ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

יצירת ספרואידים בכבד אנושי באמצעות מקורות אוטולוגיים יכולה לתרום לתחומי מחקר שונים כמו טוקסיקולוגיה, סרטן וגילוי תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא להשתמש בהפטוציטים אנושיים שמקורם ב- BDPC כדי להנדס ספרואידים של כבד אנושי, תוך עקיפת המחסור בהפטוציטים אנושיים ראשוניים או PHH. ניתן להרחיב ספרואידים אנושיים אוטולוגיים לרפואה רגנרטיבית וטיפול, במיוחד בחולים עם אי ספיקת כבד חריפה.

מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר אן-קתרין שוט, מובילת הפרויקט במעבדה שלי. התחל על ידי הכנת 500 מיליליטר של hepatoblast KnockOut החלפת סרום dimethyl sulfoxide או KSR DMSO בינוני ו hepatocyte התבגרות בינוני. Aliquot את המדיום מן המלאי ולהוסיף גורם גדילה hepatocyte טרי או HGF ו oncostatin M או OCM בריכוזים סופיים של 10 או 20 ננוגרם למיליליטר עבור כל שינוי בינוני.

מעבירים שלוש פעמים 10 לתאי גזע פלוריפוטנטיים חמישיים שמקורם בדם או תאי BD-PSCs לצלחת ארבע בארות מצופות ביולמינין ודגרים על הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% במשך חמישה ימים. כדי לתמוך בהתמיינות האנדודרמלית, תרבית את התאים במשך חמישה ימים בתווך KSR DMSO hepatoblast ושנה את המדיום כל 48 שעות. ביום החמישי, מוסיפים מדיום הבשלת הפטוציטים ומגדלים את התאים למשך שבעה עד 10 ימים נוספים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5%, מה שמבטיח שינוי של התווך כל 48 שעות.

ספירת תאים באמצעות תא ספירה וצנטריפוגה BD de-differentiated cell suspension ב 300 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופר-נטנט, יש להשהות מחדש את תאי ה-BD המתמיינים בתווך KSR DMSO פי שניים 10 מתוך ששת התאים למיליליטר. לאחר הבטחת השעיית התא הבודד, הסר כל לכלוך נוסף על ידי העברת התאים דרך מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר.

שוב, ספרו את התאים באמצעות תא ספירה והכינו נפח מספיק של צפיפות הזריעה של כל תא כדי לחלק את הנפח הנדרש לכל באר. הכינו שיפוע עם זריעה עליונה של מיליון תאים לצפיפות זריעה נמוכה של 4, 000 תאים. לאחר מכן, להוציא 100 מיקרוליטר של KSR DMSO בינוני ב 96-טוב לוחות חיבור נמוך ולהוסיף 100 מיקרוליטר של דילול זריעת תאים.

דוגרים על צלחת החיבור הנמוכה במשך חמישה ימים. החליפו 50% מהתווך ביום השלישי או הרביעי לאחר הזריעה, כאשר הספרואידים קומפקטיים מספיק. ביום החמישי, לשנות את המדיום להבשלת הפטוציטים ותרבית את התאים בו במשך שבעה עד 10 ימים נוספים, לשנות את המדיום כל 48 שעות.

לאחר תרבית התאים במשך 4, 8, 15 ו-24 ימים בשיטת ההתמיינות שתוארה קודם לכן, הסר את המדיה. לדגור על התאים עם קיבועים שחוממו מראש המכילים 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות. לאחר מכן, להשליך את הקיבוע ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים במשך חמש דקות כל אחד.

יש להוסיף מיד תמיסת Triton X-100 של 0.1% ולחדור לתאים למשך חמש דקות לפני שתי שטיפות של PBS. הוסיפו תמיסת חסימה העשויה PBS ואלבומין בסרום בקר 5% או BSA לפני שתניחו את התאים על צלחת נדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לדלל נוגדנים ראשוניים במאגר דילול 1%BSA PBS ולהוסיף 50 מיקרוליטר של דילול הנוגדנים לכל באר.

יש להשליך את תמיסת הנוגדנים לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר ולתת שלוש שטיפות של חמש דקות כל אחת באמצעות PBS. מוסיפים 50 מיקרוליטר נוגדנים משניים מדוללים בחיץ דילול בכל באר ודגרים על התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד, הרכיבו את הכיסויים עם מדיית הרכבה המכילה DAPI לניתוח מיקרוסקופי.

יש להשליך בזהירות את אמצעי התרבית מבלי לגעת בכדורים, להוסיף PBS טרי עם תמיסת טריטון X-100 0.1% ולדגור במשך חמש דקות כדי לחדור לתאים. שטפו את הספרואידים פעמיים עם המדיום על ידי פיפטציה איטית של המדיום. לאחר מכן, לדגור את הספרואידים עם 50 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים במשך שעה אחת.

לאחר שנעשה, בזהירות להסיר את הפתרון נוגדנים עודף ולתת שלוש שטיפות של בינוני. הכינו את הנוגדנים המשניים המתאימים כמו IgG Cy3 נגד עכבר עיזים, IgG 488 נגד עכבר עזים וארנב נגד עוף IgG Texas Red ב- PBS עם 1% BSA והוסיפו 50 מיקרוליטר של דילול נוגדנים לכל באר לפני 20 דקות של דגירה באינקובטור פחמן דו חמצני. שוב, לשטוף שלוש פעמים עם המדיום לפני 30 דקות של דגירה באינקובטור.

יש להדליק את מקור האור הפלואורסצנטי 10 דקות לפני השימוש. הפעל את המחשב ופתח את תוכנת ההדמיה. השתמש במטרה הגדלה 4X על ידי לחיצה על כפתור 4X בסרגל הכלים כדי לבחור את סרגל קנה המידה הנכון.

לאחר מכן הניחו את הצלחת בת 96 הבארות על הצלחת המרכזית של הבמה. הפעל את מקור אור ה- LED, השתמש במסנן brightfield ומקם את הצלחת לבאר העניין באמצעות ידית הכוונון של שלב ציר XY. שנה לנתיב תאורת המצלמה ולחץ על הלחצן החי בתוכנת ההדמיה כדי להציג את התמונה על המסך.

ודא שהספרואיד ממורכז באמצעות ידיות ציר XY והתמקד באמצעות ידית המיקוד הגסה או העדינה. לאחר מכן, בחר את שיטת התצפית brightfield בסרגל הכלים, שים את הגדרות החשיפה לאוטומטיות ולחץ על לחצן התמונה בלוח הבקרה של המצלמה כדי לצלם תמונה. לאחר מכן שמור את התמונה כקובץ vsi באמצעות השם המתאים בתיקיית העניין.

הניחו את לוחית סיכוך תאורת הסביבה כדי לכבות את נורית ה-LED ולהחליף את המסנן לעירור B. לאחר מכן בחר שיטת תצפית 488. פתח את הצמצם, צלם תמונה על-ידי לחיצה על לחצן התמונה וסגור את הצמצם ושמור את הקובץ כ- vsi.

חזור על התהליך עם מסנן עבור עירור G כדי לחזור על התהליך עבור כל באר מעניינת. שינויים מורפולוגיים במהלך תהליך התמיינות הכבד הראו כי BD-PSCs התמינו להפטוציטים באמצעות שלושה שלבים. השלב הראשון ייצג את ההתמיינות לתאים אנדודרמליים.

ההתמיינות השנייה לתאי אב כבדיים המציגים מורפולוגיה מצולעת טיפוסית. והשלישי, ההתבגרות להפטוציטים. ניתוח אימונופלואורסנציה הראה את הביטוי החזק של סמני אב של הכבד האנושי כמו חלבון עוברי אלפא או APF וטרנסתירטין או TTR בתאים בשלב הראשון של תהליך התמיינות הכבד ביום L4 עד L8.

עם זאת, הביטוי שלהם ירד ביום L15. הביטוי של אלבומין או ALB ופקטור גרעיני הפטוציטים ארבע אלפא או HNF4 אלפא הופיע לראשונה ב-L4, גדל לאורך זמן ההתמיינות L4 ל-L15, והגיע לביטוי חזק ויציב בזמן ההבשלה L15 עד L24. צבירה ספונטנית של תאים נצפתה בלוחות התקשרות נמוכים המכילים אינדוקציה של הפטוציטים או התבגרות בינונית יזומה היווצרות ספרואידים.

נצפה מתאם עקבי בין סטרואידים ספרואידים לבין מספר התאים המשתנה. הספרואידים שנוצרו והתמיינו ב-L14 וחיים מוכתמים בנוגדנים חשפו את הפעילות התפקודית הפוטנציאלית בכבד של ספרואידים שמקורם ב-BD-PSCs. הכנת תאים מונוגרעיניים לתכנות מחדש היא הצעד החשוב ביותר בהליך זה.

יצירת ספרואידים בכבד האנושי היא הצעד הראשון ליצירת אורגנואידים במבחנה גרסה פשוטה של האיבר בתלת-ממד עם מיקרו אנטומיה דומה לזו in vivo. אורגנואידים שנוצרו במעבדה משמשים לחקר אורגנוגנזה, התפתחות מחלות וחומרים מזינים.