עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט GM094246, איגוד לב האמריקאי גרנט 11GRNT7890004, והקרן הלאומי למדע גרנט MCB-1,110,501.

.1 צור Construct המכיל את החלבון של ריבית לשכפל את הגן המבטא את החלבון של עניין לתוך וקטור מתאים. וקטורי שימוש כגון סדרת pcDNA או pRK5 כפי שהם מתאימים גם לביטוי במערכות יונקים כמו תאי HEK293 וCHO. .2 בחרו את האתרים בחלבון שתויג עם fluorophores <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו אתרי תיוג כי הם מסוגלים לשקף את שינויי קונפורמציה אפשריים בתוך החלבון. במידת האפשר, להשתמש במבנה הגבישי של החלבון או של חלבון הומולוגי כדי לסייע להפוך קביעה זו. אם אין מבנה הגבישי זמין, להשתמש בתוכנה באינטרנט כדי לחזות את המבנה האפשרי של החלבון ולכן תקבל תובנה האתרים מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שאריות כך שהרשתות בצד של השאריות שנבחרו הן משטח חשוף ונגיש לfluorophores כך שיכול להיות שכותרתו החלבון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שאריות שאינם קריטיים לתפקוד חלבון, לאתרים לדוגמה, שאינם מעורבים ביגנד המחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהחדרת המוטציה ציסטאין, לתת העדפה לאתרים הדומים, למשל סרין, שיגרמו הפרעה מינימאלית למבנה החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בחירת אתרי התיוג, לעשות מוטציות על מנת להבטיח כי החלבון נותן רק LRET מאתרים המיועדים אלה. להשתמש בפרוטוקולים מכוונים mutagenesis אתר סטנדרטיים להשתנות משם cysteines אינו מלוכדות דיסולפיד שעלול להיקשר לmaleimide מצומדות- תגי ניאון. אל להשתנות משם cysteines מלוכדות דיסולפיד ו, cysteines החופשי קבר שכן הם לא צריכים להגיב בצבעי ניאון בצורה המקופלת של החלבון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את שאריות ציסטאין באתרים הרצויים על ידי ביצוע מוטציות נקודה תוך שימוש בפרוטוקולים מכוון mutagenesis אתר סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל אתר מחשוף פרוטאז שיכול דווקא לדבוק את אחד cysteines מהחלבון. אםרצף חלבון מאפשר את זה, להציג את האתר על ידי שמרני מוטציה החלבון יש תרומבין (רצף הכרת LVPRGS) או פקטור Xa (IDGR רצף הכרה או IEGR) רצף ליד ציסטאין הציג ונגיש לפרוטאז מחשוף; אחרת רצף tetra- או Hexa-peptide עשוי להיות מוכנס בכללותה. בחר האתר באופן שעם מחשוף אחד cysteines הציג מנתק משאר החלבונים במקרים מסוימים, זה עשוי לדרוש שני אתרי מחשוף איגוף ציסטאין מוטציה. </li></ol> .3 מבחן הביטוי ופונקציונאלי של החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע כתם מערבי כדי לאשר ביטוי של החלבון שעבר מוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay פונקציונלי של החלבון על מנת להבטיח כי המוטציות שינו את תפקוד החלבון אך במידה מועטת, אם בכלל, כדי להימנע מלימוד שינויי קונפורמציה של חלבונים לא מתפקדים. הערה: מאחר שיש לי כל החלבונים פונקציות שונות, אין f אחת<html> assay unctional המשמש במיוחד עבור LRET; עם זאת, כמה דוגמאות של מבחני תפקודיים כוללות מבחני אנזים פעילות אנזימים, מבחני מחייב ליגנד לקולטנים, ומחקרי אלקטרופיזיולוגיה לתעלות יונים. </li></ol> .4 בחר fluorophores כדי לשמש fluorophores בחר, על בסיס מגוון המרחק הצפוי הנמדד כך שהטווח הוא בין 0.5-1x R 0 של זוג fluorophore. הערה: זה מאפשר לחיסור קל יותר של הרקע, שבו יש בדרך כלל חיים ארוכים הרבה יותר. לדוגמא, אם טווח המרחק הצפוי נמדדים הוא סביב 35 Å, זוג fluorophore מתאים לשימוש יהיה chelate terbium כתורם וAlexa 594 כacceptor, כי R 0 לזוג הזה הוא 53 A (טבלת 1). .5 הגעה החלבון על ידי זמני transfecting הסכום הנדרש של תאי יונקים ntent &quot;&gt; זמני transfect החלבון של עניין לתוך תאי יונקים בחרו משתמשים באחת מריאגנטים transfection הנפוצים בדרך כלל, להשתמש בארבע מנות 10 ס&quot;מ לכל ניסוי LRET לשורות תאי HEK וCHO;. עם זאת, סכום זה עשוי להשתנות בהתאם לביטוי חלבון , יציבות, וכו &#39;. אפשר התאים לבטא החלבון ל36-48 שעות לפני הקציר. .6 לייבל החלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים מצלחת התרבות. ניתוק תאי HEK פשוט על ידי pipetting חיץ נגד תחתית הצלחת. ניתוק תאי CHO עם מגרד תא, שטף את התקשורת עם חיץ תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב1,100 XG במשך 3 דקות. השתמש באותן הגדרות צנטריפוגות אלה לאיסוף תאים לאחר תיוג, כמו גם לאחר שטיפות שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות תאי 3 מ&quot;ל של חיץ תאי, ולאחר מכן להוסיף fluorophores תורם acceptor בכמויות equimolar עד לריכוז סופי של 100-300 ננומטר. דגירה על f מסובביאו שעה 1 בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים אלה שכותרת 3-4x עם חיץ תאי כדי להסיר fluorophores מאוגד, אז להשעות את התאים האלה במאגר תאי (בדרך כלל 2 מ&quot;ל) למדידות LRET. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת, תווית קבוצה של תאים עם fluorophore רק תורם (chelate terbium) נפרדת ללא תוספת של כל fluorophore acceptor. הערה: נתונים מניסויי תורם בלבד אלה הוא הכרחיים כדי להשלים את הניתוח. ניתן לעשות ניסויים אלה על זהים או שונים ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, מבצע אימות פונקציונלית, הפעם עם חלבון שעבר מוטציה שכותרתו, כתהליך התיוג יכול גם להפריע לתפקוד בהתאם לאתר המשמש לתיוג. הערה: ניתן לעשות ניסויים אלה על זהים או שונים ימים. </li></ol> .7 הגדרת ניסוי LRET <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תאי resuspended בקובט קוורץ עם נפח מינימאלי של 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב ואת המכשיר ולהתאים את הפרמטרים של datתכנית רכישה בהתאם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את אורך גל העירור לטווח הספיגה של fluorophore התורם (330-340 ננומטר עובד היטב עבור chelate terbium). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את אורך גל הפליטה כראוי, תוך התחשבות כי פליטת acceptor משתנה על בסיס acceptor משמש. חשוב לציין, בחר באורך גל זיהוי המודד רק פליטת acceptor ואינו כולל כל לדמם דרך מהפליטה של ​​התורם. לדוגמא, השתמש באורך גל של 565 ננומטר עבור Alexa 555 כלוח acceptor 1. עבור מדידות תורם בלבד, שבו חלבון שכותרתו רק עם תורם אך ללא acceptor, להשתמש באורך גל של 545 ננומטר למדידת פליטת chelate terbium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האורך של גילוי פליטה להיות לפחות שלוש פעמים בחייו LRET הצפויים להבטיח שרכיב ארוך חיים לא יחסר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הסריקה. האם לפחות שלוש סריקות של 99 מטאטא כדי להבטיח עקביות של תוצאות. להציל את התוצאות דואר כקובץ טקסט (* txt). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד שינויי קונפורמציה של חלבונים בכל קשורים לתנאים שונים (כגון תוספת של ליגנד), לשנות את התנאים האלה ושוב לבצע לפחות שלוש סריקות של 99 מטאטא כל על אותו המדגם תחת מצב חדש זה. אם בוחנים את ההשפעות של גלוטמט בקונפורמציה של קולטני גלוטמט, למשל, להוסיף גלוטמט עד 1 מ&quot;מ לאותו המדגם שנסרק בשלב 7.3, ולאחר מכן לסרוק שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עד חמש יחידות של פרוטאז המתאים ולקחת סריקות ללא הרף עד המחשוף הוא מלא ולא חלה שינוי נוסף הוא לראות את החיים במשך שלוש סריקות רצופות. בדרך כלל, מחשוף יושלם בתוך שנים עד 3 שעות. אם אתר מחשוף פקטור Xa משמש למחשוף פרוטאז, למשל, להוסיף 3 μl של פקטור Xa למדגם, ולסרוק כל 30 דקות ל3 שעות. </li></ol> .8 לנתח נתונים המתקבלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה לניתוח נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את החיים הקרינהנתונים באמצעות ASCII היבוא כדי לפתוח את קבצי טקסט. לטעון את כל משכפל כמו גם מדידות רקע הסופיות, לתוך קובץ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע הנתונים מכל הסריקות לכל תנאי ניסוי כדי לקבל את הנתונים הסופיים. לשם כך, סמן את העמודות המכילות מחקרים הבודדים, לאחר מכן, תחת תפריט נתונים בשורת התפריטים, לחץ על סטטיסטיקה על שורות כדי להציג את העוצמות ממוצעת הקרינה מהניסויים, כמו גם סטיית התקן ושגיאה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה הערכים הממוצע כגרף קו עם עוצמת הקרינה על ציר Y והחיים בהמייקר על ציר X כדי ליצור עקומה שמייצגת את חייו של הפליטה רגישה של acceptor. לשנות את ציר Y של המזימה בקנה מידה יומן, כדי לאפשר הדמיה טובה יותר של נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 8.3 על נתוני מדידת רקע, עם ממוצע של הסריקות הסופיות שמראות חפיפה המציין מחשוף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את נתוני רקע הממוצעים עלאותה חלקה שמכילה את הנתונים גולמיים בממוצע. לשם כך, פתח את תיבת הדו שיח בקרת השכבה נמצאה תחת תפריט מגרש. לאחר מכן, להעביר את הנתונים המכילים את הרקע מתכוונים לרשימה של תוכן שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את נתוני רקע הממוצעים לנתונים הגולמיים הממוצעים. לשם כך, השתמש בפונקציה מתמטית פשוטה תחת תפריט המתמטיקה להכפיל או לחלק את נתוני רקע כנדרש עד סוף הזנב של הרקע חופף עם הזנב של נתונים הגולמיים. הערה: בסופו של דבר זנב זה, כל החיים מהחלבון של עניין צריך כבר נרקבה משם לגמרי; מה מיושר הוא פשוט הווה אות הרקע הן לפני והן אחרי מחשוף פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחסיר אות הרקע מיושרת מאות LRET הגלם הראשונית, שוב באמצעות הפונקציה מתמטית פשוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הנתונים לדעיכה מעריכית (Exponentials בודד או מרובה, בהתאם לאתרים ועיצוב ניסיוני). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גבול ההתחלה להתקנה להתחיל לאחר תוםשל דופק הלייזר. השתמש באותו startpoint זה עבור כל אביזרים העקום שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיבת הדו שיח בחר התאמת הפונקציה, בחר דעיכה מעריכית כדי להתאים לכל החיים למשוואה לדעיכה מעריכית יחידה הבאה: <img alt="משוואה 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" /> משוואה. 4 שם, y מייצג את עוצמת הקרינה, y 0 מייצג את עוצמת הרקע בשל רעש מהמערכת, 1 היא עוצמת האות, t הוא לכל החיים הקרינה, x הוא הזמן, וx 0 הוא הזמן לקזז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן x 0 עד 0, להתחיל פונקצית ההתאמה, ולהתאים את הנתונים. הערה: אם הניסוי נועד לי אות רק מזוג אחד של אתרים, את הנתונים המתקבלים בקלות צריכים להיות בכושר על ידי דעיכה מעריכית יחידה 8. השייר של הכושר הוא שיטה טובה כדי לקבוע את הטוב בכושר ואם חיים ריקבון נוספים הם required. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתקופות החיים המתקבלים מנתונים כדי לחשב את המרחק בין fluorophores באמצעות משוואת פורסטר (סידור מחדש של משוואות 1 ו -2 לעיל): <img alt="משוואה 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" /> משוואה. 5 הערה: כל המשתנים הם כאמור לעיל עם τ DA לאחר שנמדד כחי פליטת acceptor רגישים. ניתן למצוא פרטים נוספים ודוגמאות על מדידות של R 0 ו R במקום אחר 7,9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ניתוח הניסוי ונתונים לפחות שלוש פעמים כדי להבטיח שחזור. חוסר עקביות בין חזרות בודדות באותה המדידה מעמידה בסימן שאל את תוקפו של נתונים; להשתמש ניסויי שליטה נוספים או חזרות. לחשב טעויות במדידה באמצעות המחשבון החופשי גוסטב ניתוח שגיאה (שפותח על ידי ד&quot;ר תומס הובר) או מערכת דומה שמפיץ את השגיאה בהמתאים של הפעם בחיים. </li></ol>

<ol>
	<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes.">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate:+improvements+on+fluorescence+energy+transfer.">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li><li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium.">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li><li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates:+part+2.">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li><li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor.">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel.">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor.">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+(NMDA)+receptors.">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li><li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbium(III)+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors.">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

LRET היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת למדענים למדוד מרחקים בין תחומים בתוך חלבון יחיד, כמו גם בין תת יחידות בחלבון Multimeric. ככזה, LRET הוא מתאים היטב לבחינת השינויים ודינמיקת קונפורמציה של חלבונים או מקרומולקולות אחרות. הפרוטוקול הנ&quot;ל צריך לאפשר מעבדה מצוידת כראוי כדי לבחון...

העברת הארה תהודת אנרגיה (LRET) היא נגזרת של טכניקת העברה ידועה פלואורסצנטי תהודת אנרגיה (סריג) 1. בדומה לסריג, LRET ניתן להשתמש כדי למדוד מרחקים ושינויי מרחק בין fluorophores תורם acceptor המצורף לאתרים ספציפיים על החלבון של עניין בטווח של 10-100 Å 1-3. העקרונות של LRET דומים גם הם לסריג שבהעברת אנרגיית התהודה מתרחש בין שני fluorophores הפרוקסימלי כאשר ספקטרום הפליטה של ​​fluorophore התורם חופף עם ספקטרום הספיגה של fluorophore acceptor. היעילות של העברה זו קשורה למרחק בין שני fluorophores על ידי המשוואה הבאה: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> משוואה. 1 כאשר R הוא המרחק בין שני fluorophores, E הוא את היעילות של enהעברת ergy, וR 0, שיידון להלן, הוא רדיוס פורסטר לזוג fluorophore, כלומר המרחק שבו יעילות של העברה היא חצי מקסימאלי. ממשוואה זו, ניתן לראות את היעילות הקשור לסדר הגודל של המרחק בחזקה השישית ההפוכה 1. זה תלות זו הפוכה שישי כוח המאפשרת לסריג ומדידות LRET להיות רגישים להפליא אפילו לשינויי מרחק קטנים כאשר ליד R 0 של זוג סריג. היכולת לתייג באופן ספציפי אתרים הרצויים בחלבונים או מקרומולקולות אחרות מאפשרת לאדם לנצל את רגישות זו כדי לעקוב אחר שינויי קונפורמציה. בהשוואה לסריג, אשר עושה שימוש במולקולות צבען אורגניים קונבנציונליות, LRET מציע יתרונות נוספים. בLRET, במקום להשתמש בצבע אורגני כfluorophore התורם, קטיון סדרת lanthanide, בדרך כלל Tb 3 + או האיחוד האירופי 3 +, משמש 1,4-6. Fluorophores שנופל under קטגוריה זו, למשל, chelate terbium, הם גם מאוד תכליתיים בכך שהם יכולים להיות בשימוש עם מגוון רחב של fluorophores acceptor. גמישות זו מתאפשרת בגלל ספקטרום הפליטה של ​​lanthanides chelated להכיל פסגות פליטה חדות מרובות, המאפשר למין יחיד של fluorophore תורם לשימוש עם אחד ממגוון רחב של fluorophores acceptor. לפיכך, פליטת acceptor רגישה יכולה להיות מזוהה ללא כל חשש של זיהום לדמם דרך מפליטת תורם 5. הנסיין בוחר את acceptor הספציפי המבוסס על המרחק הצפוי בין שני fluorophores (איור 1 ולוח 1). בfluorophores lanthanide chelated אלה, יון מתכת chelated על ידי מולקולה המכילה קבוצת אנטנה שממגרת את lanthanide בדרך כלל גרוע, סופג לעירור, כמו גם קבוצה פונקציונלית bioreactive לקשור יון לקבוצה פונקציונלית ספציפית על מקרומולקולה 1, 5,6. Oncדואר נרגש, lanthanides להירגע למדינת הקרקע באמצעות שחרורו של פוטונים עם קצב דעיכה בטווח אלפית השנייה. בגלל הריקבון אינו הרפיה גופייה לגופייה ולא הרפיה שלישייה לגופייה, הפליטה של פוטונים לא יכולה כראוי להיקרא הקרינה או זרחני, אבל הוא יותר מכונה הארה 1 כראוי. הדעיכה של הארה lanthanide הארוכה מאוד עוזרת במדידות לכל החיים. מדידות חיים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לקבוע את יעילות באמצעות הקשר הבא: <img alt="משוואה 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> משוואה. 2 שם, E היא את היעילות של העברה, τ D הוא את חייו של התורם (lanthanide chelated) כאשר אינם משתתף בהעברת אנרגיה, וτ DA הוא את חייו של התורם בעת ההשתתפות בהעברת אנרגיה עם acceptor. עם LRET, DA τ יכול אלכך יימדד כחייו של פליטת acceptor רגיש משום שחייו של terbium הוא כל כך הרבה יותר גדול מfluorophore acceptor אורגני. Acceptor פולט עם אותו החיים כעירור (lanthanide התורם) ההסתה שלה, וכל תרומה לכל החיים מחי הקרינה הפנימית של acceptor עצמו היא יחסית זניחה. על ידי מדידת הפליטה רגישה ולא פליטת תורם, אנחנו גם מבטלים את הצורך להבטיח תיוג ב1 בדיוק: 1 יחס של תורם לacceptor. חלבון במקום יכול להיות מתויג בו זמנית עם שני acceptor וfluorophores תורם. אוכלוסיית שכותרת הטרוגני תגרום, אבל חלבוני שכותרתו כפול של תורם לא פולטים באורך גל acceptor וחלבוני שכותרתו הכפול acceptor לא יהיו נרגשים. יתר על כן, המרחק בין fluorophores צריך להיות זהה, ללא קשר לציסטאין אתר fluorophore ניתנו מתחבר ל, במיוחד בעת השימוש בlanthanides איזוטרופיים כתורם, כך לביתד כדי לציין אתר נתון לקבל גם התורם או acceptor הוא מיותר. עוצמת עשויה להיות מושפעת עם אוכלוסייה הטרוגנית, אבל עדיין צריכה להיות יותר מהדרוש כדי להתגלות. בעת תכנון ניסויים, הבחירה של fluorophores צריכה להיות מוכתבת על ידי ערך R 0 של הזוג, כמו גם את טווח המרחק הצפוי נמדדים. ערך R 0 מוגדר על ידי המשוואה הבאה: <img alt="משוואה 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> משוואה. 3 שבו, R 0 הוא הרדיוס פורסטר באנגסטרם, κ 2 הוא גורם האורינטציה בין שני הצבעים (בדרך כלל ההנחה היא להיות 2/3), φ D הוא התשואה הקוונטי של התורם, J היא החפיפה ספקטרלית נפרד בין התורם של ספקטרום פליטה וספקטרום הספיגה של acceptor בM - 1-1 סנטימטר 4 ננומטר, וn הוא מקדמת השבירה של המדיום 1. המעבדה שלנו הוסיפה שינוי לטכניקת LRET הקונבנציונלית על ידי החדרת אתר הכרת פרוטאז בין אתרי תווית תורם ונוטל על החלבון שנחקר. שינוי זה מאפשר לחקירה במערכות מטוהרת שאינן כגון תאי יונקים כל 7. טכניקה זו שימושית במיוחד בעת שימוש בcysteines כאתרים לתיוג, שכן בתהליך של תיוג עם צבעי maleimide מצומדות- אשר נקלטים על ידי קבוצות sulfhydryl ציסטאין, חלבונים אחרים בתאים שיש לי cysteines גם מסומנים. עם זאת, על ידי הכללת אתרי מחשוף פרוטאז על החלבון של עניין ומדידת תקופות חיים לפני ואחרי המחשוף, הנסיין יכול כמותית להחסיר אות הרקע לאחר מחשוף פרוטאז מאות הגלם. חיסור זה מבודד את האות הספציפית הנובעת מהחלבון של עניין (איוריור 2). באמצעות השינוי שתואר לעיל, LRET ניתן להשתמש כדי למדוד את מרחק שינויים בין תורם chelate terbium והבדיקה נוטלים על חלבון, וכך לעקוב אחר שינויי קונפורמציה במצב הפיזיולוגי הקרוב של החלבון ללא הדרישה לטיהור. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1.The קליטה וספקטרום פליטה של terbium chelated בשחור, כמו גם acceptor נציג, Alexa 488, באדום. שים לב פסגות פליטה מרובות ומגוון החד, צר פליטה עבור כל שיא של chelate terbium. דפוס זה מאפשר לterbium לשימוש עם מגוון רחב של fluorophores acceptor ומאפשר המדידה של פליטה רגיש בתוך אלה טווחים בי terbium לא מראה פליטה. שיא הפליטה של ​​Terbium ב486 ננומטר חופף היטב עם<html> שיא bsorption של Alexa 488, המאפשר העברת אנרגיית התהודה להתרחש בין שני fluorophores. אורך גל של 515 ננומטר הוא בחירה מצוינת לגילוי פליטה רגיש לזוג הזה כפי שהוא בעמק שבין פסגות פליטת terbium, ודי קרוב של Alexa 488 שיא פליטה של ​​520 ננומטר. שים לב כי ננומטר להיות ליד שיא acceptor, אם כי רצוי, אינו נדרש-565 הוא עדיין מסוגל לזהות פליטת Alexa 488 בלי גם גילוי פליטת terbium. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Acceptor Fluorophore </td><td style="width:45px;"> R 0 (א) </td><td style="width:183px;"> פליטת גל (ננומטר) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> והעמסת </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> טבלת 1 רשימה של fluorophores acceptor הנפוץ לLRET באמצעות chelate terbium כתורם 11. 0 ערכי R נמדדו כאשר התורם acceptor צורפו לתחום מחייב אגוניסט המסיס של קולטני AMPA. הוא אידיאלי כדי למדוד את ערך R 0 שוב לנחקרת כל מערכת חדשה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 סקירה כללית של שיטת LRET הציגה. () קולטן AMPA הוא חלבון קרום שעובר שינויי קונפורמציה על הכריכה ליגנד. ליגנד דו בצורת הצדפהתחום nding הוא הקיף כאן באדום. (ב) תחום מחייב ליגנד של AMPA כאשר אינם מחויבת לחלבון קיים בקונפורמציה פתוחה (משמאל). כאשר חייב יגנד גלוטמט, החלבון סוגר סביב יגנד (מימין). על ידי הצבת fluorophores באתרים הראייתית על LBD, טיבו של שינוי קונפורמציה זו ניתן לראות את המרחק בין שינויי fluorophores, אז שישפיעו על כל החיים הקרינה. (ג) כאשר כל תאי תיוג, תיוג של שני החלבון של עניין, כמו גם חלבוני קרום רקע עלול להתרחש (משמאל). לאחר מחשוף פרוטאז, אות LRET מהחלבון של עניין תיעלם עקב השחרור של בר מסיס, עוזב אות רקע שלם (מימין). אות רקע אז זה יכול להיות מופחתים אות הגלם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

העברת הארה תהודת אנרגיה, או LRET, היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת למדידת מרחקים בין שני אתרים בחלבונים בטווח המרחק של 10-100 א. על ידי מדידת המרחקים בתנאי ligated שונים, שינויי קונפורמציה של החלבונים ניתן להעריך בקלות. עם LRET, lanthanide, terbium לרוב chelated, משמש כfluorophore התורם, מעניק יתרונות כגון חיים ארוכים יותר תורמות בלבד פליטה, את הגמישות להשתמש fluorophores acceptor מרובה, ואת ההזדמנות כדי לזהות פליטת acceptor רגיש כדרך קלה כדי למדוד העברת אנרגיה ללא הסיכון של גם איתור אות תורם בלבד. כאן, אנו מתארים שיטה לשימוש LRET על חלבוני קרום הביע וassayed על פני השטח של תאי יונקים ללא פגע. אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין זוג fluorophore LRET. לאחר קבלת אות LRET המקורית, מחשוף באתר זה מסיר את אות LRET הספציפי מהחלבון שלעניין ומאפשר לנו להפחית את אות הרקע שנשארה לאחר מחשוף כמותית. שיטה זו מאפשרת ליותר מבחינה פיזיולוגית מדידות רלוונטיות להתבצע ללא הצורך בטיהור של חלבון.

מדידה LRET מוצלחת עם תורם lanthanide צריכה תורם חיים רק בטווח הזמן אלפית השנייה. חיים שלמים של פליטת LRET רגיש לחלבון שכותרתו עם התורם וacceptor יהיו בעיקר קצרים יותר, עם חיים בטווח המיקרו לאחר חיסור רקע איור 3. פרוטאז תוצאות מחשוף בגידול בחיים שצריכות להיות יציבים לאורך ?...

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells at JoVE.com

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

אנו מתארים כאן שיטת ההעברה השתפרה הארת תהודת אנרגיה (LRET) שבו אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין אתרי fluorophore תורם acceptor. שינוי זה מאפשר לנו להשיג אותות LRET ספציפיים הנובעים מחלבונים קרום של עניין, המאפשרים המחקר של חלבונים בממברנה ללא טיהור חלבון.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K Views.  University of Texas Health Science Center at Houston.  אנו מתארים כאן שיטת ההעברה השתפרה הארת תהודת אנרגיה (LRET) שבו אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין אתרי fluorophore תורם acceptor. שינוי זה מאפשר לנו להשיג אותות LRET ספציפיים הנובעים מחלבונים קרום של עניין, המאפשרים המחקר של חלבונים בממברנה ללא טיהור ח...

Video: Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

מערכת ניסיונית ללמוד Mechanotransduction ב לתאי ריאה עוברית

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

כמותית סריג ניתוח (תהודת העברת אנרגית פורסטר) לקביעת SENP1 פרוטאז קינטיקס

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה<em&gt; בVivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

אורביטל טלטול התרבות של תאים בתרבית של צורת O כלי לייצר אגרגטים אחיד

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...