המחברים מודים לכל החברים הנוכחיים והעברתיים של מעבדת קוב עבור עבודה ודיונים יקרי ערך, ו Dionne Ware עבור סיוע מנהלי. מחקרים אלה נתמכו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט R37 DK34128 ו Welch קרן גרנט I1243 ל MHC

1. קינאז טיהור משאבים כללי Immunoprecipitation צינור הערה: קינאזות לשימוש עם assay זה עשוי להיות שמקורו immunoprecipitates של תאים בתרבית או על ידי אמצעים רקומביננטי כגון זיקה מתוייגים טיהור 6 . להלן פרוטוקול כללי דגל תיוג immunoprecipitation כי ייתכן שיהיה שונה בהתאם kinase של עניין. הכל צריך להישמר על הקרח במידת האפשר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של נוגדן 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ל 200 μL של lysates התא (בדרך כלל ~ 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ריכוז החלבון הכולל) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה בעת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלבון חרוזי sepharose 2-3 פעמים עם חיץ תמוגה (ראה להלן) על ידי ספינינג בקצרה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד 1 x ב 5000 xg (&quot;מגע ספין&quot;), הסרת supernatant עם פיפטה, חרוזים resuspending במאגר . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תמוגה: 50 מ&quot;מ HEPES pH 7.7, 150 מ&quot;מ NaCl, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ EGTA, 10% גליצרול, 0.2 mM נתרן orthovanadate, 100 מ&quot;מ נתרן פלואוריד, 50 מ&quot;מ β-glycerophosphate, 0.1% Triton X 100 או 0.1% NP-40. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μL של 50% slurry של חלבון חרוזי sepharose במאגר תמוגה כדי lysates; דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בזמן נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע ספין ב 4 ° C כדי גלולה חרוזים ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף חרוז (1 M NaCl, 20 מ&quot;מ טריס pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם עם 1x kinase התגובה חיץ (10 מ&quot;מ HEPES pH 8.0, 10 מ&quot;מ MgCl 2 ). הסר חיץ ככל האפשר מבלי להסיר חרוזים. </li></ol> 2. אתחול תגובות קינאז הערה: עבור מבחני קינאז IP, ~ 15 μL של חרוזים מושעה הוא מדגם מתחיל טיפוסי. עבור מבחני קינאז חלבון רקומביננטי, כמויות החל טיפוסי החל מ 0.1-1.0 מיקרוגרם ב 1-10 עבור 25-50 μL נפח התגובה הסופית. התאם את הכרכים של מדגם חלבון רקומביננטיS להיות שווה עם המאגר הם מאוחסנים לפני אתחול assay. בעת שימוש בכמויות גבוהות של קינאז, לכלול חלבון המוביל כגון BSA כדי לסייע בשמירה על יציבות החלבון למשך assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ התגובה 5x kinase להלן: 50 מ&quot;מ HEPES pH 8.0 50 מ&quot;מ MgCl 2 50 מ&quot;מ Benzamidine (מעכב פרוטאז) 50 מ&quot;מ DTT (סוכן הפחתת) 250 מיקרומטר ATP (ללא תווית, או &quot;קר&quot;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות קינאז על הקרח צינורות 1.5 מ&quot;ל. הכינו את תערובת התגובה הבאה, צינורות צוננים 1.5 מ&quot;ל נפרד: 21 μL H 2 O 6 μL 5x חיץ התגובה kinase 1 μolabel μL (&quot;חם&quot;) ATP 2 מצע μL (~ 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הערה: עבור מבחני קינאז רקומביננטי, נפח עשוי להיות מותאם כדי להתאים חלבונים מטוהרים. חישוב כזה נפח התגובה הסופית היא 30 μL. השתמש מתכון זה להכין הוריםלְעַרְבֵּב. עם קבלת ATP שכותרתו, לדלל מלאי H 2 O לפעילות ספציפית של 0.01 mCi / μL לפני הוספת תערובת התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאתחל את assay, להוסיף תערובת התגובה כולה מדגם kinase ו דגירה תגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות עד 1 שעות בהתאם לפעילות של kinase להיות assayed. הערה: כאשר אתה עובד עם קינאז שפעילותו לא נבדקה בעבר, בצע את מהלך הזמן של פעילות קינאז עם מרווחי 5 דקות בין נקודות זמן. </li></ol> 3. סיומת תגובה SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק את התגובה על ידי לשים על קרח הוספת 7.5 μL 5x Laemmli חיץ מדגם 6 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד 2 דקות בבלוק חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע ספין לטעון 20 μL לכל טוב על 10-15% SDS-PAGE ג&#39;ל. הפעל ג&#39;ל מספיק זמן כדי להפריד בין קינאז המצע (בדרך כלל 1 שעות על כוח קבוע של 5 W) הקפד לשמור על מנגנון ג &#39;ל מוגן להגביל את החשיפה 32 </suP&gt; P. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, להשתמש במכשירים ג&#39;ל תוצרת בית, אבל סטנדרטי מינימלי זמין מסחרית ג&#39;ל מתאימים לחלוטין. השתמש בממדים באופן הבא: ג&#39;לים: רוחב 8 ס&quot;מ, אורך 5.5 ס&quot;מ (פתרון), עובי 1.5 מ&quot;מ. מסרקים: 15 בארות, עובי 1.5 מ&quot;מ, רוחב 2.9 מ&quot;מ, עומק 16 מ&quot;מ </li></ol></li></ol> 4. מכתים ג&#39;ל וייבוש זהירות: עבור כל השלבים הקפד להפחית את החשיפה האישית ל -32 P באמצעות שימוש במיגון רדיואקטיבי ובביגוד בציוד מגן אישי. לקבלת מידע נוסף על שלבים ספציפיים, כלול הפניות מועילות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג&#39;ל מזכוכית / צלחות אלומינה מקום ב 50 מ&quot;ל כתם קומסי (10% חומצה אצטית קרח, 50% מתנול, 0.25% R-250 צבע) במשך שעה 1 על שייקר מסלולית להגדיר 50 סל&quot;ד. עבור שלב זה להשתמש במיכל כי הוא מעט גדול יותר מאשר ג &#39;ל עצמו. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את הג&#39;ל מ כתם לפתרון פתרון (10% aci aci קרחוניד, 20% מתנול) כדי דה-כתם. סלע את הג&#39;ל ב 600-700 מ&quot;ל של פתרון תיקון לילה על שייקר מסלולית ב 50 סל&quot;ד. מקום חתיכות של קצף או מגבונים מעבדה מרוכזת במיכל עם ג&#39;ל לספוג את צבע קומסי 8 , 9 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל מ תיקון פתרון ולספוג 200 methanol מ&quot;ל עבור 1-2 דקות עם תסיסה עדינה עד ג &#39;ל הופך לבן חלבי. זה יסייע למנוע פיצוח במהלך שלב ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטוב 14 ס&quot;מ x 14 חתיכת ס&quot;מ של נייר סינון איכותי עם מתנול ומקום על משטח ואקום מייבש ואקום. הנח את הג&#39;ל על הצד הקדמי של נייר המסנן ופנה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הג&#39;ל בעטיפת פלסטיק בזהירות, כדי למנוע קמטים בועות אוויר. הפעל את המייבש עבור 1.5 שעות ב 80 ° C. לאחר הוואקום הושג לפתוח את המכסה לגלגל את כל בועות אוויר במידת הצורך עם ברכה גומי רך. </li></ol> 5. אוטורדיוגרמה וספירת סינטילציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגשםג&#39;ל אד ולצרף סמן autorad, סרגר זרחני או נקודות על נייר הסינון בצד של הג&#39;ל. אם באמצעות נקודות לוודא שהם נמצאים דפוס אסימטרי. זה יהיה ליישר את הג&#39;ל עם הסרט לאחר החשיפה והפיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה גייגר לבדוק את עוצמת האות. עבור חלשות אותות חלש ב -70 מעלות צלזיוס ל -80 מעלות צלזיוס עם מסך הגברת תגדיל את צפיפות הלהקה הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר חשוך לשים ג&#39;ל יבש בתוך קלטת הסרט עם הסרט ואת המסך הגובר בסדר הבא מלמעלה למטה: ג&#39;ל, הסרט, מסך מגביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המסך הגובר למכסה של הקלטת ואת הקלטת ג&#39;ל במקום לעשות צעד זה יותר קל. המסך החזק פולט אור כאשר מוקרן על ידי חלקיקי בטא מ 32 P. אלה פליטות האור לחדור את הסרט בצורה יעילה יותר מאשר חלקיקי בטא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את אורך הגל הנפלט corres המסך הגוברתבריכות לאורך גל הסרט הכי רגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה גייגר כדי לקבוע כמה זמן לעזוב את החשיפה עבור: אם ספירת cpm הוא ~ 100 או למטה, לנסות לילה ב -70 ° C. אם הספירה היא ~ 10,000, להתחיל עם חשיפה 1 שעות ו לייעל משם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום החשיפה להסיר את הסרט ולפתח במעבד הסרט הרפואי / רנטגן. אם החשיפה בוצעה ב -70 ל -80 מעלות צלזיוס, או לאפשר את הקלטת לחמם לטמפרטורת החדר כדי למזער עיבוי על הסרט או להסיר את הסרט מיד לפני צורות עיבוי 10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הסרט על נייר ג&#39;ל יבש / מסנן וליישר את התמונה של הסמן / נקודות עם סמנים / נקודות על ג&#39;ל יבש. סמן על הסרט להקות המתאימות לסטנדרטים של חלבון. תווית את הסטנדרטים חלבון אשר נתיבים התגובות הן לעיון בעתיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו את להקות מן הג&#39;ל התואמות להקות של עניין על הסרט ומניחים אותםב 7 מ&quot;ל בקבוקונים scintillation. הוסף 4 מ&quot;ל של נוזל נצנוץ לספור עם נוזל נצנץ נוזל. אישור הדלפק מוגדר לפקח על חלון ספקטרום האנרגיה הנכון עבור 32 P. הערה: הקפד גם לבלו את הלהקה התואמת את המצע משלב הבקרה no-kinase. זה ישמש לחישוב קרינת הרקע כי יהיה מנוכה מכל ספירת scintillation. </li></ol> 6. ניתוח התוצאות הערה: autoradiogram מספק הדמיה איכותית של התוצאות. עבור quantitation מדויק, 32 P שילוב ניתן למדוד עם הדלפק נצנץ. הנתונים מתבטאים בדרך כלל במונחים של פעילות יחסית, כפי שמוצג באיור 1 ב . כל עוד נשמרים תנאים אחידים לכל הדגימות, מדידות יחסית של פעילות ספציפית מספקות כדי להשוות בין טיפולים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת חישוב ערכי פעילות ספציפיים מוחלטים, בצע קריטריוןOus אופטימיזציה של כל תנאי התגובה, כולל קינאז, המצע, ריכוזי ה- ATP קר, על מנת להבטיח טווח ליניארי של פעילות על פני זמן הקורס ( למשל 2 x [קינאז] = 2 x פעילות ספציפית). עבור קינאזות עם פעילות ספציפית גבוהה, לבצע מבחני עם ריכוז המצע מוגברת במקרה פעילות קינאז מוגבל על ידי כמות המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הפעילות הספציפית של kinase עניין ביחידות של פוספט ננומלס מועבר לכל min לכל קינאז מ&quot;ג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החסר החסר מן הדקה ב להקות ספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את ריקבון ה- ATP החם: [1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 כאשר t הוא מספר הימים מאז תאריך ההתייחסות (אמור להינתן על ידי הספק), t 1/2 הוא מחצית חיים של 32 P, שהוא 14.3 ימים, ו 0.95 משקף את היעילות של הדלפק נצנץ. דוגמה: אם אתה משתמש ATP חם כי הוא בן 28 ימים, הערך ריקבון צריך להיות 0.245. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calc(Polololes (pmol) של ATP הכולל assay (בדרך כלל זה שווה את כמות ATP קר התגובה): נפח assay (μL) x [קר ATP] (מיקרומטר) = סך ATP (pmols). דוגמה: 30 μL x 50 מיקרומטר = 1500 pmol </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב CPM / pmol ATP: [μL של ATP חם x (2.2 x 10 7 ) x גורם דעיכה] / pmol של ATP קר. הערה: הערך של 2.2 x 10 7 ממיר 0.01 mCi / μL של ATP ל- cpm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב כמות של קינאז ב assay ב מ&quot;ג. עבור קינאז רקומביננטי ו קינאזות immunoprecipitated, שיטות סטנדרטיות כגון מבחני BCA מתאימים כדי לקבוע ריכוז מתחיל. דוגמה: wtERK2 0.0002 מיקרוגרם / μL בתגובת 50 kinase μL הוא 0.01 מיקרוגרם, או 1 x 10 -5 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב סך מחיר לאלף הופעות ב- assay. להרכיב 30 תגובות μL ולהפעיל 20 μL מכל תגובה על ג&#39;ל. הכפל את cpm נספר (לאחר חיסור ריק) על ידי גורם של נפח assay הכולל / נפח טעון. המשך האמור לעיללדוגמה, להכפיל את כל הספירות על ידי 1.5, או 30/20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הפעילות הספציפית של קינאז assayed: סה&quot;כ CPM ב assay) / (cpm / pmol ATP) / (זמן assay בדקות) / (כמות של kinase ב מ&quot;ג) הערה: חלוקת הערך הנ&quot;ל ב -1,000 תשואות הפעילות הספציפית בננו-מולים / דקה / מ&quot;ג </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב כמה מולס של פוספט משולבים לתוך המצע (כל עוד המשקל המולקולרי שלה ידוע). זה משמש כדי לקבוע את מספר phosphosites על חלבון מסוים לאחר התגובה יש הלך להשלמה. סך כל cpm assay) / (cpm / pmol ATP)] / (כמות של המצע ב pmols) </li></ol>

<ol>
	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

קינאזות הם משפחה מגוונת של חלבונים אשר התפתחו פונקציונליות נרחבת בהקשרים רבים, מבחני קינאז כבר שימושי מאוד בחקר חלבונים איתות כמה תרמו רבות להבנתנו הנוכחית של התקשורת הסלולרית. יש לציין, אותו assay הבסיסי שימש אפיון שני קינאזות שונות למרות הבדלים גדולים במבנה ופעילות....

קינאזות חלבון הן אנזימים מתוחכמים קריטיים להעברת אותות סלולריים לתגובות הולמות 1 . בהתחשב בתפקידים שלהם בשמירה על הומאוסטזיס ומניעה או קידום של מצבי מחלה 2 , שיטות ביוכימיות להערכת פעילות קינאז ממשיכות להיות כלים רבי עוצמה לתיאור הפרטים של איתות אוקריוטי 3 . למרות אסטרטגיות ניצול נוגדנים ספציפיים phospho כבר אינפורמטיבי מאוד במונחים של מדידת ההשפעות של תנאי טיפול שונים על מצב איתות תא 4 , assay קינאז מאפשר למדוד את ההשפעות של תנאי טיפול שונים ישירות במונחים של פעילות אנזימטית של קינאז של ריבית. אמנם יש מספר אפשרויות עבור מבחני דומים שאינם משתמשים בחומרים רדיואקטיביים 5 , אנו ממשיכים להסתמך על שיטה זו quantitation חזק של תוצאות. שםהם שני יישומים טיפוסיים של assay זה, שניהם בעלי ערך מסיבות שונות: assay immunoprecipitated (IP) קינאז ( איור 1 ) ואת assay חלבון רקומביננטי קינאז ( איור 2 ). Assay IP Kinase הוא שימושי מאוד עבור זיהוי גורמים המסוגלים להפעיל קינאזות חלבון ספציפיים, כמו גם לאמוד תנאי טיפול מעכב. בקצרה, קינאז אפיטופ מתויג של עניין הוא transfected לתאי eukaryotic תרבותי, נתון למגוון של טיפולים, immunoprecipitated, assayed על היכולת לשלב פוספט radiolabeled לתוך מצע מודל ( למשל myelin בסיסי חלבון (MBP)). Assay IP kinase יכול להתבצע גם מבלי להזדקק overexpression, או על ידי immunoprecipitation של חלבון אנדוגני או כל מספר של טכניקות עריכת הגנום. בגלל טיפולים מנוהלים בתרבות, שיטה זו יכולה לזהות גירויים המועברים באמצעות גורמים במעלה מרוביםאו מסלולים מקבילים על ידי readout במבחנה . אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו היא כי היא אינה דורשת ידע מוקדם של גורמים במעלה או במורד הזרם ישיר או אתרי זרחן בו. יתר על כן, לאחר מצעים ספציפיים עבור קינאז של עניין זוהו, אותו פרוטוקול assay קינאז ניתן להשתמש עם רכיבים רקומביננטי למדוד פעילות ספציפית כלפי מצעים טבעיים לזהות אתרי זרחן ספציפיים בשילוב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה. אתרים המזוהים בצורה זו ניתן לאמת עוד עם מבחני קינאז ניצול מוטציות המצע. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות ולמדוד autophosphorylation. פרוטוקול בתנאי כאן מניח או מטוהרים חלבון אופטימיזציה או שיטת transfection להביע קינאז מתויג זיקה של עניין בתרבית תאים. לקבלת תערוכות מפורטות יותר של transfection, תמוגה, immunoprecipitation, ואת חלבון טיהור מגןOcols, אנו מציעים להתייחס פרוטוקול הקרה האביב הארבור 6 . לקבלת מידע נוסף לגבי פיתוח assay ושינוי, עיין פרוטאין זרחון: שיטות נבחרות אנזימולוגיה 7 .

<table><tbody><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled [&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive shielding</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 dye (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Slab gel vacuum dryer</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 Gel Dryer #1651745&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autorad marker</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent ruler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent dots</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 with 44-9 detector</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Intensifying Screen 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Medical/X-ray film processor</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation vials</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation fluid</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

קינאזות חלבונים מסוגלים לשלוט בשינויים תאיים בקנה מידה גדול בתגובה למערכים מורכבים של גירויים, ומאמץ רב הופנה לחשוף פרטים אלסטריים של הרגולציה שלהם. קינאזות הן רשתות איתות אשר פגמים הם לעתים קרובות סימני ההיכר של צורות רבות של סרטן ומחלות נלוות, מה שהופך פלטפורמת assay מקובל מניפולציה של גורמים רגולטוריים במעלה הזרם ואת האימות של דרישות התגובה קריטי בחיפוש אחר טיפול משופר. כאן, אנו מתארים assay קינאז בסיסי שניתן להתאים בקלות כדי להתאים שאלות ניסיוניות ספציפיות, כולל אך לא מוגבל לבדיקת ההשפעות של סוכני ביוכימי ופרמקולוגי, מניפולציות גנטיות כגון מוטציה ומחיקה, כמו גם התנאים תרבות התא וטיפולים בדיקה מנגנוני איתות תא. Assay זה מנצל radiolabeled [γ- 32 P] ATP, המאפשר השוואות כמותיות הדמיה ברורה של התוצאות, והוא יכול להיות modאם נעשה שימוש עם קינאז immunoprecipitated או רקומביננטי, מצעים ספציפיים או מאופיינים, בכל רחבי מגוון רחב של תנאי תגובה.

WNK1 IP מבחני kinase Myc- מתויג WNK1 היה transfected לתוך תאים HEK293 ו immunoprecipitated עם נוגדן אנטי Myc 11 . פעילות immunoprecipitate immunoprecipitate כלפי המודל המצע MBP כמו גם כלפי עצמו ( איור 1 א ). מוטציות WNK1 נבדקו א?...

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

assaying-protein-kinase-activity-with-radiolabeled-atp

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

18.2K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center.  קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולרי?...

Video: Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biology

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video