחקר erythropoiesis המסוף הוא חוסר גישות ניסיוניות לנתח פונקציות גן באופן כרונולוגי. בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה ייחודית כדי לקבוע פונקציות גן בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. במערכת זו, TER119 העכבר העוברי כבד (סמן תא erythroid הבוגר) erythroblasts השלילי היו מטוהר וtransduced עם ביטוי אקסוגני של cDNAs או RNA קטן סיכת הראש (shRNAs) לגנים של עניין. התאים היו בתרבית לאחר מכן בגורמי גדילה בינוניות המכיל מלבד אריתרופויאטין (EPO) כדי לשמור על הבמה אביהם עבור שעות 12 תוך מתן האפשרות לcDNAs אקסוגניים או shRNAsלהביע. התאים שונו עד בינוני Epo לאחר שעה 12 לגרום התמיינות תאים והתרבות ואילו החומרים גנטיים אקסוגני כבר הביעו. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של פונקציות גן בשלב המוקדם של erythropoiesis מסוף. ללמוד erythropoiesis מסוף שלב מאוחר, תאים היו בתרבית באופן מיידי במדיום Epo לאחר התמרה. בדרך זו, התאים היו כבר הבדילו לשלב מאוחר של erythropoiesis מסוף כאשר החומרים גנטיים transduced באו לידי ביטוי. אנו ממליצים יישום כללי של אסטרטגיה זו, שיסייע להבין את פונקציות גן מפורטות בשלבים שונים של erythropoiesis מסוף.

איור 1 מתאר את האסטרטגיות הניסיוניות. הפרוטוקול מורכב משני תנאים עצמאיים למיקוד הפונקציות של מולקולות איתות בשלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. TER119 erythroblasts כבד העובר השלילי היו מטוהר מן עובר עכבר E13.5. ניתוח תזרים cytometric של תאי erythroid כבד העובר לפנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

אנו מציגים מערכת במבחנה עכבר עוברית erythroblast כבד תרבות שמנתחת את השלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. מערכת זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של גנים מסוימים בשלבי התפתחות שונים.

עכבר עוברי כבד מערכת התרבות לנתח פונקציות היעד ג&#39;ין בשלבים המוקדמים ומאוחרים של המסוף erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

mouse-fetal-liver-culture-system-to-dissect-target-gene-functions-at

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

14.9K Views.  Northwestern University.  אנו מציגים מערכת במבחנה עכבר עוברית erythroblast כבד תרבות שמנתחת את השלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. מערכת זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של גנים מסוימים בשלבי התפתחות שונים. 

Video: Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Developmental Biology

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of red cell formation is regulated by the hormone erythropoietin (Epo), whose synthesis is triggered by tissue hypoxia. A threat to adequate tissue oxygenation results in a rapid increase in Epo, driving an increase in erythropoietic rate, a process known as the erythropoietic stress response. The resulting increase in the number of circulating red cells improves tissue oxygen delivery. An efficient erythropoietic stress response is therefore critical to the survival and recovery from physiological and pathological conditions such as high altitude, anemia, hemorrhage, chemotherapy or stem cell transplantation. 
The mouse is a key model for the study of erythropoiesis and its stress response. Mouse definitive (adult-type) erythropoiesis takes place in the fetal liver between embryonic days 12.5 and 15.5, in the neonatal spleen, and in adult spleen and bone marrow. Classical methods of identifying erythroid progenitors in tissue rely on the ability of these cells to give rise to red cell colonies when plated in Epo-containing semi-solid media. Their erythroid precursor progeny are identified based on morphological criteria. Neither of these classical methods allow access to large numbers of differentiation-stage-specific erythroid cells for molecular study. Here we present a flow-cytometric method of identifying and studying differentiation-stage-specific erythroid progenitors and precursors, directly in the context of freshly isolated mouse tissue. The assay relies on the cell-surface markers CD71, Ter119, and on the flow-cytometric 'forward-scatter' parameter, which is a function of cell size. The CD71/Ter119 assay can be used to study erythroid progenitors during their response to erythropoietic stress in vivo, for example, in anemic mice or mice housed in low oxygen conditions. It may also be used to study erythroid progenitors directly in the tissues of genetically modified adult mice or embryos, in order to assess the specific role of the modified molecular pathway in erythropoiesis.

A flow-cytometric method for identification and molecular analysis of differentiation-stage-specific murine erythroid progenitors and precursors, directly in freshly &#x2013;harvested mouse bone marrow, spleen or fetal liver. The assay relies on cell-surface markers CD71, Ter119, and cell size.

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Biology

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Medicine

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Bioengineering

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not yet been fully elucidated. A common problem encountered when studying the localization of key proteins and structures within enucleating erythroblasts by microscopy is the difficulty to observe a sufficient number of cells undergoing enucleation.&#160;We have developed a novel analysis protocol using multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), a method that combines immunofluorescent microscopy with flow cytometry, in order to identify efficiently a significant number of enucleating events, that allows to obtain measurements and perform statistical analysis.
We first describe here two in vitro erythropoiesis culture methods used in order to synchronize murine erythroblasts and increase the probability of capturing enucleation at the time of evaluation.&#160;Then, we describe in detail the staining of erythroblasts after fixation and permeabilization in order to study the localization of intracellular proteins or lipid rafts during enucleation by multi-spectral imaging flow cytometry.&#160;Along with size and DNA/Ter119 staining which are used to identify the orthochromatic erythroblasts, we utilize the parameters &#8220;aspect ratio&#8221; of a cell in the bright-field channel that aids in the recognition of elongated cells and &#8220;delta centroid XY Ter119/Draq5&#8221; that allows the identification of cellular events in which the center of Ter119 staining (nascent reticulocyte) is far apart from the center of Draq5 staining (nucleus undergoing extrusion), thus indicating a cell about to enucleate.&#160;The subset of the orthochromatic erythroblast population with high delta centroid and low aspect ratio is highly enriched in enucleating cells.

The present protocol describes a novel method of identifying a population of enucleating orthochromatic erythroblasts by multi-spectral imaging flow cytometry, providing a visualization of the erythroblast enucleation process.

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

עכבר עוברי כבד מערכת התרבות לנתח פונקציות היעד ג'ין בשלבים המוקדמים ומאוחרים של המסוף erythropoiesis

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video