The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

Il seguente protocollo è conforme alle linee guida del Consiglio canadese della cura degli animali ed è stato approvato dalla Facoltà di Medicina e Farmacia Comitato cura degli animali presso l&#39;Università di Toronto. 1 Preparare Obbligatorio reagenti come descritto nella Tabella 1 <ol><li> Aggiungi proteasi e fosfatasi (se necessario) inibitori a tutte le soluzioni di saccarosio, tamponi e DDH 2 O a concentrazioni indicate nella tabella 1. Importante: eseguire tutte le operazioni a 4 ° C e pre-raffreddare tutti i reagenti e apparecchiature prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. Etichettare tutte le provette, compresi i tubi ultracentrifuga, con pennarello indelebile. </li></ol> 2 Dissezione della regione del cervello appropriata <ol><li> Sacrifica l&#39;animale da dislocazione cervicale o decapitazione. Casa e eutanasia degli animali in conformità con le politiche istituzionali e governativi sulla cura degli animali. </li><li> Rapidamente rimuovere the cervello dal cranio e posto su un blocco dissezione refrigerata. </li><li> Sezionare la regione del cervello appropriata dal tessuto fresco e procedere al passaggio 3. </li></ol> 3 Tissue omogeneizzazione con Motor Driven vetro-teflon Omogeneizzatore <ol><li> Posizionare 50-100 mg (per SPM), o 100-200 mg (per PSD) del tessuto sezionato in una etichetta 13 ml tubo di polipropilene contenente 4 ml di soluzione di saccarosio 0.32 M HEPES-buffered. Trasferire il campione in un 15 ml conica fibra di vetro-teflon smerigliatrice / omogeneizzatore, impostare l&#39;unità motore a 900 giri (impostazione 7) e omogeneizzare il campione con 12 colpi in un periodo di 30 sec. Utilizzare un diverso omogeneizzatore vetro-teflon tra i campioni, o sciacquare la omogeneizzatore con acqua distillata fredda tra i campioni e asciugare con un Kimwipe. NOTA: Fino a 4 g di tessuto può essere omogeneizzato in 4 ml di soluzione di saccarosio 0.32 M HEPES-buffered, tuttavia è consigliabile utilizzare meno tessuto per garantire il corretto frazionamento. </li><li> Trasferire il campione omogeneizzato posteriore to lo stesso tubo di polipropilene 13 ml. Riserva 100 ml di omogenato e conservare a -80 ° C per la successiva quantificazione di proteine ​​e analisi western blot della frazione totale di proteine. </li></ol> 4. bassa velocità di centrifugazione per eliminare completamente le frazioni nucleare (rendimenti supernatante S1) <ol><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato in un rotore ad angolo fisso a 900 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante (S1) per un nuovo, marcato 13 ml di tubo e risospendere il pellet frazione nucleare (P1) in 500 ml di saccarosio 0,32 M HEPES-buffered. NOTA: La (P1) frazione può essere conservato a -80 ° C ed utilizzato per l&#39;analisi western blot della frazione nucleare. </li></ol> 5. arricchimento della Frazione Crude sinaptosomale (rendimenti a pellet P2) <ol><li> Centrifugare il surnatante (S1) a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante (S2) e riserva 500 ml in una provetta per conservare a -80 ° C per la successiva proteina quantificazione e analisi western blot della frazione citosolica membrana / luce. Risospendere il pellet rimanente frazione sinaptosomale greggio (P2) in 1 ml di soluzione di saccarosio 0.32 M HEPES-buffered e poi aggiungere un&#39;altra soluzione di saccarosio 3 ml di 0,32 M HEPES-buffered. </li><li> Centrifugare a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante (S2 &#39;) e riserva 500 ml in una provetta per conservare a -80 ° C per la successiva quantificazione di proteine ​​e analisi western blot della frazione citosolica membrana / luce. Salvare il lavato sinaptosomale greggio pellet (P2 &#39;) nel tubo di polipropilene. </li></ol> 6. lisi (ipoosmotico Shock) della Frazione Crude sinaptosomale <ol><li> Lyse il pellet sinaptosomale grezzo (P2 &#39;) nel tubo di polipropilene da risospendere in 1 ml di DDH 2 O. Aggiungi un altro 3 ml di DDH 2 O, trasferimento in un omogeneizzatore tessuto di vetro-teflon, e omogeneizzare a mano con 3 colpi. NOTA: E &#39;importanteper eseguire questo passaggio il più rapidamente possibile e rapidamente passare al punto 6.2. </li><li> Campioni di trasferimento dalla omogeneizzatore nuovamente dentro lo stesso tubo di polipropilene 13 ml e regolare rapidamente il campione torna a HEPES 4 mm con 16 ml di soluzione 1 M HEPES, miscelarlo. </li><li> Ruotare i campioni a 4 ° C per 30 minuti per garantire la completa lisi. </li></ol> 7 Arricchimento della Frazione sinaptosomale membrana (P3) <ol><li> Centrifugare a 25.000 x g per 20 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante grezzo frazione vescicolare (S3) e prenotare in una provetta 5 ml di conservare a -80 ° C per la successiva quantificazione delle proteine ​​e western blot. Risospendere la frazione di membrana sinaptosomale (P3) in 1 ml di soluzione di saccarosio 0.32 M HEPES-buffered. </li></ol> 8 Preparazione del Discontinuo gradiente di saccarosio <ol><li> Dispensare esattamente 3.5 ml di soluzione di saccarosio 1,2 M HEPES-buffered ed esattamente 3.0 ml di 1,0 M e 0,8 M HEPESoluzione di saccarosio S-buffered in separati 6 ml provette con tappo a scatto. NOTA: Questo viene fatto per pre-misurare i volumi dei buffer che vengono utilizzati per rendere il gradiente di saccarosio. Misurazione esatta dei volumi è importante per garantire che i gradienti risultanti saranno bilanciati per ultracentrifugazione. </li><li> Usando una pipetta Pasteur e bulbo di vetro, trasferire 1,2 M HEPES-buffered soluzione di saccarosio a 12 ml tubo ultracentrifuge polyallomer. Strato con attenzione la soluzione di saccarosio 1.0 M HEPES-tampone sulla parte superiore della soluzione di saccarosio 1.2 M HEPES-buffered. Infine, lo strato di soluzione di saccarosio 0,8 M HEPES-tampone sulla parte superiore della soluzione di saccarosio 1.0 M HEPES-buffered. Utilizzare una pipetta Pasteur fresco per ogni soluzione di saccarosio e fare attenzione a non disturbare il gradiente di saccarosio. Vibrazioni da un vortice panchina o microcentrifuga disturberà l&#39;integrità del gradiente. </li><li> Usando una pipetta Pasteur, sovrapporre la frazione di membrana sinaptosomale risospeso (P3) sulla parte superiore del preparato discontinuo gradiente di saccarosio.Assicurarsi che i gradienti sono bilanciate tramite pesatura all&#39;interno del secchio del rotore oscillante. Se i secchi non sono equilibrati, utilizzare una pipetta P200 aggiungere attentamente saccarosio 0,32 M HEPES-buffered all&#39;inizio della sfumatura e bilanciare i secchi rotore. </li></ol> 9 Frazionamento del Synaptic membrana plasmatica (SPM) <ol><li> Ultracentrifuge in un rotore oscillante secchio a 150.000 xg per 2 ore a 4 ° C. Rimuovere con attenzione i gradienti di saccarosio dai secchi ultracentrifuga. Utilizzando un ago da 18 G e una siringa da 1 ml, forare il tubo sul fondo della soluzione 1,0 M / 1,2 M HEPES-buffered saccarosio interfase e ritirare lo strato di membrana plasmatica sinaptica (SPM). </li><li> Prendere nota del volume che ogni campione SPM occupa nella siringa da 1 ml. Posizionare lo strato SPM raccolti in 3,5 ml tubi ultracentrifuga spessa parete, aggiungere esattamente 2,5 volumi di HEPES 4 mM per regolare la concentrazione di saccarosio da 1,2 M a 0.32 M. Dopo ogni campione è stato regolareed al 0,32 M saccarosio, bilanciare i tubi con soluzione di saccarosio 0,32 M HEPES-buffered. </li><li> Ultracentrifuga in un rotore ad angolo fisso a 200.000 xg per 30 min a 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante. Risospendere il pellet sinaptica membrana plasmatica (SPM) in 300 ml di soluzione di 50 mM EDTA HEPES / 2 mm. Conservare i campioni a -80 ° C fino a quando utilizzati per western blotting. </li></ol> 10 Preparazione della Frazione Postsynaptic Density (PSD) <ol><li> Scongelare i campioni SPM sul ghiaccio. </li><li> Fare una soluzione di 0,54% di Triton X-100 in 50 mM EDTA soluzione HEPES / 2 mM. </li><li> In una provetta da 5 ml polistirene, combinare 2,7 ml di Triton X-100 / soluzione / EDTA e 300 microlitri frazione SPM HEPES e ruotare il campione per 15 minuti a 4 ° C </li><li> Campioni Trasferire 3,5 ml tubi ultracentrifuga spessore-parete e Centrifugare i campioni a 32.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Prenotate il surnatante (Triton X-100 frazione solubile [TS]) e conservare a -80; ° C. NOTA: In questa fase, il pellet rappresenta la frazione &quot;PSD-1T&quot;. Un secondo trattamento con detergente produrrà una frazione &quot;PSD-2T&quot;. Se una frazione PSD-1T si desidera, passare al punto 10.6. <ol><li> Per produrre una frazione PSD-2T, risospendere il pellet in 3 ml di 0,5% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 soluzione mM EDTA. Ruotare i campioni per 15 minuti a 4 ° C. Centrifugare i campioni a 32.000 xg per 20 min a 4 ° C e passare al punto 10.6. </li></ol></li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet postsinaptica (PSD) in 50 / soluzione EDTA mM mM HEPES 2. NOTA: Il volume risospensione può dipendere dalle dimensioni del pellet; Si raccomanda un volume di 50-75 ml. Poiché la frazione PSD è una frazione detergente-insolubili, è spesso necessario aggiungere 1-2 ml di 0,5% SDS per consentire completa risospensione delle proteine. Conservare i campioni a -80 ° C fino a quando utilizzati per western blotting. </li></ol>

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E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells.">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li><li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner:+conserved+Pex5p+WXXXF/Y+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import.">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li><li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis.">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li><li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Ci sono diversi passaggi della procedura che sono fondamentali per un esito positivo. Nel passaggio 3, è importante che un grado costante di omogeneizzazione è ottenuta per ogni campione. Quando omogeneizzando tessuto con l&#39;omogeneizzatore a motore, una velocità costante viene utilizzata non solo per la rotazione del pestello, ma anche con il numero di colpi. Il tempo di incubazione durante lo shock osmotico deve essere preciso, dal momento omogeneizzazione estesa o incubazione nella soluzione ipotonica si lisare...

I neuroni comunicano attraverso le sinapsi, e la qualità di questa comunicazione è regolata in gran parte da alterazioni nella composizione delle proteine ​​alla sinapsi. In particolare, le proteine ​​ubicata nella densità postsinaptica partecipa nella comunicazione neuronale recettori dei neurotrasmettitori intimamente ponteggi con i loro sistemi di trasduzione del segnale 1. Inoltre, durevoli cambiamenti nella forza di efficacia sinaptica sono controllate mediante l&#39;aggiunta o la rimozione di recettori alla densità post-sinaptica 1-6. Pertanto, l&#39;isolamento e la quantificazione delle proteine ​​sinaptiche è una tecnica necessaria ed utile al fine di conoscere i modi in cui i neuroni rispondono a stimoli e alterare l&#39;efficacia sinaptica 7. Questo articolo descrive una tecnica comune per isolare le proteine ​​sinaptiche da tessuto cerebrale dei roditori da ultracentrifugazione su gradiente discontinuo di saccarosio. La frazione di membrana plasmatica sinaptica può essere arricchita e isolato basa susua densità di saccarosio, che è stato determinato empiricamente essere simile a 1,2 M saccarosio. A seconda della domanda biologica, frazioni subcellulari possono essere separati da gradienti continui o discontinui di entrambi saccarosio o Percoll. Gradienti continui consentono la separazione di proteine ​​in più frazioni; questo può essere particolarmente utile per dimostrare la co-localizzazione delle proteine ​​all&#39;interno di una data frazione 8. Tuttavia, la preparazione di gradienti continui è più laborioso e non è necessaria per molte applicazioni. Gradienti discontinui sono relativamente facili da preparare e possono essere usate per separare le proteine ​​in poche frazioni, generalmente definiti. Gradienti discontinui che sono costituiti da tre strati di saccarosio degli crescente molarità sono stati ampiamente utilizzati per isolare le proteine ​​associate alla membrana plasmatica sinaptica (SPM). Questa frazione membrana plasmatica sinaptica può essere ulteriormente elaborato per la fractio densità post-sinaptican (PSD) per trattamento detergente e l&#39;isolamento della frazione detergente-insolubili. Quando questo processo è stato descritto nel 1960 del 9,10, microscopia elettronica è stato utilizzato per dimostrare gli organelli e membrane che circa definiscono la membrana plasmatica sinaptica e frazioni di densità post-sinaptici 9-14. Questi studi hanno dimostrato l&#39;inclusione delle membrane pre e post-sinaptici e vescicole sinaptiche nella frazione SPM; dopo il trattamento detergente principalmente l&#39;elettrone-densi, densità post-sinaptica erano visibili. Nella procedura, uno shock ipotonico viene utilizzato per pizzicare fuori i processi sinaptici dal corpo cellulare 10. Questo passaggio sfrutta il fatto che i mitocondri sono più resistenti agli shock osmotico e rimangono intatte, e quindi sedimentare sul fondo del gradiente di saccarosio (Figura 1). Usando la stessa tecnica di arricchimento, le frazioni SPM e PSD erano di prima biochimicamentedefinito mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e sequenziamento dei principali componenti proteiche 15-17. Blot Successivamente occidentale è stato utilizzato per rilevare e quantificare i livelli di proteine ​​sinaptiche e definire ulteriormente queste frazioni (Figura 2). Abbiamo utilizzato questa tecnica nei nostri laboratori di quantificare i cambiamenti nei livelli sinaptici del trasportatore della dopamina che si verificano quando il locus Slc6a3 viene duplicato nei topi 18. Abbiamo anche usato questa tecnica in recettori NMDA topi deficienti per scoprire riduzioni specifiche per sinapsi in proteine ​​che fanno parte della DISC1 interattoma 19. E &#39;evidente da analisi western blot che le frazioni SPM contengono proteine ​​di membrana delle vescicole sinaptiche, marcatori degli endosomi, proteine ​​mitocondriali, membrana associata enzimi sintetici e molecole di trasduzione del segnale, così come componenti integrali della densità post-sinaptica e membrane plasmatiche sinaptiche 20-23. Efrazioni PSD Ven possono avere contaminazione con abbondanti proteine ​​mitocondriali e può essere necessario eseguire una seconda sedimentazione sfumatura o fasi di purificazione aggiuntivi per rimuoverli 13. Recentemente, spettrometria di massa quantitativa ha fornito un elenco di oltre 100 proteine ​​nei soli densità post-sinaptica, così come un&#39;indicazione della relativa abbondanza di questi componenti 24,25.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Model RW 16 basic stirrer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 fixed angle rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor swinging bucket</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 floor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 fixed angle rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

Neuronali tecniche di frazionamento subcellulare consentono la quantificazione di proteine ​​che sono vittime della tratta da e per la sinapsi. Come originariamente descritto nel tardo 1960, proteine ​​associate alla membrana plasmatica sinaptica possono essere isolati da ultracentrifugazione su gradiente di densità di saccarosio. Una volta membrane sinaptiche sono isolati, il complesso macromolecolare nota come la densità post-sinaptica può essere successivamente isolato per la sua insolubilità detersivo. Le tecniche utilizzate per isolare le membrane plasmatiche sinaptiche e proteine ​​densità post-sinaptica rimane essenzialmente la stessa dopo 40 anni, e sono ampiamente utilizzati nella ricerca neuroscientifica attuale. Questo articolo descrive il frazionamento delle proteine ​​associate alla membrana plasmatica sinaptica e la densità post-sinaptica utilizzando un gradiente di saccarosio discontinuo. Risultanti preparati proteici sono adatti per western blotting o l&#39;analisi 2D DIGE.

La preparazione del gradiente di densità di saccarosio dovrebbe tradursi in una netta separazione delle tre soluzioni molari di saccarosio (0.8, 1.0, e 1.2 M saccarosio). Vedere Figura 3A per un esempio del gradiente prima di aggiungere il campione di proteine. Se il gradiente è preparato troppo in anticipo, o se è disposta su una superficie panchina con vibrazioni da altri apparecchi, il gradiente sarà compromessa e separazione corretta non sarà raggiunto. Se una netta separazione delle tre soluzi...

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Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Questo articolo descrive l&#39;arricchimento di proteine ​​associate con la membrana plasmatica sinaptica da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio discontinuo. La successiva preparazione di proteine ​​di densità post-sinaptica è anche descritto. Preparati proteici sono adatti per western blotting o l&#39;analisi 2D DIGE.

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine ​​densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.1K Views.  University of Toronto.  Questo articolo descrive l'arricchimento di proteine ​​associate con la membrana plasmatica sinaptica da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio discontinuo. La successiva preparazione di proteine ​​di densità post-sinaptica è anche descritto. Preparati proteici sono adatti per western blotting o l'analisi 2D DIGE. 

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Frazione di membrana del cervello: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Ricerca

Biochimica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Neuroscienze

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Isolamento dei siti di contatto mitocondriali

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autore in primo piano: Svelare i siti di contatto mitocondriali e le intuizioni architettoniche 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Alta risoluzione Quantitative Synaptic Proteome profiling di cervello di topo Regioni Dopo uditiva discriminazione Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Frazione di membrana del cervello: An

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

Alta risoluzione Quantitative Synaptic Proteome profiling di cervello di topo Regioni Dopo uditiva discriminazione Learning

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine ​​densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo

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Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

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Alta risoluzione Quantitative Synaptic Proteome profiling di cervello di topo Regioni Dopo uditiva discriminazione Learning

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo