Name: preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
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The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

Das folgende Protokoll entspricht den Richtlinien des Canadian Council der Tierpflege und wurde von der Fakultät für Medizin und Pharmazie Animal Care Committee an der Universität von Toronto genehmigt worden. 1. Bereiten Sie benötigten Reagenzien, wie in Tabelle 1 beschrieben, <ol><li> Hinzufügen Protease und Phosphatase (falls erforderlich) Inhibitoren für alle Saccharoselösungen, Puffer und ddH 2 O, die in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen. Wichtig: Führen alle Schritte bei 4 ° C und vor-kühlen alle Reagenzien und Ausrüstung vor dem Start des Experiments. Kennzeichnen Sie alle Rohre, einschließlich Ultrazentrifuge Rohre, mit Permanentmarker. </li></ol> 2. Präparation der entsprechende Hirnregion <ol><li> Opfern das Tier durch Genickbruch oder Enthauptung. Haus und einschläfern Tiere in Einklang mit den institutionellen und Regierungspolitik auf die Tierpflege. </li><li> Schnell zu entfernen the Gehirn aus dem Schädel und Platz auf einer gekühlten Dissektion Block. </li><li> Präparieren Sie die entsprechende Hirnregion aus frischem Gewebe und fahren Sie mit Schritt 3 fort. </li></ol> 3. Gewebehomogenisierung mit Motor Driven Glas-Teflon-Homogenisator <ol><li> Zeigen 50-100 mg (für SPM) oder 100-200 mg (PSD) des sezierten Gewebe in einem markierten 13 ml Polypropylen-Röhrchen mit 4 ml 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung. Übertragen Sie die Probe in ein 15 ml Glas-Kegel Teflon Gewebemühle / Homogenisator, stellen Sie den Motorantrieb bis 900 Umdrehungen pro Minute (Stufe 7) und homogenisieren die Probe mit 12 Schlägen über einen Zeitraum von 30 Sekunden. Verwenden Sie eine andere Glas-Teflon-Homogenisator zwischen den Proben, oder spülen Sie den Homogenisator mit kaltem destilliertem Wasser zwischen den Proben und wischen Sie mit einem trockenen Kimwipe. HINWEIS: Bis zu 4 g Gewebe kann in 4 ml 0,32 M HEPES-gepufferten Saccharoselösung homogenisiert werden jedoch ratsam, weniger Gewebe verwenden, um die richtige Fraktionierung gewährleisten, ist es. </li><li> Übertragen Sie die Probe homogenisiert zurück to die gleiche 13 ml Polypropylen-Röhrchen. Reserve 100 ul Homogenat und bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse des Gesamtproteinfraktion. </li></ol> 4. Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, um die Kernfraktion entfernen (Renditen Überstand S1) <ol><li> Zentrifuge das Homogenat in einem Festwinkelrotor bei 900 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Den Überstand (S1) zu einem neuen, markierten 13-ml-Röhrchen und resuspendieren Kernfraktion Pellet (P1) in 500 ul 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose. HINWEIS: Die (P1) Fraktion kann bei -80 ° C gelagert und für die Western-Blot-Analyse der Kernfraktion benutzt werden. </li></ol> 5. Anreicherung des Crude Synaptosomale Fraktion (Pellet Renditen P2) <ol><li> Zentrifugieren der Überstand (S1) bei 10.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. Entfernen Sie den Überstand (S2) und Reserve 500 ul in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 ° C für die spätere Protein Quant speichernkation und Western-Blot-Analyse der cytosolischen / Licht Membranfraktion. Resuspendieren verbleibende rohe synaptosomale Fraktion Pellet (P2) in 1 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung und dann einen weiteren 3 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. </li><li> Zentrifuge bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C ist. Den Überstand (S2) und Reserve 500 ul in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse der cytosolischen / Licht Membranfraktion zu speichern. Speichern Sie die gewaschene rohe synaptosomale Pellet (P2 &#39;) in der Polypropylen-Röhrchen. </li></ol> 6. Lysing (Hypoosmotische Shock) der rohen Synaptosomale Fraktion <ol><li> Lyse der rohe synaptosomale Pellet (P2 &#39;) in Polypropylenröhrchen durch Resuspendieren in 1 ml ddH 2 O. Fügen Sie weitere 3 ml ddH2O, Transfer zu einem Glas-Teflon-Gewebe-Homogenisator und homogenisieren von Hand mit 3 Schlägen. HINWEIS: Es ist wichtig,diesen Schritt so schnell wie möglich durchzuführen und schnell gehen Sie zu Schritt 6.2. </li><li> Übertragungs Proben aus dem Homogenisator in denselben 13 ml Polypropylenröhrchen und schnell einstellen Probe wieder auf 4 mM HEPES mit 16 ul 1 M HEPES-Lösung zum Mischen umgekehrt. </li><li> Drehen Proben bei 4 ° C für 30 Minuten, um eine vollständige Lyse sicherzustellen. </li></ol> 7. Anreicherung des Synaptosomale Membranfraktion (P3) <ol><li> Zentrifuge bei 25.000 x g für 20 min bei 4 ° C ist. Entfernen des rohen vesikulären Fraktion Stand (S3) und behalten sie in einem 5-ml-Röhrchen bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse zu speichern. Resuspendieren synaptosomalen Membranfraktion (P3) in 1 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. </li></ol> 8. Vorbereitung der diskontinuierlichen Saccharosegradienten <ol><li> Pipette genau 3,5 ml 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung und exakt 3,0 ml von 1,0 M und 0,8 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung in separate 6 ml Snap Cap Röhren. ANMERKUNG: Dies geschieht vor Messung der Volumina der Puffer, die verwendet werden, um den Saccharose-Gradienten bilden. Genaue Messung der Volumina ist wichtig, um sicherzustellen, dass die resultierenden Verläufe für Ultrazentrifugation ausgeglichen werden. </li><li> Mit einer Glaspasteurpipette und Birne, übertragen 1.2 M HEPES-gepufferten Saccharoselösung zu den 12 ml Polyallomer Ultrazentrifugenröhrchen. Schicht sorgfältig die 1,0 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung auf der Oberseite der 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. Schließlich Schicht das 0,8 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung auf der Oberseite der 1,0 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. Verwenden Sie eine frische Pasteur-Pipette für jedes Saccharose-Lösung und kümmern uns nicht um die Saccharose-Gradienten zu stören. Vibrationen von einer Bank oder Mikrowirbel wird die Integrität des Gradienten zu stören. </li><li> Verwendung einer Pasteur-Pipette resuspendiert Schicht die synaptosomale Membranfraktion (P3) auf der Oberseite des vorbereiteten diskontinuierlichen Saccharosegradienten.Stellen Sie sicher, dass die Gradienten durch Wiegen sie in den Eimer des Schwingbecherrotor ausgeglichen. Wenn die Eimer nicht ausgeglichen sind, verwenden Sie ein P200-Pipette vorsichtig hinzufügen 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose an die Spitze des Gradienten und das Gleichgewicht der Rotorschaufeln. </li></ol> 9. Fraktionierung der synaptischen Plasmamembran (SPM) <ol><li> Ultrazentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor bei 150.000 × g für 2 h bei 4 ° C ist. Die Saccharose-Gradienten vorsichtig aus dem Eimer Ultrazentrifuge. Verwendung einer 18 G-Nadel und einer 1 ml-Spritze durchstoßen das Rohr an der Unterseite der 1,0 M / 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung Interphase und zieht die synaptischen Plasmamembranschicht (SPM). </li><li> Notieren Sie sich die Lautstärke, die jedes SPM Probe in der 1 ml Spritze einnimmt. Legen Sie die gesammelten SPM Schicht in 3,5 ml dickwandigen Rohren Ultrazentrifuge, fügen Sie genau 2,5 Volumen 4 mM HEPES, um die Saccharose-Konzentration von 1,2 m bis 0,32 M. einstellen Sobald jeder Probe wurde einstellened auf 0,32 M Saccharose, mit 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung das Gleichgewicht der Rohre. </li><li> Ultrazentrifuge in einem Festwinkelrotor bei 200.000 × g für 30 min bei 4 ° C ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren synaptischen Plasmamembranpellet (SPM) in 300 ul 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. Proben bei -80 ° C bis zur Western-Blot verwendet. </li></ol> 10. Herstellung der postsynaptischen Dichte Fraktion (PSD) <ol><li> Auftauen SPM Proben auf Eis. </li><li> Machen Sie eine Lösung von 0,54% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. </li><li> In einem 5 ml-Polystyrolröhrchen, kombinieren 2,7 ml Triton X-100 / HEPES / EDTA-Lösung und 300 ul SPM Fraktion und Drehen der Probe für 15 min bei 4 ° C </li><li> Übertragungs Proben zu 3,5 ml dickwandiger Rohre Ultrazentrifuge und Zentrifugenproben bei 32.000 × g für 20 min bei 4 ° C ist. </li><li> Reservieren Sie den Überstand (Triton X-100 löslichen Fraktion [TS]) und bei -80, ° C. HINWEIS: In dieser Stufe wird das Pellet stellt die &quot;PSD-1T&quot; Fraktion. Eine zweite Behandlung mit Reinigungsmittel ein &quot;PSD-2T&quot; Fraktion zu produzieren. Wenn eine PSD-1T-Fraktion gewünscht wird, gehen Sie zu Schritt 10.6. <ol><li> Um ein PSD-2T Fraktion produzieren, das Pellet in 3 ml 0,5% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. Drehen Proben für 15 min bei 4 ° C ist. Zentrifugieren Sie die Proben bei 32.000 g für 20 min bei 4 ° C und gehen Sie zu Schritt 10.6. </li></ol></li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren postsynaptischen (PSD) Pellet in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. HINWEIS: Die Resuspension Volumen kann von der Größe der Pellets ab; ein Volumen von 50-75 ul empfohlen. Weil der PSD-Fraktion eine Waschmittel-unlöslichen Fraktion, ist es oft notwendig, 1-2 ul 0,5% SDS in den vollständigen Resuspendierung des Proteins zu ermöglichen. Proben bei -80 ° C bis zur Western-Blot verwendet. </li></ol>

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E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells.">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li><li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner:+conserved+Pex5p+WXXXF/Y+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import.">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li><li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis.">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li><li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Es gibt mehrere Schritte in der Prozedur, die entscheidend für ein erfolgreiches Ergebnis sind. In Schritt 3 ist es wichtig, dass ein gleichmäßiger Grad der Homogenisierung wird für jede Probe erreicht. Beim Homogenisieren Gewebe mit dem Motor angetrieben Homogenisator wird eine konstante Geschwindigkeit nicht nur für die Drehbewegung des Stößels, sondern auch mit der Anzahl von Hüben. Die Inkubationszeit bei der osmotischen Schock sollten präzise sein, da längere Homogenisierung oder Inkubation in der hypoton...

Neuronen kommunizieren über Synapsen und die Qualität dieser Kommunikation wird durch Veränderungen in der Zusammensetzung der Proteine ​​an der Synapse weitgehend reguliert. Insbesondere die Proteine ​​in der postsynaptischen Dichte liegt in der neuronalen Kommunikation teilnehmen, die durch inniges Gerüst Neurotransmitter-Rezeptoren mit ihren Signalübertragungssysteme 1. Weiterhin sind dauerhafte Änderungen in der Stärke der synaptischen Wirksamkeit durch Zugabe oder Entfernung von Rezeptoren an der postsynaptischen Dichte 1-6 gesteuert. Daher ist die Isolierung und Quantifizierung der synaptischen Proteinen eine notwendige und nützliche Technik, um einen Einblick in die Möglichkeiten, die Nervenzellen reagieren auf Reize und verändern synaptischen Wirksamkeit 7 zu gewinnen. Dieser Artikel beschreibt eine übliche Technik, synaptischen Proteinen aus Hirngewebe von Nagern durch Ultrazentrifugation auf diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten zu isolieren. Die synaptischen Plasmamembranfraktion angereichert und isoliert werden, basierend aufseine Dichte in Saccharose, die empirisch bestimmt worden ist, ähnlich zu 1,2 M Saccharose ist. Je nachdem welche biologischen Frage kann subzellulären Fraktionen durch kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Gradienten von Saccharose oder Percoll getrennt werden. Kontinuierlichen Gradienten ermöglichen die Trennung von Proteinen in mehrere Fraktionen; Dies kann besonders nützlich sein, um die Co-Lokalisierung von Proteinen in einer gegebenen Fraktion 8 zeigen. Jedoch ist die Herstellung von kontinuierlichen Gradienten mühsamer und unnötig für viele Anwendungen. Diskontinuierlichen Gradienten vergleichsweise leichter herzustellen und kann verwendet werden, um Proteine ​​in wenigen, allgemein definierten Fraktionen zu trennen. Diskontinuierlichen Gradienten, der aus drei Schichten von Saccharose Erhöhung Molarität bestehen in großem Umfang verwendet, um Proteine, die mit den synaptischen Plasmamembran (SPM) zugeordnet isolieren. Diese synaptischen Plasmamembranfraktion kann weiter auf der postsynaptischen Dichte fractio verarbeitet werdenn (PSD) durch Detergensbehandlung und Isolierung der Waschmittel-unlöslichen Fraktion. Wenn dieses Verfahren wurde zuerst in den 1960er Jahren 9,10 beschrieben wurde Elektronenmikroskopie verwendet, um die Organellen und Membranen, die in etwa definieren die synaptischen Plasmamembran und postsynaptischen Dichte Fraktionen 9-14 demonstrieren. Diese Studien zeigten, die Aufnahme von prä-und postsynaptischen Membranen und synaptischen Vesikeln in der SPM-Fraktion; nach Detergens-Behandlung vor allem die Elektronendichte, waren postsynaptischen Dichten sichtbar. In dem Verfahren wird ein hypotonischen Schock verwendet, um aus dem Zellkörper 10 abzuklemmen die synaptischen Prozessen. Dieser Schritt nutzt die Tatsache, dass Mitochondrien sind resistenter gegen osmotischen Schock und intakt bleiben, so dass sie an der Unterseite des Saccharosegradienten (Figur 1) zu sedimentieren. Mit dem gleichen Anreicherungstechnik, waren die SPM und PSD-Fraktionen erste biochemischdurch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Sequenzierung der Hauptproteinkomponenten 15-17. Anschließend Western Blot-Analyse wurde verwendet, um zu detektieren und zu quantifizieren, die Pegel der synaptischen Proteinen und definieren diese Fraktionen weiter (Figur 2). Wir haben diese Technik in unseren Laboratorien verwendet, um Änderungen in der synaptischen Ebenen der Dopamin-Transporter, wenn das SLC6A3-Locus in der Maus 18 doppelt auftreten, zu quantifizieren. Wir haben auch diese Technik in NMDA-Rezeptor-defizienten Mäusen verwendet, um Synapse-spezifische Verringerung der Proteine, die Teil des DISC1 Interaktom 19 aufzudecken. Es ist aus Western-Blot-Analyse, die SPM Fraktionen enthalten synaptische Vesikel Membranproteine, Endosomen-Marker, mitochondriale Proteine, membranassoziierten synthetische Enzyme und Signaltransduktion Moleküle sowie als integrierte Komponenten der postsynaptischen Dichte und synaptischen Plasmamembranen 20-23. Even PSD Fraktionen Kontamination mit reichlich mitochondriale Proteine ​​und es kann notwendig, um einen zweiten Gradienten Sedimentation oder zusätzliche Reinigungsschritte durchzuführen, um diese 13 zu entfernen. Kürzlich wurde die quantitative Massenspektrometrie eine Liste von über 100 Proteinen in der postsynaptischen Dichte allein, sowie einen Hinweis auf die relative Menge dieser Komponenten 24,25 vorgesehen.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Model RW 16 basic stirrer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 fixed angle rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor swinging bucket</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 floor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 fixed angle rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

Neuronale subzellulärer Fraktionierung Techniken erlauben die Quantifizierung von Proteinen, die in und aus der Synapse gehandelt werden. Wie ursprünglich in den späten 1960er Jahren beschrieben, können Proteine, die mit den synaptischen Plasmamembran assoziiert durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Dichtegradienten isoliert werden. Sobald synaptischen Membranen isoliert werden, kann der makromolekularen Komplex postsynaptischen Dichte bekannt anschließend aufgrund seiner Unlöslichkeit Reinigungsmittel isoliert werden. Die zur synaptischen Plasmamembranen und postsynaptischen Dichte Proteine ​​zu isolieren Techniken im Wesentlichen gleich bleiben nach 40 Jahren, und sind weit verbreitet in der aktuellen neurowissenschaftlichen Forschung. Dieser Artikel beschreibt die Fraktionierung von Proteinen mit der synaptischen Plasmamembran und postsynaptischen Dichte mit einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Resultierenden Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.

Die Vorbereitung der Saccharosedichtegradienten sollten in einer klaren Trennung der drei Mol-Lösungen von Saccharose (0,8, 1,0 und 1,2 M Saccharose) führen. Siehe 3A ein Beispiel des Verlaufs bevor die Proteinprobe zugegeben. Wenn der Gradient zu viel im Voraus vorbereitet, oder wenn es auf einer Arbeitsfläche, mit Vibrationen von anderen Geräten hergestellt, wird der Gradient verglichen werden kann und korrekte Trennung nicht erreicht werden. Wenn eine klare Trennung der drei Lösungen nicht sicht...

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Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Dieser Artikel beschreibt die Anreicherung von Proteinen mit den synaptischen Plasmamembran durch Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Die anschließende Herstellung der postsynaptischen Dichte Proteine ​​wird ebenfalls beschrieben. Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.1K Aufrufe.  University of Toronto.  Dieser Artikel beschreibt die Anreicherung von Proteinen mit den synaptischen Plasmamembran durch Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Die anschließende Herstellung der postsynaptischen Dichte Proteine ​​wird ebenfalls beschrieben. Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse. 

Serie: Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Forschung

Biochemie

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Neurowissenschaften

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung mitochondrialer Kontaktstellen und architektonischer Einblicke 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Gehirn Membran Fraktionierung: An

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen