وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM094246، وجمعية القلب الأميركية غرانت 11GRNT7890004، ومؤسسة العلوم الوطنية غرانت MCB-1110501.

1. إنشاء تعبيد تحتوي على البروتين من الفائدة استنساخ الجين التعبير عن بروتين من الفائدة الى ناقلات مناسبة. استخدام ناقلات مثل سلسلة pcDNA أو pRK5 كما هي مناسبة تماما للتعبير في أنظمة الثدييات مثل خلايا HEK293 وCHO. 2. حدد مواقع على البروتين أن يكون ذات الكلمات الدلالية مع Fluorophores <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مواقع العلامات التي تكون قادرة على تعكس التغيرات متعلق بتكوين الممكنة ضمن البروتين. إذا كان ذلك ممكنا، استخدام هيكل الكريستال من البروتين أو بروتين مماثل للمساعدة في جعل هذا القرار. إذا لم يكن هناك هيكل الكريستال المتاحة، استخدام البرمجيات على الانترنت للتنبؤ بنية ممكن من البروتين، وبالتالي الحصول على نظرة ثاقبة المواقع المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المخلفات بحيث سلاسل الجانب من بقايا المختارة هي السطح المعرض والوصول إلى fluorophores بحيث يمكن أن توصف البروتين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المخلفات التيليست حاسمة إلى وظيفة البروتين، على سبيل المثال المواقع التي لا تشترك في يجند ملزم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في إدخال طفرة السيستين، وإعطاء الأفضلية للمواقع التي تشبه، على سبيل المثال سيرين، التي من شأنها أن تتسبب في اضطراب الحد الأدنى للبنية البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اختيار المواقع وضع العلامات، وجعل الطفرات لضمان أن البروتين يعطي فقط من انتقال البيئي بعيد المدى هذه المواقع المقصودة. استخدام بروتوكولات الطفرات الموجهة الموقع قياسية لتتحول بعيدا cysteines المستعبدين غير ثاني كبريتيد التي يحتمل أن ربط maleimide-مترافق علامات الفلورسنت. لا يتحور بعيدا cysteines المستعبدين ثاني كبريتيد ودفن، cysteines الحرة لأنها لا ينبغي أن تتفاعل مع الأصباغ الفلورية في شكل مطوية من البروتين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال بقايا السيستين في المواقع المطلوبة عن طريق الطفرات نقطة باستخدام بروتوكولات الطفرات الموجهة الموقع القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتضمن الموقع الانقسام البروتيني الذي يمكن أن يلتصق على وجه التحديد مرة واحدة من cysteines من البروتين. إذا كانتسلسل البروتين يسمح لذلك، ويعرض الموقع تحور متحفظ البروتين أن يكون الثرومبين (LVPRGS تسلسل الاعتراف) أو عامل شى (IDGR تسلسل الاعتراف أو IEGR) تسلسل بالقرب من السيستين وأدخلت في متناول البروتيني الانقسام. وإلا فإن تسلسل رباعي أو سداسي الببتيد يمكن إدراجها ككل. اختيار الموقع مثل أنه عند انشقاق أحد cysteines قدم تنأى عن بقية من البروتين في بعض الحالات، وهذا قد يتطلب موقعين الانقسام المرافقة السيستين تحور. </li></ol> 3. اختبار التعبير وظيفة البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء طخة غربية لتأكيد التعبير عن البروتين تحور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء الفحص الوظيفي للبروتين لضمان أن الطفرات غيرت وظيفة البروتين الحد الأدنى فقط، على كل حال، لتجنب دراسة التغيرات متعلق بتكوين بروتين مختلة. ملاحظة: بما أن جميع بروتينات لها وظائف مختلفة، و ليس هناك واحدة<html> فحص unctional التي تستخدم خصيصا للانتقال البيئي بعيد المدى. ومع ذلك، بعض الأمثلة من المقايسات الفنية وتشمل فحوصات انزيم النشاط للإنزيمات، المقايسات ملزم لمستقبلات يجند، والدراسات الكهربية لقنوات أيون. </li></ol> 4. حدد Fluorophores لاستخدامها اختر fluorophores على أساس نطاق مسافة المتوقع أن قياس بحيث يكون النطاق بين 0.5-1x وR 0 للزوج fluorophore. ملاحظة: هذا يسمح لالطرح أسهل من الخلفية، التي لديها عادة أعمار أطول بكثير. على سبيل المثال، إذا كان نطاق مسافة المتوقع الذي يتم قياسه حوالي 35 Å، زوج fluorophore المناسب لاستخدام كلاب سيكون التيربيوم والجهات المانحة واليكسا 594 باعتبارها متقبل، لأن R 0 لهذا الزوج هو 53 Å (الجدول 1). 5. التعبير عن البروتين عليها بنقل عابر المبلغ المطلوب من خلايا الثدييات ntent &quot;&gt; عابر بالنقل البروتين من الفائدة في خلايا الثدييات المختارة باستخدام أي من الكواشف ترنسفكأيشن المشتركة عادة، استخدام أربعة أطباق 10 سم في تجربة انتقال البيئي بعيد المدى للخطوط الخلايا كلوة وCHO؛ ومع ذلك، قد تختلف هذه الكمية حسب تعبير البروتين والاستقرار، الخ. السماح للخلايا للتعبير عن البروتين ل36-48 ساعة قبل الحصاد. 6. تسمية البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من صحن الثقافة. فصل الخلايا HEK ببساطة عن طريق pipetting لعازلة ضد قاع الطبق. فصل خلايا CHO مع مكشطة الخلية، وغسل من وسائل الإعلام مع العازلة خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 3 دقائق. استخدام هذه الإعدادات نفس الطرد المركزي لجمع الخلايا بعد وضع العلامات، وكذلك بعد يغسل اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا في 3 مل من العازلة خارج الخلية، ثم يضاف fluorophores المانحة ومتقبل بكميات متساوي المولية يصل إلى تركيز النهائي من 100-300 نانومتر. على احتضان و المدورةأو 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل هذه الخلايا المسمى 3-4x مع العازلة خارج الخلية لإزالة fluorophores غير منضم، ثم تعلق هذه الخلايا في المخزن خارج الخلية (عادة 2 مل) لقياس انتقال البيئي بعيد المدى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كعنصر تحكم، تسمية مجموعة منفصلة من الخلايا مع fluorophore المانحة الوحيد (التيربيوم كلاب) من دون إضافة أي fluorophore المتقبلة. ملاحظة: البيانات من هذه التجارب الجهات المانحة الوحيد هو ضروري لاستكمال التحليل. هذه التجارب يمكن القيام به على نفس أو مختلفة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى، إجراء التحقق من الصحة الوظيفية، وهذه المرة مع البروتين المسمى متحولة، وعملية وضع العلامات قد تتداخل أيضا مع وظيفة اعتمادا على الموقع تستخدم لوضع العلامات. ملاحظة: هذه التجارب يمكن القيام به على نفس أو مختلفة أيام. </li></ol> 7. إعداد تجربة انتقال البيئي بعيد المدى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا معلق في كوفيت الكوارتز مع الحد الأدنى من حجم 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتشغيل الكمبيوتر والصك وضبط المعلمات من داتبرنامج الاستحواذ وفقا لذلك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الطول الموجي الإثارة إلى مجموعة الامتصاصية من fluorophore المانحة (330-340 نانومتر يعمل بشكل جيد لالتيربيوم كلاب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الطول الموجي الانبعاثات بشكل مناسب، مع الأخذ في الاعتبار أن الانبعاثات متقبل يختلف على أساس متقبل المستخدمة. الأهم من ذلك، تحديد الطول الموجي الكشف الذي يقيس فقط الانبعاثات ومتقبل لا يتضمن أي تنزف من خلال الانبعاثات من المتبرع. على سبيل المثال، استخدام الطول الموجي من 565 نانومتر لترتيب 555 على أنه متقبل الجدول 1. لقياسات المانحة الوحيدة، التي وصفت البروتين فقط مع الجهات المانحة ولكن من دون متقبل، واستخدام الطول الموجي من 545 نانومتر لقياس الانبعاثات التيربيوم كلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين طول الكشف عن الانبعاثات أن تكون على الأقل ثلاثة أضعاف العمر المتوقع انتقال البيئي بعيد المدى لضمان أنه لن يتم غاب عنصر العمر الطويل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء المسح الضوئي. لا يقل عن ثلاثة بالاشعة من 99 الاحتلالات لضمان اتساق النتائج. حفظ عشرالنتائج البريد كملف نصي (* النص). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس التغيرات متعلق بتكوين جزئي من البروتين بالنسبة لظروف مختلفة (مثل إضافة يجند)، تغيير تلك الشروط مرة أخرى وأداء لا يقل عن ثلاثة بالاشعة من 99 الاحتلالات كل على نفس العينة تحت هذا الشرط جديدة. إذا دراسة آثار الغلوتامات على التشكل من مستقبلات الغلوتامات، على سبيل المثال، إضافة الغلوتامات إلى 1 ملم لنفس العينة الممسوحة ضوئيا في الخطوة 7.3، ثم مسح مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضيف ما يصل الى خمس وحدات من البروتيني المناسب واتخاذ اجراء الفحوصات باستمرار حتى اكتمال الانقسام ويعتبر أي تغيير آخر في حياة لمدة ثلاثة بمسح المتعاقبة. عادة، انشقاق كاملة في غضون سنتين أو 3 ساعة. إذا كان يتم استخدامها لالبروتيني الانقسام وعامل شى الموقع الانقسام، على سبيل المثال، إضافة 3 ميكرولتر من عامل شى لعينة، ومسح كل 30 دقيقة لمدة 3 ساعة. </li></ol> 8. تحليل البيانات التي يتم الحصول عليها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برامج تحليل البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عمر مضاناستيراد البيانات باستخدام ASCII لفتح ملفات نصية. تحميل جميع مكررات وكذلك القياسات خلفية النهائية، في ملف واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​البيانات من جميع بالاشعة لكل حالة تجريبية للحصول على البيانات النهائية. للقيام بذلك، تسليط الضوء على الأعمدة التي تحتوي على التجارب الفردية، ثم ضمن القائمة بيانات في شريط القوائم، انقر على إحصاءات عن الصفوف لعرض متوسط ​​كثافة مضان من المحاكمات، فضلا عن الانحراف المعياري والخطأ المعياري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم متوسط ​​القيم كما رسم خط مع كثافة مضان على المحور Y وعمرها في ميكروثانية على المحور السيني لخلق منحنى الذي يمثل عمر الانبعاثات توعية للمتقبل. تغيير Y-محور المؤامرة على نطاق السجل، للسماح التصور أفضل من البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 8.3 على بيانات القياس الخلفية، بمتوسط ​​المسح النهائية التي تظهر التداخل يشير انشقاق كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض البيانات على خلفية متوسطنفس المؤامرة التي تحتوي على البيانات الخام المتوسط. للقيام بذلك، افتح مربع الحوار التحكم في طبقة وجدت ضمن القائمة الأرض. ثم، نقل البيانات التي تحتوي على خلفية يعني في قائمة المحتويات طبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة البيانات الأساسية يعني أن البيانات الخام يعني. للقيام بذلك، استخدم الدالة الرياضيات بسيطة ضمن القائمة الرياضيات للضرب أو تقسيم البيانات الأساسية حسب الحاجة حتى نهاية الذيل من الخلفية تتداخل مع نهاية الذيل من البيانات الخام. ملاحظة: عند هذه نهاية الذيل، وعمر من البروتين من الفائدة يجب أن يكون بالفعل التهاوي تماما بعيدا؛ ما هو الانحياز هو ببساطة الخلفية إشارة الحالي قبل وبعد البروتيني الانقسام كليهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح إشارة الخلفية الانحياز من الخام الأولية إشارة انتقال البيئي بعيد المدى، ومرة ​​أخرى باستخدام وظيفة الرياضيات بسيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب البيانات إلى الاضمحلال الأسي (exponentials واحدة أو متعددة، اعتمادا على المواقع والتصميم التجريبي). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين حدود بداية لالمناسب لتبدأ بعد نهايةمن نبضة ليزر. استخدام هذا startpoint نفسها لجميع التجهيزات منحنى اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مربع الحوار وظيفة تركيب اختر، اختر الاضمحلال الأسي وذلك لتناسب عمر للمعادلة التالية لالاضمحلال الأسي واحد: <img alt="المعادلة 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" /> مكافئ. 4 حيث Y يمثل كثافة مضان، ذ 0 يمثل كثافة الخلفية بسبب الضوضاء من النظام، و 1 هو كثافة إشارة، تي هو عمر مضان، x هو الوقت، و x 0 هي المرة الإزاحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح س 0-0، بدء تركيب وظيفة، واحتواء البيانات. ملاحظة: إذا تم تصميم التجربة أن يكون إشارة فقط من زوج واحد من المواقع، وينبغي أن تكون البيانات الناتجة تناسب بسهولة عن طريق الاضمحلال الأسي واحد 8. المتبقي من يصلح هو طريقة جيدة لتحديد الخير من يصلح وإذا أعمار تسوس هي اشتراطات إضافيةأد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أعمار الحصول عليها من البيانات لحساب المسافة بين fluorophores باستخدام معادلة فورستر (إعادة ترتيب المعادلات 1 و 2 أعلاه): <img alt="المعادلة 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" /> مكافئ. 5 ملاحظة: جميع المتغيرات هي على النحو المذكور أعلاه مع τ DA بعد أن تم قياسه وفقا لتوعيتهم عمر الانبعاثات المتقبلة. مزيد من التفاصيل والأمثلة على قياسات R 0 و R يمكن العثور عليها في أي مكان آخر 7،9،10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار التجربة وتحليل البيانات ثلاث مرات على الأقل لضمان التكاثر. التناقض بين التكرار الفردية من نفس قياس يدعو إلى التشكيك في صحة البيانات؛ استخدام التجارب تحكم إضافية أو التكرار. حساب الأخطاء في القياس باستخدام المجانية غوستافوس تحليل خطأ حاسبة (التي وضعها الدكتور توماس هوبر) أو نظام مماثل التي تنتشر الخطأ فييناسب من العمر. </li></ol>

<ol>
	<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes.">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate:+improvements+on+fluorescence+energy+transfer.">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li><li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium.">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li><li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates:+part+2.">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li><li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor.">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel.">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor.">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+(NMDA)+receptors.">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li><li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbium(III)+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors.">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

انتقال البيئي بعيد المدى هي تقنية قوية تسمح للعلماء بقياس المسافات بين المجالات داخل بروتين واحد وكذلك بين مفارز في بروتين multimeric. على هذا النحو، ومناسبة تماما انتقال البيئي بعيد المدى لدراسة التغييرات وديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات أو الجزيئات الأخرى. بروتوكول ...

التلألؤ نقل الطاقة الرنين (انتقال البيئي بعيد المدى) هو مشتق من المعروف الإسفار الرنين نقل الطاقة (الحنق) تقنية 1. مماثلة لتأكل، انتقال البيئي بعيد المدى يمكن استخدامها لقياس المسافات والتغيرات المسافة بين المانحين ومتقبل fluorophores تعلق على مواقع محددة على البروتين من الفائدة ضمن نطاق 10-100 Å 1-3. مبادئ انتقال البيئي بعيد المدى هي أيضا مشابهة لالحنق في ذلك نقل الطاقة الرنين يحدث بين اثنين fluorophores القريبة عندما الطيف الانبعاثات من fluorophore المانحة يتداخل مع امتصاص الطيف من fluorophore المتقبلة. وترتبط كفاءة هذا النقل لبعد المسافة بين اثنين fluorophores بواسطة المعادلة التالية: <img alt="المعادلة 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> مكافئ. 1 حيث R هي المسافة بين اثنين fluorophores، E هو كفاءة ENنقل ergy، وR 0، ناقش أدناه، هو نصف قطر فورستر للزوج fluorophore، أي المسافة التي كفاءة النقل هي نصف القصوى. من هذه المعادلة، يمكن للمرء أن يرى أن يرتبط الكفاءة لحجم المسافة مرفوعة للقوة السادسة عكسية 1. هذا هو معكوس السادس الاعتماد السلطة التي تسمح للانتقال البيئي بعيد المدى الحنق والقياسات لتكون حساسة بشكل رائع حتى للتغيرات مسافة صغيرة عند قرب R 0 من الزوج الحنق. القدرة على تسمية المواقع على وجه التحديد المطلوب على بروتينات أو الجزيئات الأخرى يسمح لأحد للاستفادة من هذه الحساسية لرصد التغيرات متعلق بتكوين. بالمقارنة مع الحنق، والذي يستخدم جزيئات الصبغة العضوية التقليدية، انتقال البيئي بعيد المدى يوفر مزايا إضافية. في انتقال البيئي بعيد المدى، بدلا من استخدام الصبغة العضوية مثل fluorophore المانحة، وهي الموجبة سلسلة اللانثينيدات، وعادة السل 3+ أو الاتحاد الأوروبي 3+، ويستخدم 1،4-6. Fluorophores التي تقع شالتانجو هذه الفئة، على سبيل المثال، التيربيوم كلاب، هي أيضا تنوعا للغاية لأنها يمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من fluorophores المتقبلة. يتم إجراء هذه المرونة ممكنا لأن أطياف انبعاث اللانثينيدات بالكلاب تحتوي على عدة قمم الانبعاثات حادة، والسماح لنوع واحد من fluorophore المانحة ليتم استخدامها مع واحد من مجموعة واسعة من fluorophores المتقبلة. وبالتالي، يمكن الكشف عن الانبعاثات توعية متقبل دون أي خوف من تلوث تنزف من خلال من الانبعاثات المانحة 5. المجرب يختار متقبل محددة على أساس المسافة المتوقعة بين اثنين fluorophores (الشكل 1 والجدول 1). في هذه fluorophores اللانثينيدات بالكلاب، وبالكلاب الأيونات المعدنية بنسبة جزيء يحتوي على مجموعة الهوائي أن محسس اللانثينيدات عادة سيئة لامتصاص الإثارة فضلا عن مجموعة وظيفية bioreactive إلى حبل أيون إلى مجموعة وظيفية محددة على جزيء 1، 5،6. انسالبريد متحمس، اللانثينيدات الاسترخاء على ارض الدولة من خلال إطلاق الفوتونات مع معدل تسوس في نطاق ميلي ثانية واحدة. لأن تسوس ليست تخفيف القميص، إلى القميص ولا الاسترخاء الثلاثي، إلى القميص، انبعاث الفوتونات لا يمكن أن يسمى بشكل صحيح أو مضان تفسفر، ولكن أكثر وصفه بشكل صحيح التلألؤ 1. اضمحلال طويل من اللانثينيدات التلألؤ يساعد بشكل كبير في القياسات مدى الحياة. ويمكن بعد ذلك قياسات عمر استخدامها لتحديد كفاءة من خلال العلاقة التالية: <img alt="المعادلة 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> مكافئ. 2 حيث E هو كفاءة نقل، τ D هو عمر المانحة (اللانثينيدات بالكلاب) عندما لا تشارك في نقل الطاقة، وτ DA هو عمر المتبرع عند المشاركة في نقل الطاقة مع متقبل. مع انتقال البيئي بعيد المدى، يمكن τ DA اللهبحيث يتم قياسه وفقا لعمر الانبعاثات متقبل لتوعيتهم عمر التيربيوم هو اكبر من ذلك بكثير وfluorophore متقبل العضوية. ومتقبل تنبعث مع نفس العمر والتحريض على الإثارة (اللانثينيدات المانحة) لها، والمساهمة في أي عمر من عمر مضان الجوهرية الخاصة ومتقبل هي ضئيلة نسبيا. عن طريق قياس الانبعاثات توعية بدلا من الانبعاثات المانحة، ونحن أيضا قضاء على الحاجة إلى ضمان وضع العلامات في تمام نسبة 1: 1 من المانحين لالمتقبلة. يمكن بدلا من ذلك أن يكون المسمى البروتين في وقت واحد مع كل متقبل وfluorophores المانحة. وهناك سكان المسمى بتباين يؤدي، ولكن البروتينات المسمى المزدوج المانحة لا تنبعث في طول الموجة متقبل وسوف المزدوج متقبل البروتينات المسمى لا يكون متحمس. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون المسافة بين fluorophores نفسه، بغض النظر عن الموقع الذي السيستين تعلق fluorophore نظرا ل، وخاصة عند استخدام اللانثينيدات الخواص بمثابة المانحة، وبالتالي فإن نيد لتحديد موقع معين لتلقي إما الجهة المانحة أو متقبل غير ضروري. قد تتأثر كثافة مع السكان غير متجانسة، ولكن ينبغي أن يكون لا يزال أكثر من كافية ليتم الكشف. عند تخطيط التجارب، ينبغي أملت اختيار fluorophores من قيمة R 0 من الزوج وكذلك نطاق مسافة المتوقع الذي يتم قياسه. يتم تعريف قيمة R 0 بواسطة المعادلة التالية: <img alt="المعادلة 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> مكافئ. 3 حيث R هو نصف قطر 0 فورستر في أنجسترومز، κ 2 هو عامل التوجه بين اثنين من الأصباغ (يفترض عادة أن يكون 2/3)، φ D هو العائد الكم من الجهات المانحة، J هو التداخل الطيفي يتجزأ بين المتبرع طيف الانبعاث والامتصاص الطيف متقبل في M - 1سم -1 4 نانومتر، و n هو معامل الانكسار من الوسط 1. وقد أضاف لدينا المختبر تعديل لأسلوب انتقال البيئي بعيد المدى التقليدية عن طريق إدخال موقع الاعتراف البروتيني بين المواقع التسمية المانحة ومتقبل على البروتين يجري بحثها. هذا التعديل يسمح للتحقيق في النظم غير المنقى مثل خلايا الثدييات كلها 7. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عند استخدام cysteines كمواقع لوصفها، لأن في عملية وضع العلامات مع الأصباغ maleimide مترافق التي تربط لمجموعات سلفهيدريل السيستين، بروتينات أخرى على الخلايا التي وصفت أيضا cysteines. ومع ذلك، بما في ذلك مواقع الانقسام البروتيني على البروتين من الفائدة وقياس عمر قبل وبعد الانقسام، يمكن للمجرب طرح كميا في إشارة الخلفية بعد انشقاق الأنزيم البروتيني من إشارة الخام. هذا الطرح يعزل إشارة محددة تنشأ من البروتين من الفائدة (الشكللدى عودتهم 2). باستخدام التعديل المذكورة أعلاه، انتقال البيئي بعيد المدى يمكن استخدامها لقياس التغيرات المسافة بين المانحين التيربيوم كلاب والتحقيق متقبل على البروتين، وبالتالي رصد التغيرات متعلق بتكوين في الحالة الفسيولوجية القريب البروتين دون الحاجة لتنقية. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1.The في امتصاص الأطياف وانبعاث التيربيوم بالكلاب باللون الأسود، بالإضافة إلى متقبل التمثيلي، اليكسا 488، في الحمراء. لاحظ قمم الانبعاثات متعددة وحادة، وضيق نطاق الانبعاثات لكل ذروة التيربيوم كلاب. هذا النمط يسمح للالتيربيوم ليتم استخدامها مع مجموعة متنوعة من fluorophores المتقبلة ويسهل قياس الانبعاثات توعيتهم ضمن هذه النطاقات حيث يظهر التيربيوم أي انبعاث. ذروة الانبعاثات التيربيوم لفي 486 نانومتر تتداخل بشكل جيد مع ل<html> bsorption ذروة اليكسا 488، والسماح لنقل الطاقة الرنين تحدث بين اثنين fluorophores. والطول الموجي من 515 نانومتر هو خيار ممتاز لكشف الانبعاثات توعيتهم لهذا الزوج كما هو الحال في وادي بين قمم الانبعاثات التيربيوم، وجدا قرب اليكسا 488 في ذروة الانبعاثات من 520 نانومتر. لاحظ أنه يجري بالقرب من ذروة متقبل، على الرغم من المرغوب فيه، ليس مطلوبا-565 نانومتر لا يزال قادرا على كشف اليكسا 488 الانبعاثات أيضا دون الكشف عن الانبعاثات التيربيوم. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> fluorophore متقبل </td><td style="width:45px;"> R 0 (Å) </td><td style="width:183px;"> الانبعاثات الطول الموجي (نانومتر) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> أتو 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3PX؛ &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> فلوريسئين </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> الكسا 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> الكسا 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> الكسا 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> الكسا 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trارتفاع = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> و Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. قائمة fluorophores المتقبلة تستخدم عادة للانتقال البيئي بعيد المدى باستخدام كلاب التيربيوم كما المتبرع 11. تم قياس R 0 القيم عندما كانت تعلق على المانحة ومتقبل إلى ناهض نطاق ذوبان ملزم لمستقبلات أمبا. وهو مثالي لقياس قيمة R 0 مرة أخرى لكل نظام جديد قيد الدراسة. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. لمحة عامة عن طريقة انتقال البيئي بعيد المدى المعروضة. (A) ومستقبلات أمبا هو بروتين الغشاء الذي يخضع لتغيرات متعلق بتكوين عليه ملزم يجند. يجند ثنائية على شكل محارةوحلقت نطاق الاكتشاف هنا باللون الأحمر. (B) وجود المجال ملزم يجند من أمبا عندما لا بد أن البروتين في التشكل مفتوح (يسار). عندما بد أن يجند الغلوتامات، يغلق البروتين حول يجند لها (يمين). عن طريق وضع fluorophores في مواقع الثبوتية على الائتلاف الحزبي، يمكن أن ينظر إلى طبيعة هذا التغيير متعلق بتكوين والمسافة بين التغييرات fluorophores، والتي سوف ثم تؤثر مضان مدى الحياة. (C) عندما وصفها خلايا بأكملها، قد تحدث وسم كل من البروتين من الفائدة وكذلك بروتينات غشاء الخلفية (يسار). بعد انشقاق الأنزيم البروتيني، فإن إشارة انتقال البيئي بعيد المدى من البروتين من الفائدة تختفي بسبب الافراج عن جزء قابل للذوبان، وترك إشارة الخلفية سليمة (يمين). ويمكن بعد هذا إشارة الخلفية تطرح من إشارة الخام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة، أو انتقال البيئي بعيد المدى، هي تقنية قوية تستخدم لقياس المسافات بين موقعين في البروتينات ضمن نطاق مسافة 10-100 Å. عن طريق قياس المسافات تحت مختلف الظروف و ligated، والتغيرات متعلق بتكوين البروتين يمكن تقييمها بسهولة. مع انتقال البيئي بعيد المدى، وهو اللانثينيدات، التيربيوم في معظم الأحيان بالكلاب، ويستخدم في fluorophore المانحة، وتكفل مزايا مثل عمر أطول للمانحين الوحيد الانبعاثات، والمرونة في استخدام fluorophores المتقبلة متعددة، وفرصة للكشف عن انبعاث متقبل توعيتهم وسيلة سهلة لقياس نقل الطاقة دون التعرض لخطر أيضا الكشف عن إشارة المانحة الوحيد. هنا، نحن تصف طريقة لاستخدام انتقال البيئي بعيد المدى على بروتينات غشاء أعرب ويعاير على سطح خلايا الثدييات سليمة. ونحن نقدم موقع البروتيني الانقسام بين الزوج fluorophore انتقال البيئي بعيد المدى. بعد الحصول على إشارة انتقال البيئي بعيد المدى الأصلية، انشقاق في ذلك الموقع بإزالة الإشارة انتقال البيئي بعيد المدى محددة من البروتين لالفائدة مما يسمح لنا لطرح كميا في إشارة الخلفية التي تبقى بعد الانقسام. يسمح هذا الأسلوب لأكثر القياسات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لبذل دون الحاجة لتنقية البروتين.

مقياس انتقال البيئي بعيد المدى الناجح مع المانحين اللانثينيدات ينبغي أن يكون المتبرع مدى الحياة إلا في نطاق الوقت ميلي ثانية واحدة. فإن عمر الانبعاثات انتقال البيئي بعيد المدى لتوعيتهم البروتين المسمى مع كل من الجهات المانحة ومتقبل يكون أبرزها أقصر، مع عمر في نطاق ?...

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells at JoVE.com

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نحن هنا وصف طريقة التلألؤ تحسين نقل الطاقة الرنين (انتقال البيئي بعيد المدى) حيث نقدم موقع البروتيني الانقسام بين المواقع fluorophore المانحة ومتقبل. هذا التعديل يسمح لنا للحصول على إشارات محددة انتقال البيئي بعيد المدى الناشئة عن بروتينات غشاء الفائدة، والسماح لدراسة البروتينات الغشاء دون تنقية البروتين.

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K Views.  University of Texas Health Science Center at Houston.  نحن هنا وصف طريقة التلألؤ تحسين نقل الطاقة الرنين (انتقال البيئي بعيد المدى) حيث نقدم موقع البروتيني الانقسام بين المواقع fluorophore المانحة ومتقبل. هذا التعديل يسمح لنا للحصول على إشارات محددة انتقال البيئي بعيد المدى الناشئة عن بروتينات غشا?...

Video: Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

والنظام التجريبي لدراسة Mechanotransduction في خلايا رئة الجنين

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

الكمية الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) تحليل لتحديد حركية SENP1 البروتياز

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء<em&gt; في فيفو</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

تذوب الكتابة اليكتروسبينينج من السقالات Poly(ε-caprolactone) ثلاثي الأبعاد مع مورفولوجيس يمكن السيطرة عليها لتطبيقات هندسة الأنسجة

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

استزراع خلايا الثدييات في السقالات ببتيد ثلاثي الأبعاد

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

المداري تهز ثقافة خلايا الثدييات في السفن على شكل س لإنتاج المجاميع الموحدة

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...