The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

הפרוטוקול הבא תואם את ההנחיות של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושר על ידי הפקולטה לרפואה וטיפול בבעלי חיים ועדת רוקחות באוניברסיטת טורונטו. .1 הכינו חובה ריאגנטים כפי שהיא מתוארת בטבלה 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פרוטאז וphosphatase (במידת צורך) מעכבים לכל פתרונות, מאגרי סוכרוז וDDH 2 O בריכוזים המפורטים בטבלה 1. חשוב: בצע את כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס וטרום מגניב כל חומרים כימיים והציוד לפני תחילת הניסוי. לייבל כל הצינורות, כולל צינורות ultracentrifuge, עם סמן קבוע. </li></ol> .2 Dissection של מוח האזור המתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב בעלי החיים על ידי עקירה או עריפת ראש בצוואר הרחם. בית ולהרדים חיות בהתאם למדיניות מוסדית וממשלתית בטיפול בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות להסיר את המוח דואר מהגולגולת ומניחים על בלוק נתיחה מצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האזור במוח המתאים מרקמות טריות והמשך לשלב 3. </li></ol> Homogenization רקמות .3 עם זכוכית הטפלון Homogenizer מנוע מונע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 50-100 מ&quot;ג (לSPM), או 100-200 מ&quot;ג (לPSD) של הרקמה גזור בצינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל שכותרת המכיל 4 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M. להעביר את המדגם למטחנה / homogenizer רקמת זכוכית טפלון מחודד 15 מ&quot;ל, להגדיר את כונן מנוע ל900 סל&quot;ד (הגדרת 7) וhomogenize המדגם עם 12 משיכות במשך תקופה 30 שניות. השתמש homogenizer זכוכית טפלון שונה בין דגימות, או לשטוף את homogenizer עם מים מזוקקים קרים בין דגימות ולנגב יבשים עם Kimwipe. הערה: עד 4 גרם של רקמה ניתן הומוגני ב4 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M, עם זאת רצוי להשתמש בפחות רקמה כדי להבטיח חלוקה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המדגם הומוגני בחזרה to באותו צינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל. מילואים של homogenate וחנות 100 μl ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם מערבי בסך הכל חלק קטן חלבון. </li></ol> .4 מהירות נמוכה צנטריפוגה להסיר חלק הגרעיני (תשואות Supernatant S1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate בהרוטור זווית קבועה ב900 XG 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant (S1) לחדש, שכותרתו 13 צינור מ&quot;ל וresuspend גלולה שבריר הגרעיני (P1) ב500 μl של 0.32 סוכרוז HEPES שנאגר M. הערה: החלק (P1) יכול להיות מאוחסן על -80 מעלות צלזיוס ומשמש לניתוח כתם מערבי של השבר הגרעיני. </li></ol> .5 העשרה של חלק הגולמי Synaptosomal (תשואות גלולה P2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant (S1) ב 10,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant (S2) ובמילואים 500 μl בצינור microcentrifuge לאחסן ב-80 ° C לקוואנט חלבון שלאחר מכןification וניתוח כתם מערבי של cytosolic / חלק קרום האור. Resuspend גלולה שנותר synaptosomal הגולמי שבריר (P2) ב1 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 0.32 M ולאחר מכן להוסיף עוד פתרון סוכרוז HEPES שנאגר 3 מ&quot;ל של 0.32 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g x 10,000 ל15 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant (S2 &#39;) וμl 500 מילואים בצינור microcentrifuge לאחסן ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם המערבי של cytosolic / חלק קרום האור. להציל את כדור synaptosomal הגולמי שטף (P2 &#39;) בצינור פוליפרופילן. </li></ol> .6 Lysing (Hypoosmotic הלם) של חלק הגולמי Synaptosomal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse גלולה synaptosomal הגולמי (P2 &#39;) בצינור פוליפרופילן על ידי resuspending זה ב 1 מ&quot;ל של DDH 2 O. להוסיף עוד 3 מ&quot;ל של DDH 2 O, להעביר לhomogenizer רקמת זכוכית טפלון, וhomogenize ביד עם 3 משיכות. הערה: חשובלבצע שלב זה במהירות אפשרית ובמהירות המשך לשלב 6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות מhomogenizer בחזרה לתוך צינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל ובמהירות להתאים את המדגם חזרה ל4 HEPES מ&quot;מ עם 16 μl של 1 פתרון M HEPES, להפוך לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב דגימות על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להבטיח lysing מלא. </li></ol> .7 העשרה של חלק Synaptosomal ממברנה (P3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g x 25,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant הגולמי לפוחי שבריר (S3) ולהזמין אותו בצינור 5 מ&quot;ל לאחסון ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם מערבי. Resuspend חלק קרום synaptosomal (P3) ב 1 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M. </li></ol> .8 הכנת רציף סוכרוז Gradient <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet בדיוק 3.5 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.2 M ובדיוק 3.0 מ&quot;ל כל אחד מ1.0 M ו0.8 M HEPEתמיסת סוכרוז נאגר S לתוך נפרד 6 מ&quot;ל הצמד צינורות כובע. הערה: זה נעשה מראש למדוד את ההיקפים של המאגרים הנמצאים בשימוש על מנת להפוך את שיפוע סוכרוז. מדידה מדויקת של הכמויות חשוב לוודא שהשיפועים וכתוצאה מכך יהיו מאוזנת לultracentrifugation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet פסטר זכוכית ונורה, להעביר 1.2 M-נאגר HEPES תמיסת סוכרוז ל12 מ&quot;ל צינור ultracentrifuge polyallomer. שכבה בזהירות את תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M על גבי תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.2 M. לבסוף, שכבת תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 0.8 M על גבי תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M. השתמש pipet פסטר טרי עבור כל תמיסת סוכרוז ודואג שלא להפריע את שיפוע סוכרוז. תנודות ממערבולת ספסל או microcentrifuge יפריעו את השלמות של השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet פסטר, שכבת שבריר synaptosomal resuspended הקרום (P3) על גבי שיפוע סוכרוז רציף מוכן.ודא שההדרגות מאוזנת במשקלם בתוך הדלי של הרוטור דלי מתנדנד. אם הדליים אינם מאוזנים, להשתמש pipet P200 להוסיף בזהירות 0.32 סוכרוז HEPES שנאגר M לחלק העליון של השיפוע ולאזן את דליי הרוטור. </li></ol> .9 פלזמה של Synaptic פלזמה ממברנה (SPM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ברוטור מתנדנד דלי ב150,000 XG לשעה 2 ב 4 ° C.. מוציא בזהירות את שיפועי סוכרוז מדליי ultracentrifuge. באמצעות מחט G 18 ומזרק 1 מ&quot;ל, לנקב את הצינור בחלק התחתון של שלבי הביניים פתרון סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M / M 1.2 ולמשוך את השכבה הסינפטית קרום פלזמה (SPM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום לעצמך את עוצמת הקול שכל דגימת SPM תופסת במזרק 1 מ&quot;ל. מניחים את שכבת SPM שנאסף בצינורות ultracentrifuge עבה קיר 3.5 מ&quot;ל, להוסיף בדיוק 2.5 כרכים של 4 HEPES מ&quot;מ כדי להתאים את ריכוז סוכרוז מ1.2 M ל0.32 מ &#39;ברגע שכל דגימה הייתה להתאיםed ל0.32 M סוכרוז, לאזן את הצינורות עם 0.32 תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge בהרוטור זווית קבוע ב200,000 XG ל30 דקות ב 4 ° C. להסיר ולסלק supernatant. Resuspend גלולה קרום פלזמה הסינפטי (SPM) ב300 μl של 50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. דגימות חנות ב -80 ° C עד המשמשות למערביות סופג. </li></ol> 10. הכנת חלק צפיפות Postsynaptic (PSD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר דגימות SPM על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון של 0.54% טריטון X-100 ב50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 5 מ&quot;ל קלקר, לשלב 2.7 מ&quot;ל של-100 X / שבריר טריטון HEPES / פתרון EDTA ו300 μl SPM ולסובב את המדגם עבור 15 דקות ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות ל3.5 מ&quot;ל צינורות ultracentrifuge עבה קיר ודגימות צנטריפוגות ב XG 32,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומרים לעצמנו את supernatant (טריטון X-100 חלק מסיס [TS]) ולאחסן ב -80; ° C. הערה: בשלב זה, את הכדור מייצג את החלק היחסי &quot;PSD-1T&quot;. טיפול שני עם חומר ניקוי יהיה לייצר חלק &quot;PSD-2T&quot;. אם חלק PSD-1T הוא רצוי, המשך לשלב 10.6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר חלק PSD-2T, resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של .0.5% טריטון X-100 ב50 HEPES מ&quot;מ / 2 פתרון mM EDTA. סובב דגימות ל15 דקות ב 4 ° C.. צנטריפוגה דגימות 32,000 XG ל20 דקות ב 4 ° C והמשיכו לשלב 10.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspend גלולה postsynaptic (PSD) ב50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. הערה: resuspension הנפח עשוי להיות תלוי בגודל של גלולה; נפח של 50-75 μl מומלץ. בגלל חלק PSD הוא חלק חומר ניקוי מסיס, זה לעתים קרובות יש צורך להוסיף 1-2 μl של .0.5% SDS כדי לאפשר resuspension של חלבון מלא. דגימות חנות ב -80 ° C עד המשמשות למערביות סופג. </li></ol>

<ol>
	<li>Delint-Ramirez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+composition+of+NMDA+receptor+signaling+complexes+differs+between+membrane+subdomains+and+is+modulated+by+PSD-95+and+PSD-93.">In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psychiatric+disease+risk+factors+DISC1+and+TNIK+interact+to+regulate+synapse+composition+and+function.">The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function.</a> Mol Psychiatry. 16, (2010).</li><li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinsertion+or+degradation+of+AMPA+receptors+determined+by+activity-dependent+endocytic+sorting.">Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting.</a> Neuron. 28, 511-525 (2000).</li><li>Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interaction+of+stargazin-like+TARPs+with+cycling+AMPA+receptors+at+synapses.">Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses.</a> Science. 303, 1508-1511 (2004).</li><li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity.">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54, 447-460 (2007).</li><li>Bats, C., Groc, L., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Stargazin+and+PSD-95+regulates+AMPA+receptor+surface+trafficking.">The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking.</a> Neuron. 53, 719-734 (2007).</li><li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+level+controls+postsynaptic+composition+and+signaling+via+the+ubiquitin-proteasome+system.">Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system.</a> Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).</li><li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles.">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li><li>Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+enzymic+studies+of+cholinergic+and+non-cholinergic+synaptic+membranes+isolated+from+brain+cortex.">Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+an+electron-microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Cotman, C. W., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structural+studies+on+synaptic+complexes+from+rat+brain.">Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain.</a> J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).</li><li>Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+postsynaptic+densities+from+rat+brain.">Isolation of postsynaptic densities from rat brain.</a> The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).</li><li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions:+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities.">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).</li><li>Jones, D. H., Matus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+synaptic+plasma+membrane+from+brain+by+combined+flotation-sedimentation+density+gradient+centrifugation.">Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation.</a> Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).</li><li>Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+immunochemical+evidence+that+the+"major+postsynaptic+density+protein"+is+a+subunit+of+a+calmodulin-dependent+protein+kinase.">Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).</li><li>Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+tyrosine-phosphorylated+protein+in+the+postsynaptic+density+fraction+is+N-methyl-D-aspartate+receptor+subunit+2B.">The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Ma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-induced+Gadd45b+promotes+epigenetic+DNA+demethylation+and+adult+neurogenesis.">Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis.</a> Science. 323, 1074-1077 (2009).</li><li>Budreck, E. C., Scheiffele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin-3+is+a+neuronal+adhesion+protein+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arc/Arg3.1+regulates+an+endosomal+pathway+essential+for+activity-dependent+beta-amyloid+generation.">Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation.</a> Cell. 147, 615-628 (2011).</li><li>Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsin+I+(protein+I),+a+nerve+terminal-specific+phosphoprotein.+III.+Its+association+with+synaptic+vesicles+studied+in+a+highly+purified+synaptic+vesicle+preparation.">Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation.</a> J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).</li><li>Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+characterization+of+synaptic+vesicles+of+high+purity.">The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity.</a> Brain Res. 109, 285-309 (1976).</li><li>Cheng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+and+absolute+quantification+of+postsynaptic+density+proteome+isolated+from+rat+forebrain+and+cerebellum.">Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).</li><li>Sheng, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postsynaptic+architecture+of+excitatory+synapses:+a+more+quantitative+view.">The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view.</a> Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Eggena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+histone+H1+as+a+cognate+antigen+of+the+ulcerative+colitis-associated+marker+antibody+pANCA.">Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA.</a> J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homodimerization+of+the+beta2-adrenergic+receptor+as+a+prerequisite+for+cell+surface+targeting.">Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting.</a> J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).</li><li>Bernocco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+detergent+fractionation+of+primary+neurons+for+proteomics+studies.">Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies.</a> Proteomics. 8, 930-938 (2008).</li><li>Grunewald, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+and+cytosolic+overexpression+of+LASP-1+correlates+with+tumor+size+and+nodal-positivity+of+human+breast+carcinoma.">Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 7, 198 (2007).</li><li>Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+isoforms+of+actin-binding+proteins+on+distinct+populations+of+Golgi-derived+vesicles.">Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles.</a> J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).</li><li>Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+scaffolds+for+nicotinic+receptors+on+neurons.">Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons.</a> Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).</li><li>Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells.">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li><li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner:+conserved+Pex5p+WXXXF/Y+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import.">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li><li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis.">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li><li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

יש כמה שלבים בהליך שהם קריטיים לתוצאה מוצלחת. בשלב 3, חשובה שמידת הומוגניות עקבית מושגת עבור כל דגימה. כאשר מאחד רקמה עם homogenizer המנוע מונע, מהירות קבועה משמשת לא רק לסיבוב של העלי, אלא גם עם מספר משיכות. זמן הדגירה בהלם אוסמוטי צריך להיות מדויק, שכן יצירת הומוגניות או דג?...

נוירונים לתקשר באמצעות סינפסות, ואיכות תקשורת זה מוסדרת במידה רבה על ידי שינויים בהרכב החלבונים בסינפסה. בפרט, החלבונים הממוקמים בצפיפות פוסט סינפטי להשתתף בתקשורת עצבית על ידי קולטני הנוירוטרנסמיטר אינטימי פיגומים עם מערכות העברת האותות שלהם 1. יתר על כן, שינויים מתמשכים בכוחו של היעילות הסינפטית נשלטים על ידי התוספת או גריעה של קולטנים בצפיפות פוסט סינפטי 1-6. לכן, הבידוד והכימות של חלבונים סינפטיים הוא טכניקה הכרחית ושימושית כדי לקבל תובנה הדרכים שנוירונים מגיבים לגירויים ולשנות יעילות הסינפטית 7. מאמר זה מתאר טכניקה נפוצה לבודד חלבונים סינפטיים מרקמת המוח של מכרסמים על ידי ultracentrifugation על הדרגתיים סוכרוז רציף. חלק קרום פלזמה הסינפטי יכול להיות מועשר ומבודד המבוסס עלצפיפותה בסוכרוז, שנקבע באופן אמפירי להיות דומה ל1.2 M סוכרוז. בהתאם לשאלה הביולוגית, ניתן להפריד שברים subcellular על ידי הדרגתיים רציף או רציף של שני סוכרוז או Percoll. הדרגתיים רציף יאפשר להפרדת חלבונים לשברים מרובים; זו יכולה להיות שימושית במיוחד כדי להדגים את שיתוף הלוקליזציה של חלבונים בתוך שבריר נתון 8. עם זאת, הכנת הדרגתיים רציף היא מפרכת יותר, ואין צורך ליישומים רבים. הדרגתיים רציף קלים יותר יחסית להכנה וניתן להשתמש בם כדי להפריד בין חלבונים לכמה שברים, בדרך כלל מוגדרים. הדרגתיים רציף שמורכבים משלוש שכבות סוכרוז של molarity הגדלת היה בשימוש נרחב לבודד את חלבונים הקשורים לממברנה הסינפטי הפלזמה (SPM). חלק קרום פלזמה הסינפטי זה יכול להיות מעובד בהמשך לfractio צפיפות פוסט סינפטיn (PSD) על ידי טיפול בחומר ניקוי ובידוד של חלק חומר הניקוי מסיס. כאשר תהליך זה תואר לראשונה בשנתי ה -1960 9,10, במיקרוסקופ אלקטרונים שימש כדי להדגים את האברונים וקרומים כי בערך להגדיר את קרום הפלזמה הסינפטי ושברים צפיפות פוסט סינפטי 9-14. מחקרים אלה הוכיחו את ההכללה של ממברנות של לפני ואחרי הסינפטי ושלפוחית ​​סינפטית בשבריר SPM; לאחר טיפול חומר ניקוי בעיקר האלקטרונים צפופים, צפיפות פוסט סינפטי היתה גלויות לעין. בהליך, הלם hypotonic משמש ללצבוט את התהליכים סינפטיים מהגוף התא 10. צעד זה מנצל את העובדה שהמיטוכונדריה הן עמידה יותר בפני זעזועים האוסמוטי ונותרה על כנן, ולכן הם המשקע בתחתית שיפוע סוכרוז (איור 1). שימוש באותה טכניקת העשרה זו, שברי SPM וPSD היו ראשון ביוכימיתשהוגדר על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ורצף של רכיבי החלבון העיקריים 15-17. ניתוח כתם בהמשך המערבי נעשה שימוש כדי לזהות ולכמת את הרמות של חלבונים סינפטיים ועוד להגדיר שברים אלה (איור 2). יש לנו להשתמש בטכניקה זו במעבדות שלנו לכמת את השינויים ברמות הסינפטי של טרנספורטר דופאמין המתרחשות כאשר מוקד Slc6a3 משוכפל בעכברים 18. יש לנו גם השתמשתי בטכניקה זו בעכברים חסרי קולטן NMDA לחשוף ירידות סינפסה הספציפית בחלבונים שהם חלק מinteractome DISC1 19. זה בא לידי ביטוי מניתוח כתם מערבי שברי SPM מכילים חלבונים סינפטיים קרום שלפוחית, סמני endosome, חלבוני המיטוכונדריה, אנזימים סינטטיים קרום הקשורים ומולקולות הולכים אותות, כמו גם רכיבים נפרד מצפיפות פוסט סינפטי וממברנות פלזמה הסינפטי 20-23. Eשברים PSD ven יכולים להיות זיהום עם חלבוני המיטוכונדריה בשפע וייתכן שיהיה צורך לבצע שקיעת שיפוע שנייה או שלבים לטיהור נוספים כדי להסיר אותם 13. לאחרונה, ספקטרומטריית מסה כמותית סיפקה רשימה של מעל 100 חלבונים בצפיפות פוסט סינפטי לבד, כמו גם אינדיקציה לשפע היחסי של רכיבים אלה 24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">1M HEPES, pH 7.4</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">HEP003.100</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">HEPES</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">HEP001.500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">EDTA</td>
			<td style="width:129px;">BioBasic</td>
			<td style="width:111px;">EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">PMSF</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">PMS123.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">APR600.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">LEU001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">PEP605.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Benzamidine</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">BEN601.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">SFL001.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Sodium pyrophosphate</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">SPP310.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">SOV664.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">GYP001.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">BioShop</td>
			<td style="width:111px;">TRX506.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">18G x 1 &#189;&#8221; needle</td>
			<td style="width:129px;">BD</td>
			<td style="width:111px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">1cc syringe</td>
			<td style="width:129px;">BD</td>
			<td style="width:111px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">KT885450-0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">IKA Model RW 16 Basic Stirrer</td>
			<td style="width:129px;">IKA Works</td>
			<td style="width:111px;">2572100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:129px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:111px;">29017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:129px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:111px;">46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL)</td>
			<td style="width:129px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket</td>
			<td style="width:129px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:129px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL)</td>
			<td style="width:129px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">349622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">TLA-100.3 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:129px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">349481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:261px;">Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:129px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

טכניקות חלוקה subcellular עצביות מאפשרות כימות של חלבונים שנסחרים ומסינפסה. כפי שתואר במקור בשנתי ה -1960 מאוחר, חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי יכולים להיות מבודדים על ידי ultracentrifugation בשיפוע צפיפות סוכרוז. ברגע שקרומים הסינפטי מבודדים, המורכב macromolecular ידוע כצפיפות פוסט סינפטי יכול להיות מבודד לאחר מכן בשל insolubility חומר הניקוי שלה. הטכניקות המשמשות כדי לבודד ממברנות פלזמה הסינפטי וחלבוני צפיפות פוסט סינפטי יישארו זהה במהות לאחר 40 שנים, ונמצאות בשימוש נרחב במחקר מדעי המוח נוכחי. מאמר זה מפרט את חלוקה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי וצפיפות פוסט סינפטי באמצעות שיפוע סוכרוז רציף. הכנות חלבון וכתוצאה מכך מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת שיפוע צפיפות סוכרוז צריכה לגרום להפרדה ברורה של שלושה פתרונות הטוחנות של סוכרוז (0.8, 1.0, ו1.2 M סוכרוז). ראה איור 3 א לדוגמא של השיפוע לפני מדגם החלבון הוא הוסיף. אם השיפוע מוכן יותר מדי מראש, או אם הוא מוכן על משטח ספסל עם רטט מציוד אחר, השיפוע יהיה בסכנה והפרד...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient at JoVE.com

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.0K Views.  University of Toronto.  מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE. 

Video: Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

ממברנה פוטנציאלים, התגובות Synaptic, המעגלים הנוירונים, Neuromodulation ו היסטולוגיה שרירים שימוש סרטן הנהרות: מעבדה תרגילים סטודנטים

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

שיטה כללית להערכת דגירה של השתוקקות סוכרוז בחולדות

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.