The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.

.1 עכברים לרגש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות OVA על ידי דילול OVA ב1x PBS לריכוז סופי של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. להקפיא את aliquots בcryovials ולאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא aliquots אחד או יותר מ20 מ&quot;ג / מניית OVA מ&quot;ל לטמפרטורת חדר. לדלל OVA ב1x PBS לריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בצינור 5 מ&quot;ל קלקר עגול תחתון עם כובע. בקצרה מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את צינור הקלקר המכיל 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​OVA במערבולת להגדיר במהירות בינונית, מוסיף נפח שווה של אלום הומוגני ביסודיות Imject (40 מ&quot;ג / מ&quot;ל) dropwise תוך המשך מערבולת הצינור כדי לייצר יחס של 1: 1 של אלום לimmunogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כובע על צינור צינור וקלטת למערבולת. הפעל מערבולת בהגדרה הנמוכה ביותר ולאפשר OVA לספוג לאלום ל30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תאפשר לכמות גדולה של זמן כדי לעבור בין הכנת OVA / אלום ורגישות עכברים. אם רגישות לא ניתן להשלים באופן ישיר לאחר preparat OVA / אלוםיון, חנות OVA / אלום בטמפרטורת חדר. מערבולת 1 דקות לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון מזרק אינסולין 1 מ&quot;ל עם תערובת OVA / אלום. מכסה את המזרק עם מחט המד 27.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק של OVA / אלום 100 μl לתוך הצפק של עכברים / ג BALB למנה לכל עכבר של 50 מיקרוגרם של OVA ו2 מ&quot;ג של אלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת שלילית, רגישות קבוצה אחרת של עכברים לPBS. הכן 1: תערובת 1 של אלום וPBS באותו אופן כפי שפורט לעיל, תוך השמטת OVA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגישות כל העכברים (שליטת OVA וPBS) פעם בשבוע למשך 3 שבועות עבור הסכום כולל של 3 זריקות. לאחר ההזרקה אחרונה, לחכות לפחות 2 שבועות לפני ביצוע assay אנפילקסיס המקומי. </li></ol> .2 המקומי אנפילקסיס Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא פתרון מניות OVA לטמפרטורת חדר. בצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge, לדלל 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מניית OVA לריכוז סופי של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עם PBS (1: 4 דילול של OVA ב1X PBS). בקצרה מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים באמצעות RC 2 &lt;/ Sup&gt; מערכת מכרסמים הרדמה (או מערכת אספקה ​​מתאדה מקבילה). מלא מאגר עם isoflurane, ולהדליק O 2 זרימת אוויר. מקום עכברים בחדר אינדוקציה ולהתאים חיוג שליטת isoflurane עד 5% ליזום הרדמה. ברגע שעכברים מורדמים באופן מלא, שצוין על ידי חוסר הניידות, להתאים חיוג שליטת isoflurane עד 3% כדי לשמור על הרדמה עמוקה. המטרה של הרדמה בהליך זה היא לשתק את בעלי החיים. זריקות וריד אוזן וזנב לא לגרום לכאב או מצוקה משמעותיים לבעלי החיים. הערה: Isoflurane יכולה להיות השפעות שליליות על מערכת הרבייה האנושית. הקפד להשתמש בחדר מאוורר היטב ולצרף מיכל הדחה לתא האינדוקציה לנטרל גז פסולת. אם הינך בהריון בעת ​​שימוש isoflurane, ללבוש מסכת מסנן פחמן כדי למזער את החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μl של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​OVA לתוך מזרק אינסולין 3/10 סמ&quot;ק כתרים עם מחט ביום 31 בG. לטעון אחר מזרק אינסולין 3/10 סמ&quot;ק עם 10 μlPBS של 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להזריק 10 μl של OVA לאוזן ימין של עכבר הרדים למנת אתגר של 50 מיקרוגרם של OVA. מינונים אחרים, כגון 20 מיקרוגרם, גם מקובל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצב את האוזן להזרקה, לעטוף נייר דבק (צד עד דביק) סביב צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. אבטח את צד הגב של אוזן ימין לקלטת. הכנס את צד פוע המחט בין שני העלים של האוזן. לאט לאט להזריק OVA למרכז רקמת האוזן, נזהר שלא לפגוע בכל כלי דם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותה השיטה שתוארה לעיל, להזריק 10 μl של PBS לתוך אוזן השמאל כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 3 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להציב את העכבר בעוצר ולהחזיק את הזנב תחת מנורת חום או באמבט מים חם ל1 דקות כדי להרחיב את כלי הדם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק אינסולין 1 מ&quot;ל כתרים עם מחט 27 G, להזריק לאט 200 μl של .0.5% צבע אוונס הכחול לv הזנבעין של העכבר. הזרקה מהירה עלולים להרוס את מבנה הספינה לפני 200 μl כולו מנוהלת. במקרה זה, תנסה להזריק את הנפח הנותר של צבע לתוך הווריד בצד השני של הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר ולהסיר את שני האוזניים באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הקצוות של האוזן עם מלקחיים, ולוודא כי אין לחץ מוחל על אתר ההזרקה במרכז של האוזן. להסיר כמה שיותר רקמת אוזן ככל האפשר על ידי חיתוך קרוב ל, אך לא דרך, הרכס של הווה סחוס בבסיס של האוזן. כמויות קטנות של פרווה יכולות להיות נוכחת באוזן נכרתה; זה לא ישפיע על assay. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 700 μl של פוראמיד לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. הכן צינור אחד לכל אוזן (שני צינורות לכל עכבר). הערה: פוראמיד הוא טרטוגניות, mutagenic, וגירוי. ללבוש כפפות, משקפי מגן, ופנים הגנה. נשים בהריון צריכות לנקוט באמצעי זהירות בעת טיפולפוראמיד של עשוי להיות fetotoxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת אוזניים לפוראמיד, מכסה את הצינורות, ודגירת הלילה באמבט חום יבש מוגדר 63 ° C. אוזניים עדיין עשויות להופיע כחולות מעט לאחר דגירה; עם זאת רוב הצבע יהיה חילוץ לפוראמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של כל דגימה, בשני עותקים, לצלחת גם 96. הימנע מהעברת פרווה אם הוא נמצא במדגם. ודא שאין בועות בהווה בבארות, כפי שהם ישפיעו על הקריאה ספיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של פוראמיד, בשני עותקים, לצלחת גם 96. בארות אלה ישמשו כחסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ספקטרופוטומטר למדוד הספיגה ב 620 ננומטר. בארות פוראמיד לגרוע מכל קריאת מדגם. הערה: כל הניסויים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת שירותים במדים. </li></ol>

<ol>
	<li>Kojima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+Bbasophils+are+selectively+activated+in+vitro+and+in+vivo+through+CD200R3+in+an+IgE-independent+manner.">Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner.</a> The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).</li><li>Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+enzymes+in+mast+cell+granules+and+their+potential+role+in+allergic+rhinitis.">Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).</li><li>Amin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mast+cells+in+allergic+inflammation.">The role of mast cells in allergic inflammation.</a> Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).</li><li>Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+histamine+receptor+subtypes+in+human+inferior+turbinates.">Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).</li><li>Ramsdell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Trypan+Blue+to+demonstrate+the+immediate+skin+reaction+in+rabbits+and+guinea+pigs.">The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs.</a> The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).</li><li>Chase, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+sensitization+of+animals+with+simple+chemical+compounds:+X.+Antibodies+inducing+immediate-type+skin+reactions.">Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).</li><li>Goose, J., Blair, A. M. J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+rat,+induced+with+two+homologous+reagin-like+antibodies+and+its+specific+inhibition+with+disodium+cromoglycate.">Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate.</a> Immunology. 16, 749-760 (1969).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+reactions+in+the+skin+of+experimental+animals+provoked+by+antibody-antigen+interactoin.">Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin.</a> Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitiative+evaluation+of+passive+cutaneous+anaphylaxis+(PCA)+using+a+hand-held+spectrophotometer.">Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).</li><li>Teshima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+spectrophotometric+analysis+of+passive+and+active+ear+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

סמנים רבים של מחלות אלרגיות נמצאים בשימוש כדי להעריך את הכוח של תגובות אלרגיות הבאות אתגר אלרגן, לרבות שינויים ברמות של היסטמין במחזור, ייצור ציטוקינים Th2, וגיוס של תאים לנוזל רונכואלוואולרית בהגדרה של אתגר דרכי הנשימה. בעוד מעקב אחר שינויים בפרמטרים אלה הוא חשוב ללי...

סוג אני רגישות יתר מתווך על ידי-Induced אנטיגן cross-linking של IgE על פני השטח של תא פיטום ובזופילים. התוצאה היא degranulation הסלולרי והשחרור של מתווכי vasoactive ומעודדים דלקת כגון היסטמין, tryptase, וגורם 2 שמפעיל את טסיות דם. בעקבות השחרור של מתווכים, מעוצב מראש, במהלך degranulation, תאי פיטום לסנתז ולשחרר פרוסטגלנדינים ולאוקוטריאנים, המגדיל את חדירות כלי דם 3 נוסף. התגובה הקלינית הראשונית מתרחשת במהירות, והוא מכונה &quot;תגובה מיידית&quot;. בעור, תגובת wheal ו- התלקחות גלויה בקלות בתוך דקות של אתגר אנטיגן. בהתאם למינון של האתגר, אפשר לצפות &quot;תגובת שלב מאוחר&quot; כמה שעות מאוחר יותר. נפיחות שלב המאוחרות בשל בצקת מקומית וגיוס ליקוציט לתוך הרקמות 2. היסטמין, בדרך כלל נחשב למתווך העיקרי לוקח חלק בתגובות אלרגיות מיידיות, פועלת על קולטן היסטמין 1 (HR1) הביעה בכלי וקולט היסטמין 2 (HR2) הביע על שריר חלק. ההשפעה המשולבת מגבירה את זרימת דם וחדירות כלי דם באתר של דלקת 4. מגוון רחב של מודלים של בעלי החיים של אלרגיה פותחו כדי לחקור את המנגנונים מעורבים בדלקת אלרגית, כולל מודלים של אסתמה אלרגית, אנפילקסיס המערכתי, ואנפילקסיס המקומי. ממשל צבע תוך ורידים נעשה שימוש כדי למדוד את התגובות אלרגיות מקומיות במודלים של בעלי חיים לכמעט מאה שנה, עם פרסומים המתארים היכרויות טכניקה זו חזרה ל1920s 5. ארנבות ושרקנים היו המודלים של בעלי החיים הראשונים משמשים לבדיקת תגובות של רגישות יתר מיידיות, והתגובות רגישות ביותר נמצאו בדרך כלל באוזן 5,6. Assay מאוחר יותר תוקף לשימוש בחולדות ועכברים 7 8. מבחינה הסטורית,מגוון של שיטות ניסיוניות היה בשימוש, כולל הזרקה של אנטיגן לפני הזריקה של צבע, הזרקה של צבע לפני הזריקה של אנטיגן, והזרקה בו זמנית של צבע ואנטיגן. ממשל צבע תוך ורידים כאמצעי למדידת תגובות אלרגיות הוא assay צדדי כפי שהוא יכול לשמש למדידה פעילה, פסיבי, ולהפוך את תגובות פסיביות 5,9. צבעים רבים כבר נוצלו כדי להעריך את תגובות אלרגיות, כולל Trypan הכחול, Pontamine שמיים כחולים, אוונס הכחול, Geigy הכחול 536, והודו דיו 5,6,9. פתרון של .0.5% כחול אוואנס הוא כיום הצבע הסטנדרטי המשמש למדידת תגובות אלרגיות בעור. התגובה אנפילקטית לאתגר היא חולפת; הוא הגיע בעוצמה מקסימלית בתוך 10 - 15 דקות של הזרקת צבע, ואין תגובה היא גלויה אם צבע מנוהל יותר מ 30 דקות אחרי האתגר, ללא קשר למינים של בעלי החיים המשמשים 9. כימות של extravasation הצבע הייתה מקוריתly מתקבל על ידי מדידת גודל wheal כפי שצוין על ידי הצבע הכחול 7-9. בנוסף, סעיפים של תאי פיטום degranulated ניתן לכמת על ידי כריתת רקמת עור מהאתר של התגובה וצביעה עם toluidine הכחול 7. degranulation תא פיטום משמש לעתים קרובות כסמן לעורית, תגובות אלרגיות בתיווך IgE, כתאי פיטום הם אוכלוסיית התא המקומית העיקרית המבטאת את הזיקה הגבוהה IgE קולט FcεRI. טכניקות spectrophotometric למדידת extravasation צבע לתוך הרקמות פותחו לאנפילקסיס הפסיבי עורית (PCA) בחולדה 10 ו11 העכבר של 1990. פרוטוקול assay אנפילקסיס המקומי הבא הותאם מאל Kojima et. 1, ומנצל ovalbumin ביצת עוף (OVA) כאנטיגן ללעורר תגובות אלרגיות. עם זאת, ניתן להשתמש באנטיגנים אחרים מאשר OVA אם תרצה בכך. Assay אז משתמש לצבוע אוונס הכחול לעקוב אחר שינויים בpermeabilit כלי הדםy המתרחשים עקב תורן תא קישור צולב IgE ושחרור היסטמין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BALB/c Mice</td>
			<td style="width:167px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:167px;">Quality Biologic</td>
			<td style="width:135px;">114-058-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A5503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Imject Alum</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:135px;">77161</td>
			<td style="width:225px;">Mix thoroughly before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Evans Blue Dye</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">E2129</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Formamide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">295876</td>
			<td style="width:225px;">99%+ Spectrophotometric grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Isoflurane, USP</td>
			<td style="width:167px;">Phoenix</td>
			<td style="width:135px;">NDC 57319-474-06</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1cc Insulin syringes</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">329654</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3/10 cc Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td style="width:167px;">Terumo</td>
			<td style="width:135px;">NDC 100861</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">27G Needles</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">305109</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Forceps</td>
			<td style="width:167px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:135px;">11000-12</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:167px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:135px;">14070-12</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">5ml Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td style="width:167px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.5ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Medical Supply Partners</td>
			<td style="width:135px;">15-1151</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">15ml Conical tubes</td>
			<td style="width:167px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:135px;">352097</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Flat-bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:167px;">Costar</td>
			<td style="width:135px;">3590</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">RC2 Rodent Anesthesia System</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:135px;">922100</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Vortex Genie 2</td>
			<td style="width:167px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:135px;">SI-0236</td>
			<td style="width:225px;">Model G560 with 3 inch platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring local anaphylaxis in mice

תגובות אלרגיות הן התוצאה של הפעלת תאי מאסט ובזופילים, ואת שחרורו הבא של vasoactive ומתווכים מעודדי דלקת. חשיפה לאלרגן באדם רגיש יכולה לגרום לתסמינים קליניים המשתנים מאריתמה הקטין לאנפילקסיס סכנת חיים. במעבדה, מודלים של בעלי חיים שונים פותחו כדי להבין את מנגנוני נהיגה תגובות אלרגיות. בזאת, אנו מתארים שיטה מפורטת למדידת שינויים בחדירות כלי דם לכמת תגובות אלרגיות מקומיות. Assay אנפילקסיס המקומי דווח לראשונה ב1920s, והותאם מהטכניקה שפורסמה על ידי אל Kojima et. ב2007 1. ב assay זה, עכברים רגישים לOVA מאותגרים באוזן השמאל עם רכב ובאוזן ימין עם OVA. זה ואחריו הזרקה תוך ורידית של צבע אוונס הכחול. עשר דקות לאחר הזרקת אוונס הכחול, בעלי החיים הוא מורדמים והצבע שextravasated בלאוזניים מופק לילה בפוראמיד. הספיגה של הצבע שחולץ לאחר מכן לכמת עם ספקטרופוטומטר. שיטה זו באופן מהימן תוצאות בביטוי חזותי וכימות של תגובה אלרגית מקומית.

בעלי חיים שעברו assay בהצלחה יהיו עור ועיניים המופיעות כחול. בעלי חיים רגישים PBS לא צריכים להגיב לכל אחד PBS או אתגר OVA, לכן שני האוזניים צריכה להישאר (איור 1 א) הלבן. בבעלי החיים OVA רגישים, אוזן קבלת אתגר PBS (משמאל) צריכה להיות לבנה או בקלילות כחולה בדרך מקומית באתר ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Local Anaphylaxis in Mice at JoVE.com

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

תגובות אלרגיות, המתאפיינות בהפעלת תאי מאסט ובזופילים, מונעות על ידי הקישור הצולב של IgE והשחרור של מתווכים מעודדי דלקת. הערכה כמותית של תגובות אלרגיות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בצבע כחול אוונס לעקוב אחר שינויים בחדירות כלי דם לאחר אתגר אלרגן.

מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K Views.  Uniformed Services University of the Health Sciences.  תגובות אלרגיות, המתאפיינות בהפעלת תאי מאסט ובזופילים, מונעות על ידי הקישור הצולב של IgE והשחרור של מתווכים מעודדי דלקת. הערכה כמותית של תגובות אלרגיות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בצבע כחול אוונס לעקוב אחר שינויים בחדירות כלי דם לאחר אתגר ...

Video: Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

Measurement of &amp;#947;HV68 Infection in Mice

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry

Decreased red cell deformability is characteristic of several disorders. In some cases, the extent of defective deformability can predict severity of disease or occurrence of serious complications. Ektacytometry uses laser diffraction viscometry to measure the deformability of red blood cells subject to either increasing shear stress or an osmotic gradient at a constant value of applied shear stress. However, direct deformability measurements are difficult to interpret when measuring heterogenous blood that is characterized by the presence of both rigid and deformable red cells. This is due to the inability of rigid cells to properly align in response to shear stress and results in a distorted diffraction pattern marked by an exaggerated decrease in apparent deformability. Measurement of the degree of distortion provides an indicator of the heterogeneity of the erythrocytes in blood. In sickle cell anemia, this is correlated with the percentage of rigid cells, which reflects the hemoglobin concentration and hemoglobin composition of the erythrocytes. In addition to measuring deformability, osmotic gradient ektacytometry provides information about the osmotic fragility and hydration status of erythrocytes. These parameters also reflect the hemoglobin composition of red blood cells from sickle cell patients. Ektacytometry measures deformability in populations of red cells and does not, therefore, provide information on the deformability or mechanical properties of individual erythrocytes. Regardless, the goal of the techniques described herein is to provide a convenient and reliable method for measuring the deformability and cellular heterogeneity of blood. These techniques may be useful for monitoring temporal changes, as well as disease progression and response to therapeutic intervention in several disorders. Sickle cell anemia is one well-characterized example. Other potential disorders where measurements of red cell deformability and/or heterogeneity are of interest include blood storage, diabetes, Plasmodium infection, iron deficiency, and the hemolytic anemias due to membrane defects.

Here we present techniques to measure red cell deformability and cellular heterogeneity by ektacytometry. These techniques are applicable to general investigations of red cell deformability and specific investigations of blood diseases characterized by the presence of both rigid and deformable red cells in circulation, such as sickle cell anemia.

מדידת ודפורמביליות והטרוגניות תא אדום בדם על ידי Ektacytometry

Decreased red cell deformability is characteristic of several disorders. In some cases, the extent of defective deformability can predict severity of ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

מדידה טמפרטורת גוף העכבר באמצעות מד חום אינפרא אדום במהלך אנפילקסיס מערכתית פסיבי והערכה אלרגיה למזון

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

קוונפיקציה של טרשת עורקים בעכברים

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

חיסוני המאמצת של תאים iNKT ב גלוקוז-6-פוספט איזומראז (G6PI)-הנגרמת עכברים RA

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...