Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health di Grant GM094246, l&#39;American Heart Association di Grant 11GRNT7890004, e la National Science Foundation sovvenzione MCB-1110501.

1 Creare il Construct contenente la proteina di interesse Clonazione del gene che esprime la proteina di interesse in un vettore adatto. Utilizzare i vettori come la serie pcDNA o pRK5 in quanto sono adatti per l&#39;espressione in sistemi di mammiferi come le cellule HEK293 e CHO. 2. selezionare i siti sulla proteina per essere etichettate con fluorofori <ol><li> Scegliere siti di etichettatura che sono in grado di riflettere eventuali cambiamenti conformazionali all&#39;interno della proteina. Se possibile, utilizzare una struttura cristallina della proteina o di una proteina omologa per contribuire a rendere questa determinazione. Se non c&#39;è struttura cristallina disponibili, utilizzare software online per prevedere la possibile struttura della proteina e quindi ricevere comprensione siti appropriati. </li><li> Scegliere residui tale che le catene laterali dei residui selezionati sono superficie esposta e accessibili a fluorofori in modo che la proteina può essere etichettato. <ol><li> Scegli residui chenon sono fondamentali per la funzione delle proteine, per esempio i siti che non sono coinvolti nel legame ligando. </li><li> Nell&#39;introdurre mutazione cisteina, dare la preferenza a siti che sono simili, per esempio serina, che potrebbero causare perturbazione minima per la struttura delle proteine. </li><li> Dopo aver scelto i siti di etichettatura, apportare le mutazioni al fine di garantire che la proteina dà solo lRet da questi siti destinati. Utilizzare protocolli standard di mutagenesi sito-diretta a mutare via cisteine-non-disolfuro bonded che potrebbero legarsi a maleimide-coniugati tag fluorescenti. Non mutare via cisteine ​​disolfuro-bonded e sepolti, cisteine ​​libere in quanto non devono reagire con coloranti fluorescenti in forma ripiegata della proteina. </li></ol></li><li> Introdurre residui di cisteina nei siti desiderati facendo mutazioni puntiformi utilizzando protocolli standard di mutagenesi sito-diretta. </li><li> Includere un sito di clivaggio della proteasi che possono specificatamente fendere fuori da una delle cisteine ​​della proteina. Se l&#39;sequenza della proteina permette di esso, introdurre il sito conservativo mutazione della proteina di avere una trombina (sequenza di riconoscimento LVPRGS) o Fattore Xa (sequenza di riconoscimento IDGR o IEGR) sequenza vicino alla cisteina introdotta e accessibili a proteasi scissione; altrimenti la sequenza tetra o esa-peptide può essere inserita nel suo complesso. Scegliere il sito di clivaggio tale che su una delle cisteine ​​introdotte dissocia dal resto della proteina-in alcuni casi, questo può richiedere due siti di taglio che fiancheggiano una cisteina mutato. </li></ol> 3 Prova l&#39;espressione e funzionalità della proteina <ol><li> Eseguire un western blot per confermare l&#39;espressione della proteina mutata. </li><li> Eseguire un test funzionale della proteina per garantire che le mutazioni hanno alterato la funzione della proteina solo in minima parte, se non del tutto, per evitare di studiare variazioni conformazionali di una proteina disfunzionale. NOTA: Dal momento che tutte le proteine ​​hanno funzioni diverse, non esiste un unico f<html> test unctional che viene utilizzato specificamente per lRet; tuttavia, alcuni esempi di test funzionali includono saggi enzimatici attività per gli enzimi, saggi-ligando di legame per i recettori, e studi di elettrofisiologia per i canali ionici. </li></ol> 4 Selezionare i Fluorofori da utilizzare Selezionare i fluorofori basati sulla gamma distanza prevista da misurare in modo che l&#39;intervallo è compreso tra 0.5-1x R 0 della coppia fluoroforo. NOTA: Questo consente una più facile sottrazione dello sfondo, che di solito ha durata molto più a lungo. Ad esempio, se l&#39;intervallo atteso distanza è misurata è di circa 35 Å, una coppia fluoroforo opportuno utilizzare sarebbe chelato terbio come il donatore e Alexa 594 come accettore, perché la R 0 per questa coppia è 53 Å (Tabella 1). 5. esprimere la proteina dal Transientemente trasfettando la quantità necessaria di cellule di mammifero S copi &quot;&gt; Transientemente transfettare la proteina di interesse nelle cellule di mammifero scelti utilizzando uno dei reagenti di trasfezione comuni In genere, utilizzare quattro piatti 10 cm per esperimento lRet per linee cellulari HEK e CHO,. tuttavia, questo importo può variare a seconda espressione della proteina , stabilità, ecc. Lasciare le cellule di esprimere la proteina per 36-48 ore prima della raccolta. 6 Etichettare le Proteine <ol><li> Staccare le cellule dal piatto di coltura. Staccare cellule HEK semplicemente pipettando tampone contro il fondo del piatto. Staccare cellule CHO con un raschietto cellulare, lavare via i media con tampone extracellulare. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1.100 xg per 3 min. Utilizzare le stesse impostazioni di centrifughe per la raccolta di cellule dopo l&#39;etichettatura, così come dopo i lavaggi successivi. </li><li> Sospendere cellule in 3 ml di tampone extracellulare, quindi aggiungere fluorofori donatore e accettore in quantità equimolare fino ad una concentrazione finale di 100-300 nM. Incubare su un rotatore fo 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule marcate 3-4x con tampone extracellulare per rimuovere fluorofori non legati, quindi sospendere queste cellule in tampone extracellulare (di solito 2 ml) per misure lRet. </li><li> Come controllo, etichettare un insieme separato di cellule con solo fluoroforo donatore (terbio chelato), senza aggiunta di alcun fluoroforo accettore. NOTA: I dati di questi esperimenti solo donatore è necessaria per completare l&#39;analisi. Questi esperimenti possono essere effettuati sugli stessi o diversi giorni. </li><li> Anche in questo caso, eseguire la convalida funzionale, questa volta con la proteina mutante etichettato, come il processo di etichettatura può anche interferire con la funzione a seconda del sito utilizzato per l&#39;etichettatura. NOTA: Questi esperimenti possono essere eseguiti sullo stesso o diversi giorni. </li></ol> 7 Impostare l&#39;esperimento lRet <ol><li> Porre le cellule risospese in una cuvetta di quarzo con un volume minimo di 1 ml. </li><li> Accendere il computer e lo strumento e regolare i parametri del datun programma di acquisizione di conseguenza. <ol><li> Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione alla gamma di assorbanza del fluoroforo donatore (330-340 nm funziona bene per terbio chelato). </li><li> Impostare la lunghezza d&#39;onda di emissione in modo appropriato, tenendo presente che l&#39;emissione accettore varia in base al accettore utilizzato. È importante sottolineare, selezionare una lunghezza d&#39;onda di rilevamento che misura solo l&#39;emissione accettore e non include alcun sanguinare-through dalla emissione del donatore. Ad esempio, utilizzare una lunghezza d&#39;onda di 565 nm per Alexa 555 come accettore Tabella 1. Per le misurazioni solo donatore, in cui la proteina è stato etichettato solo con il donatore, ma senza accettore, utilizzare una lunghezza d&#39;onda di 545 nm per la misurazione delle emissioni terbio chelato. </li><li> Impostare la lunghezza di rilevazione delle emissioni, deve essere almeno tre volte la durata prevista lRet per assicurare che un componente di lunga durata, non ci mancherà. </li></ol></li><li> Eseguire la scansione. Fare almeno tre scansioni di 99 scansioni per garantire la coerenza dei risultati. Salva thE i risultati come file di testo (txt). </li><li> Per misurare le variazioni conformazionali di una proteina in relazione alle diverse condizioni (ad esempio l&#39;aggiunta di un legante), modificare tali condizioni e nuovamente effettuare almeno tre scansioni di 99 spazza ciascuno sullo stesso campione in questa nuova condizione. Se lo studio degli effetti del glutammato sulla conformazione dei recettori del glutammato, ad esempio, aggiungere glutammato 1 mM allo stesso campione scansionata nel passaggio 7.3, e poi ripetere la scansione. </li><li> Aggiungi fino a cinque unità della proteasi appropriato e prendere scansioni continuamente fino scissione è completo e nessuna ulteriore cambiamento è visto nel corso della vita per tre scansioni successive. Di solito, scissione è completa in due per 3 ore. Se un sito di taglio Factor Xa viene utilizzato per clivaggio della proteasi, per esempio, aggiungere 3 ml di fattore Xa al campione, e la scansione ogni 30 minuti per 3 ore. </li></ol> 8 Analizzare i dati ottenuti <ol><li> Aprire il software di analisi dei dati. </li><li> Caricare la durata della fluorescenzadati utilizzando Importa ASCII per aprire i file di testo. Caricare tutte le repliche e le misurazioni del fondo finali, in un unico file. </li><li> Calcolare la media dei dati di tutte le scansioni per ogni condizione sperimentale per ottenere i dati finali. Per fare ciò, evidenziare le colonne che contengono le singole prove, poi sotto il menu Dati nella barra dei menu, fare clic su Statistiche su Righe per visualizzare i dell&#39;intensità media di fluorescenza delle prove, nonché la deviazione standard ed errore standard. </li><li> Tracciare i valori medi come un grafico lineare con intensità di fluorescenza sulla Y e la durata in microsecondi per l&#39;asse X per creare una curva che rappresenta la durata dell&#39;emissione sensibilizzate della accettore. Modificare l&#39;asse Y del complotto per una scala logaritmica, per consentire una migliore visualizzazione dei dati. </li><li> Ripetere il punto 8.3 sui dati misurazione del fondo, in media le scansioni finali che mostrano sovrapposizione indicazione completa scissione. </li><li> Visualizzare i dati di base medi sultrama stessa che contiene i dati grezzi media. Per fare ciò, aprire la finestra di dialogo Controllo layer trovato sotto il menu Plot. Poi, trasferire i dati contenenti sfondo significare nella lista dei contenuti di livello. </li><li> Allineare i dati di base medi ai dati grezzi medi. Per fare ciò, utilizzare la funzione matematica semplice sotto il menu Math di moltiplicare o dividere i dati di base, se necessario, fino alla fine della coda dello sfondo si sovrappone con la coda dei dati grezzi. NOTA: In questa coda, la durata della proteina di interesse dovrebbe essere già completamente decaduta; ciò è allineato è semplicemente lo sfondo segnale presente prima e dopo la scissione della proteasi. </li><li> Sottrarre il segnale di fondo allineato dal segnale iniziale lRet grezzo, ancora una volta utilizzando la funzione matematica semplice. </li><li> Inserire i dati in un decadimento esponenziale (esponenziali singoli o multipli, a seconda dei siti e il disegno sperimentale). <ol><li> Impostare il limite di inizio per il montaggio per iniziare dopo la finedell&#39;impulso laser. Utilizzare questo stesso punto di inizio per tutti i raccordi curve successive. </li><li> Nella finestra di dialogo Seleziona Funzione Fitting, selezionare decadimento esponenziale, in modo da adattare la vita per la seguente equazione per un singolo decadimento esponenziale: <img alt="Equazione 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" /> Eq. 4 dove y rappresenta l&#39;intensità di fluorescenza, y 0 rappresenta l&#39;intensità bassa a causa del rumore del sistema, A 1 è l&#39;intensità del segnale, t è la durata della fluorescenza, x è il tempo, e x 0 è l&#39;offset di tempo. </li><li> Fissare x 0 a 0, inizia il montaggio delle funzioni, e adattarsi ai dati. NOTA: Se l&#39;esperimento è progettato per avere il segnale solo da un paio di siti, i dati risultanti dovrebbero facilmente essere in forma da un unico decadimento esponenziale 8. Il residuo della forma è un buon metodo per determinare la bontà del fit e se vite decadimento aggiuntivi sono required. </li></ol></li><li> Utilizzare le vite ottenuti dai dati per calcolare la distanza tra fluorofori utilizzando l&#39;equazione Förster (un riarrangiamento di equazioni 1 e 2 di cui sopra): <img alt="Equazione 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" /> Eq. 5 NOTA: Tutte le variabili sono come sopra indicato con τ DA essendo stato misurato come la vita sensibilizzata emissione accettore. Ulteriori dettagli ed esempi sulle misure di R 0 e R possono essere trovati altrove 7,9,10. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento e analisi dei dati almeno tre volte per garantire la riproducibilità. Incoerenza tra le singole ripetizioni della stessa misura mette in discussione la validità dei dati; utilizzare esperimenti o ripetizioni di controllo supplementari. Calcola errori di misura utilizzando la calcolatrice gratuita Gustavus analisi Error (sviluppato dal Dr. Thomas Huber) o un sistema simile che si propaga l&#39;errore nellaadatta della vita. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

LRet è una potente tecnica che permette agli scienziati di misurare le distanze tra i domini all&#39;interno di una singola proteina, come pure tra subunità di una proteina multimerica. Come tale, lRet è adatto a esaminare i cambiamenti conformazionali e dinamiche di proteine ​​o altre macromolecole. Il protocollo di cui sopra dovrebbe consentire il laboratorio adeguatamente attrezzato per testare facilmente le loro ipotesi; tuttavia, ci sono molte fonti comuni di errore che possono affliggere il nuovo investigat...

Trasferimento Luminescence Resonance Energy (lRet) è un derivato del ben noto Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) tecnica 1. Simile a preoccuparsi, lRet può essere utilizzato per misurare le distanze e le variazioni di distanza tra fluorofori donatore e accettore collegati a siti specifici sulla proteina di interesse all&#39;interno della gamma di 10-100 Å 1-3. I principi della lRet sono simili a FRET dal fatto che il trasferimento di energia di risonanza si verifica tra due fluorofori prossimali quando lo spettro di emissione del fluoroforo donatore si sovrappone con lo spettro di assorbimento del fluoroforo accettore. L&#39;efficienza di questo trasferimento è correlata alla distanza tra i due fluorofori dalla seguente equazione: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> Eq. 1 dove R è la distanza tra i due fluorofori, E è l&#39;efficienza di entrasferimento ERGIA, e R 0, discusso in seguito, è il raggio Förster per la coppia fluoroforo, cioè la distanza alla quale l&#39;efficienza di trasferimento è a metà-massimale. Da questa equazione, si può vedere che l&#39;efficienza è legata alla grandezza della distanza elevato alla sesta potenza inversa 1. E &#39;questo inversa sesto dipendenza potenza che permette di FRET e misurazioni lRet essere squisitamente sensibile anche a piccole variazioni di distanza, quando nei pressi della R 0 della coppia FRET. La capacità di etichettare specificamente i siti desiderati sulle proteine ​​o altre macromolecole permette di approfittare di questa sensibilità per monitorare i cambiamenti conformazionali. Rispetto al FRET, che utilizza molecole di colorante organiche convenzionali, lRet offre ulteriori vantaggi. In lRet, invece di utilizzare un colorante organico come fluoroforo donatore, un catione serie dei lantanidi, tipicamente Tb 3+ o Eu 3 +, viene utilizzato 1,4-6. Fluorofori che cadono uTEDS questa categoria, per esempio, terbio chelato, sono anche molto versatile in quanto possono essere utilizzati con una vasta gamma di fluorofori accettori. Tale flessibilità è possibile perché gli spettri di emissione dei lantanidi chelati contenere più picchi di emissione taglienti, consentendo una singola specie di fluoroforo donatore per essere utilizzato con uno di una vasta gamma di fluorofori accettori. Così, emissione accettore sensibilizzati può essere rilevato senza alcun timore di contaminare sanguinare-through da emissioni donatore 5. Lo sperimentatore seleziona il accettore specifico in base alla distanza prevista tra i due fluorofori (Figura 1 e Tabella 1). In questi fluorofori lantanidi chelati, lo ione metallico è chelato da una molecola contenente un gruppo antenna che sensibilizza il lantanide normalmente scarsamente assorbente all&#39;eccitazione e un gruppo funzionale bioreactive per legare lo ione di un gruppo funzionale specifico sulla macromolecola 1, 5,6. Once eccitato, lantanidi rilassarsi allo stato fondamentale mediante il rilascio di fotoni, con un tasso di decadimento dell&#39;ordine del millisecondo. Poiché il decadimento è né un rilassamento singoletto a singoletto né un rilassamento tripletto a singoletto, l&#39;emissione di fotoni può non essere correttamente chiamato fluorescenza o fosforescenza, ma è più propriamente definito luminescenza 1. La lunga decadenza di lantanidi luminescenza aiuta molto nelle misurazioni a vita. Misurazioni Lifetime possono quindi essere utilizzati per determinare l&#39;efficienza tramite la seguente relazione: <img alt="Equazione 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> Eq. 2 dove E è l&#39;efficienza del trasferimento, τ D è la durata del donatore (lantanidi chelato) quando non partecipano al trasferimento di energia, e τ DA è la durata del donatore quando partecipano a trasferimento di energia con l&#39;accettore. Con lRet, τ DA possibile alin modo da misurare la durata dell&#39;emissione accettore sensibilizzata perché la vita di terbio è tanto più grande di un fluoroforo accettore organico. L&#39;accettore emette con la stessa vita come la sua eccitazione incitamento (lantanidi donatore), e qualsiasi contributo per la durata di vita propria fluorescenza intrinseca del accettore è relativamente trascurabile. Misurando l&#39;emissione sensibilizzata piuttosto che di emissione del donatore, abbiamo anche eliminare la necessità di garantire un&#39;etichettatura esattamente un rapporto 1: 1 di donatore accettore. Proteina può invece essere etichettato contemporaneamente sia con accettatore e fluorofori donatori. Una popolazione eterogenea etichetta si tradurrà, ma proteine ​​marcate doppio donatore non emette nella lunghezza d&#39;onda accettore e proteine ​​marcate doppio-accettore non sarà entusiasta. Inoltre, la distanza tra i fluorofori dovrebbe essere lo stesso, a prescindere da quale cisteina sito un determinato fluoroforo attribuisce a, soprattutto quando si utilizzano i lantanidi isotropi come un donatore, in modo che il need per specificare un determinato sito per ricevere il donatore o accettore non è necessaria. L&#39;intensità può essere affetto da una popolazione eterogenea, ma dovrebbe comunque essere più che sufficiente per essere rilevato. Nel progettare esperimenti, la scelta di fluorofori dovrebbe essere dettata dal valore R 0 della coppia nonché nell&#39;intervallo previsto distanza da misurare. Il valore R 0 è definito dalla seguente equazione: <img alt="Equazione 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> Eq. 3 dove R 0 è il raggio Förster in Angstrom, κ 2 è il fattore di orientamento tra i due coloranti (di solito assunti per essere 2/3), φ D è la resa quantica del donatore, J è la sovrapposizione spettrale integrale tra il donatore del spettro di emissione e lo spettro di assorbimento del accettore in M - 1cm -1 nm 4, ed n è l&#39;indice di rifrazione del mezzo 1. Il nostro laboratorio ha aggiunto una modifica alla tecnica convenzionale lRet introducendo un sito di riconoscimento proteasi tra donatore e accettore siti etichette sulla proteina essendo sondato. Questa modifica permette di indagine in sistemi non-purificato come le cellule di mammifero intere 7. Questa tecnica è particolarmente utile quando si utilizzano cisteine ​​come siti per l&#39;etichettatura, poiché nel processo di etichettatura con coloranti maleimmide coniugato che si legano ai gruppi sulfidrilici cisteina, altre proteine ​​sulle cellule che hanno cisteine ​​sono inoltre classificati. Tuttavia, includendo i siti di clivaggio della proteasi sulla proteina di interesse e vite di misura prima e dopo clivaggio, lo sperimentatore può quantitativamente sottrarre il segnale di fondo dopo proteasi scissione dal segnale grezzo. Questa sottrazione isola il segnale specifico derivante dalla proteina di interesse (FigURE 2). Utilizzando la modifica sopra descritta, lRet può essere utilizzato per misurare le variazioni di distanza tra il donatore terbio chelato e la sonda accettore su una proteina, e quindi monitorare i cambiamenti conformazionali stato fisiologico prossimità della proteina senza la necessità di purificazione. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1.L spettri di assorbimento e di emissione di terbio chelato in nero, così come un accettore rappresentante, Alexa 488, in rosso. Notare i picchi di emissione più e il forte, intervallo di emissione stretto per ogni picco di terbio chelato. Questo modello permette di terbio di essere utilizzato con una varietà di fluorofori accettori e facilita la misurazione delle emissioni sensibilizzati all&#39;interno di tali intervalli in cui terbio mostra nessuna emissione. Picco di emissione di terbio a 486 nm si sovrappone abbastanza bene con l&#39;una<html> picco bsorption di Alexa 488, consentendo il trasferimento di energia di risonanza a verificarsi tra i due fluorofori. Lunghezza d&#39;onda di 515 nm è una scelta eccellente per rilevare le emissioni sensibilizzati per questa coppia, come è nella valle tra i picchi di emissione terbio, e abbastanza vicino picco di Alexa 488 di emissione di 520 nm. Si noti che essendo vicino al picco accettore, anche se auspicabile, non è necessaria-565 nm è ancora in grado di rilevare Alexa 488 emissione senza anche rilevare emissione terbio. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Fluoroforo accettore </td><td style="width:45px;"> R 0 (Å) </td><td style="width:183px;"> Emissione lunghezza d&#39;onda (nm) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Fluoresceina </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Un elenco di fluorofori accettori comunemente usati per lRet utilizzo terbio chelato come il donatore 11. I R 0 valori sono stati misurati quando il donatore e accettore sono state allegate alla agonista dominio di legame solubili dei recettori AMPA. E &#39;ideale per misurare nuovamente il valore di R 0 per ogni nuovo sistema in fase di studio. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Una panoramica del metodo lRet presentato. (A) Il recettore AMPA è una proteina di membrana che subisce cambiamenti conformazionali upon-ligando. Il ligando-bi-a forma di conchiglianding dominio è cerchiata in rosso qui. (B) Il dominio ligand-legame di AMPA quando non si lega alle proteine ​​esiste in una conformazione aperta (a sinistra). Quando è legato al ligand glutammato, la proteina chiude attorno al suo ligando (a destra). Inserendo fluorofori in siti probatori sul LBD, la natura di questo cambiamento conformazionale può essere visto come la distanza tra i fluorofori modifiche, che poi incidere durata della fluorescenza. (C) Quando etichettatura cellule intere, l&#39;etichettatura sia della proteina di interesse così come le proteine ​​di membrana sfondo si possono verificare (a sinistra). Dopo proteasi clivaggio, segnale lRet dalla proteina di interesse scomparirà a causa del rilascio di un frammento solubile, lasciando intatto sfondo segnale (a destra). Questo segnale di fondo può essere sottratto dal segnale grezzo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

Trasferimento Luminescence Resonance Energy, o lRet, è una potente tecnica utilizzata per misurare le distanze tra due siti nelle proteine ​​all&#39;interno della gamma distanza di 10-100 Å. Misurando le distanze in diverse condizioni legatura, cambiamenti conformazionali della proteina possono essere facilmente valutati. Con lRet, un lantanidi, terbio il più delle volte chelato, è utilizzato come fluoroforo donatore, offrendo vantaggi quali una maggiore durata unico donatore-emissione, la flessibilità di utilizzare più fluorofori accettore, e la possibilità di rilevare le emissioni accettore sensibilizzata come un modo semplice misurare trasferimento di energia senza il rischio di rilevare anche solo segnali donatori. Qui, descriviamo un metodo per utilizzare lRet sulle proteine ​​di membrana espresse e testati sulla superficie delle cellule di mammifero intatte. Introduciamo un sito proteasi scissione tra la coppia fluoroforo lRet. Dopo aver ottenuto il segnale lRet originale, scissione in quel sito rimuove il segnale lRet specifica proteina diinteresse che ci permette di sottrarre quantitativamente il segnale di fondo che rimane dopo la scissione. Questo metodo consente una più fisiologicamente rilevanti misurazioni da effettuare, senza la necessità di purificazione di proteine.

Una misurazione lRet successo con un donatore lantanide dovrebbe avere un donatore solo vita nell&#39;intervallo di tempo millisecondi. La durata di emissione lRet sensibilizzati per la proteina marcata con sia il donatore e l&#39;accettore sarà notevolmente più breve, con una durata nel range microsecondo dopo sottrazione del fondo Figura 3. Proteasi risultati scissione in un aumento della vita che dovrebbe diventare stabile nel tempo ( cioè cambiando non più), mostrando che la scissione d...

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Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Descriviamo qui un metodo migliorato di trasferimento Luminescence Resonance Energy (lRet) dove introduciamo un sito proteasi scissione tra i siti fluoroforo donatore e accettore. Questa modifica ci permette di ottenere segnali lRet specifici derivanti dalle proteine ​​di membrana di interesse, consentendo lo studio di proteine ​​di membrana, senza purificazione della proteina.

Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine ​​espresse in cellule di mammifero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K Views.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Descriviamo qui un metodo migliorato di trasferimento Luminescence Resonance Energy (lRet) dove introduciamo un sito proteasi scissione tra i siti fluoroforo donatore e accettore. Questa modifica ci permette di ottenere segnali lRet specifici derivanti dalle proteine ​​di membrana di interesse, consentendo lo studio di proteine ​​di membrana, senza purificazione della proteina. 

Video: Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

Visualizzazione proteine ​​e complessi macromolecolari di Negative EM Stain: dalla preparazione alla griglia Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Ricerca

Bioingegneria

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) analisi per la determinazione della proteasi SENP1 Cinetica

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Un protocollo per l&#39;utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Un orbitale scuotendo la coltura di cellule di mammifero in vasi O a forma di produrre aggregati uniformi

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine ​​espresse in cellule di mammifero

Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine espresse in cellule di mammifero