Name: measuring local anaphylaxis in mice
Uploaded: 2014-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
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The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.

1. Mice Sensibilizzare <ol><li> Preparare una soluzione stock OVA diluendo OVA in 1x PBS ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. Congelare le aliquote in cryovials e conservare a -80 ° C per un uso futuro. </li><li> Portare una o più aliquote di 20 mg / ml di OVA magazzino a temperatura ambiente. Diluire OVA in 1x PBS ad una concentrazione finale di 1 mg / ml in una provetta 5 ml di polistirolo rotonda fondo con un tappo. Vortex brevemente per miscelare. </li><li> Tenendo la provetta di polistirene contenente 1 mg / ml di OVA in un vortice funzionante a velocità media, aggiungere un volume uguale di fondo omogeneizzato Imject allume (40 mg / ml) goccia a goccia continuando a vortice tubo per produrre un rapporto 1: 1 di Alum a immunogeno. </li><li> Mettere tappo sul tubo e nastro tubo vortex. Attivare vortice sul valore più basso e consentire OVA di adsorbimento al Alum per 30 min. <ol><li> Non permettere che una grande quantità di tempo per passare tra la preparazione OVA / allume e sensibilizzazione topi. Se sensibilizzazione non può essere completata direttamente dopo OVA / allume preparatione, negozio OVA / allume a temperatura ambiente. Vortex per 1 min prima di utilizzare. </li></ol></li><li> Caricare una siringa da insulina da 1 ml con miscela di OVA / Alum. Chiudere la siringa con l&#39;ago calibro 27. </li><li> Iniettare 100 ml di OVA / Alum nel peritoneo di topi BALB / c per una dose per ogni topo di 50 mg di OVA e 2 mg di Alum. </li><li> Per un controllo negativo, sensibilizzare altro gruppo di topi a PBS. Preparare una miscela 1: 1 di Alum e PBS in stesso modo di cui sopra, omettendo OVA. </li><li> Sensibilizzare tutti i topi di controllo (OVA e PBS) una volta a settimana per 3 settimane per un totale di 3 iniezioni. Dopo l&#39;iniezione finale, attendere almeno 2 settimane prima di eseguire il test anafilassi locale. </li></ol> 2. locale anafilassi Assay <ol><li> Portare soluzione madre OVA a temperatura ambiente. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, diluire 20 mg / ml di OVA magazzino ad una concentrazione finale di 5 mg / ml con PBS (1: 4 diluizione di OVA in PBS 1X). Vortex brevemente per miscelare. </li><li> Anestetizzare topi utilizzando RC 2 &lt;/ Sup&gt; Roditore anestesia sistema (o sistema di erogazione vaporizzata comparabili). Riempire il serbatoio con isoflurano, e accendere O 2 flusso d&#39;aria. Luogo topi in camera di induzione e regolazione selettore di controllo isoflurano al 5% di avviare anestesia. Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, indicato dalla mancanza di mobilità, regolare il selettore di controllo isoflurano al 3% per mantenere la profonda anestesia. Lo scopo di anestesia in questa procedura è quello di immobilizzare l&#39;animale. Le iniezioni orecchie e coda vena non causano dolore o disagi all&#39;animale. NOTA: isoflurano può avere effetti negativi sul sistema riproduttivo umano. Assicurarsi di utilizzare in una stanza ben ventilata e allegare una bomboletta scavenging alla camera di induzione di neutralizzare gas di scarico. In caso di gravidanza durante l&#39;utilizzo di isoflurano, indossare una maschera di filtro a carbone per ridurre al minimo l&#39;esposizione. </li><li> Carico 10 ml di 5 mg / ml OVA in una siringa da insulina 3/10 cc ricoperto con un ago 31 G. Caricare un&#39;altra siringa da insulina 3/10 cc con 10 microlitridi 1x PBS. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, iniettare 10 ml di OVA in dell&#39;orecchio destro di un mouse anestetizzato per una dose di 50 mg di OVA. Altre dosi, come ad esempio 20 mg, sono anche accettabili. <ol><li> Per stabilizzare l&#39;orecchio per l&#39;iniezione, avvolgere nastro adesivo (adesivo rivolto verso l&#39;alto) attorno ad un tubo da 15 ml. Fissare il lato dorsale dell&#39;orecchio destro al nastro. Inserire il lato ago smusso tra le due foglie dell&#39;orecchio. Iniettare lentamente OVA nel centro del tessuto dell&#39;orecchio, facendo attenzione a non colpire eventuali vasi sanguigni. </li></ol></li><li> Utilizzando lo stesso metodo descritto sopra, iniettare 10 ml di PBS nell&#39;orecchio sinistro come controllo negativo. </li><li> Attendere 3 min. <ol><li> Durante questo periodo, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e tenere la coda sotto una lampada di calore o in un bagno di acqua calda per 1 min a dilatare i vasi sanguigni. </li></ol></li><li> Usando una siringa da insulina da 1 ml con tappo con un ago 27 G, iniettare lentamente 200 ml di 0,5% Blu di Evans colorante in coda vein del mouse. Iniezione rapida può distruggere la struttura nave prima l&#39;intero 200 ml viene somministrato. In questo caso, tentare di iniettare il volume residuo di colorante nella vena sul lato opposto della coda. </li><li> Attendere 10 min. </li><li> Euthanize il mouse e rimuovere entrambe le orecchie con pinze e forbici chirurgiche. <ol><li> Afferrare i bordi dell&#39;orecchio con una pinza, facendo attenzione che non viene applicata pressione al sito di iniezione al centro dell&#39;orecchio. Rimuovere il tessuto più orecchie possibile tagliando vicino a, ma non attraverso la cresta di cartilagine presente alla base dell&#39;orecchio. Piccole quantità di pelo possono essere presenti su un orecchio asportato; ciò non pregiudica il test. </li></ol></li><li> Aliquota 700 ml di formammide in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Preparare una provetta per orecchio (due tubi per il mouse). NOTA: Formamide è teratogeno, mutageno, e un irritante. Indossare guanti, protezioni per gli occhi e la faccia. Le donne incinte dovrebbero prestare attenzione quando si maneggia unas formammide può essere fetotossici. </li><li> Aggiungi orecchie per formammide, tappare i tubi, e incubare una notte in un bagno di calore secco impostato a 63 ° C. Orecchie possono ancora apparire leggermente blu dopo l&#39;incubazione; Tuttavia la maggior parte del colorante sarà estratto nel formammide. </li><li> Aggiungere 300 ml di ciascun campione, in duplicato, di una piastra ben 96. Evitare il trasferimento di pelliccia se è presente nel campione. Assicurarsi che non vi siano bolle presenti nei pozzetti, in quanto saranno influenzare la lettura di assorbanza. </li><li> Aggiungere 300 ml di formammide, in duplice copia, alla piastra ben 96. Questi pozzi saranno utilizzati come spazi vuoti. </li><li> Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l&#39;assorbanza a 620 nm. Pozzi formammide sottrarre da ogni lettura del campione. NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla Institutional Animal Care and Use Committee in uniforme Servizi Università. </li></ol>

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	<li>Kojima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+Bbasophils+are+selectively+activated+in+vitro+and+in+vivo+through+CD200R3+in+an+IgE-independent+manner.">Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner.</a> The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).</li><li>Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+enzymes+in+mast+cell+granules+and+their+potential+role+in+allergic+rhinitis.">Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).</li><li>Amin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mast+cells+in+allergic+inflammation.">The role of mast cells in allergic inflammation.</a> Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).</li><li>Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+histamine+receptor+subtypes+in+human+inferior+turbinates.">Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).</li><li>Ramsdell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Trypan+Blue+to+demonstrate+the+immediate+skin+reaction+in+rabbits+and+guinea+pigs.">The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs.</a> The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).</li><li>Chase, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+sensitization+of+animals+with+simple+chemical+compounds:+X.+Antibodies+inducing+immediate-type+skin+reactions.">Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).</li><li>Goose, J., Blair, A. M. J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+rat,+induced+with+two+homologous+reagin-like+antibodies+and+its+specific+inhibition+with+disodium+cromoglycate.">Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate.</a> Immunology. 16, 749-760 (1969).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+reactions+in+the+skin+of+experimental+animals+provoked+by+antibody-antigen+interactoin.">Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin.</a> Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitiative+evaluation+of+passive+cutaneous+anaphylaxis+(PCA)+using+a+hand-held+spectrophotometer.">Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).</li><li>Teshima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+spectrophotometric+analysis+of+passive+and+active+ear+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Numerosi marcatori di malattia allergica sono utilizzati per valutare la forza delle risposte allergiche seguenti sfida allergene, compresi i cambiamenti nei livelli di istamina circolante, Th2 produzione di citochine, e il reclutamento di cellule in liquido broncoalveolare nella cornice della sfida delle vie aeree. Mentre il monitoraggio dei cambiamenti in questi parametri è importante per studiare le reazioni allergiche, marcatori biologici non sempre correlano con malattia allergica clinica. Il test anafilassi local...

Ipersensibilità di tipo I è mediata da antigene-indotta cross-linking delle IgE sulla superficie dei mastociti e basofili. Ciò si traduce in degranulazione cellulare e il rilascio di mediatori vasoattivi e proinfiammatori come l&#39;istamina, triptasi, e fattore attivante le piastrine 2. A seguito del rilascio di mediatori preformati durante degranulazione, mastociti sintetizzano e rilasciano prostaglandine e leucotrieni, che aumentano ulteriormente la permeabilità vascolare 3. La risposta clinica iniziale avviene rapidamente ed è indicato come una &quot;reazione immediata&quot;. Nella pelle, una risposta wheal-e-bagliori è facilmente visibile a pochi minuti dall&#39;esposizione all&#39;antigene. A seconda della dose di sfida, è possibile osservare una &quot;risposta in fase tardiva&quot; poche ore più tardi. Gonfiore fase tardiva è dovuta a edema localizzato e il reclutamento dei leucociti nei tessuti 2. L&#39;istamina, generalmente considerato il principale mediatore parteciparereazioni allergiche immediate, agisce sul recettore dell&#39;istamina 1 (HR1) espresso su navi e istamina recettore 2 (HR2) espresso sulla muscolatura liscia. L&#39;effetto combinato aumenta il flusso sanguigno e la permeabilità vascolare nel sito di infiammazione 4. Una varietà di modelli animali di allergia sono stati sviluppati al fine di studiare i meccanismi coinvolti nell&#39;infiammazione allergica, compresi i modelli di asma allergica, anafilassi sistemica, e anafilassi locali. Somministrazione endovenosa colorante è stato utilizzato per misurare le reazioni allergiche localizzate in modelli animali per quasi un secolo, con pubblicazioni che descrivono questa tecnica risalente al 1920 5. Conigli e porcellini d&#39;India sono stati i primi modelli animali utilizzati per testare le reazioni immediate di ipersensibilità, e le risposte più sensibili sono stati generalmente presenti nell&#39;orecchio 5,6. Il dosaggio è stato successivamente convalidato per l&#39;uso in ratti e topi 7 8. Storicamente,una varietà di metodi sperimentali sono stati utilizzati, compresa l&#39;iniezione di antigene prima dell&#39;iniezione del colorante, iniezione di colorante prima dell&#39;iniezione di antigene, e l&#39;iniezione contemporanea di colorante e l&#39;antigene. Somministrazione endovenosa colorante come mezzi per misurare le risposte allergiche è un test versatile in quanto può essere utilizzato per misurare attiva, passiva, e invertire reazioni passive 5,9. Numerosi coloranti sono stati utilizzati per valutare reazioni allergiche, tra cui Trypan Blue, Pontamine Cielo Blu, Blu di Evans, Geigy Blu 536, e l&#39;India Ink 5,6,9. Una soluzione di 0,5% Blu di Evans è attualmente il colorante standard utilizzato per misurare le risposte allergiche della pelle. La risposta anafilattica alla sfida è transitoria; intensità massima viene raggiunta entro 10 - 15 minuti di iniezione colorante, e nessuna reazione è visibile se colorante viene somministrato più di 30 minuti dopo la sfida, indipendentemente dalle specie animali utilizzate 9. Quantificazione di colorante stravaso era originalely ottenuta misurando dimensione pomfo come indicato dal colorante blu 7-9. Inoltre, conti di mastociti degranulati possono essere quantificati da asportare tessuto cutaneo dal sito della reazione e la colorazione con blu di toluidina 7. Degranulazione dei mastociti è spesso usato come marker per cutanea, reazioni allergiche IgE-mediate, come mastociti sono la principale popolazione di cellule locale che esprime il recettore ad alta affinità per le IgE FcεRI. Tecniche spettrofotometriche per la misurazione colorante stravaso nei tessuti sono stati sviluppati per anafilassi cutanea passiva (PCA) nel ratto e topo 10 11 nel 1990. Il seguente protocollo del saggio anafilassi locale è stato adattato da Kojima et al. 1, e utilizza ovoalbumina uova di gallina (OVA) come l&#39;antigene per suscitare reazioni allergiche. Tuttavia, antigeni diversi OVA possono essere utilizzati se lo si desidera. Il test utilizza quindi Blu di Evans colorante per monitorare i cambiamenti in permeabilit vascolarey che si verificano a causa di mastociti IgE cross-linking e il rilascio di istamina.

<table><tbody><tr><td>BALB/c Mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Quality Biologic</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma</td><td>A5503-10G</td><td></td></tr><tr><td>Imject Alum</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Mix thoroughly before use</td></tr><tr><td>Evans Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>295876</td><td>99%+ Spectrophotometric grade</td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-474-06</td><td></td></tr><tr><td>1cc Insulin syringes</td><td>BD</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle</td><td>Terumo</td><td>NDC 100861</td><td></td></tr><tr><td>27 G Needles</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene round-bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Medical Supply Partners</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottom 96 well plate</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Rodent Anesthesia System</td><td>VetEquip</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Model G560 with 3 inch platform</td></tr></tbody></table>

measuring local anaphylaxis in mice

Reazioni allergiche sono il risultato dell&#39;attivazione dei mastociti e basofili e il successivo rilascio di vasoattivo e mediatori proinfiammatori. L&#39;esposizione ad un allergene in una persona sensibilizzata può causare sintomi clinici che variano da eritema lieve a pericolo di vita anafilassi. In laboratorio, sono stati sviluppati diversi modelli animali per capire i meccanismi di guida reazioni allergiche. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per misurare i cambiamenti della permeabilità vascolare per quantificare le risposte allergiche localizzate. Il saggio anafilassi locale è stata segnalata per la prima nel 1920, ed è stato adattato dalla tecnica pubblicata da Kojima et al. nel 2007 1. In questo saggio, i topi sensibilizzati al OVA sono sfidati nel orecchio sinistro con il veicolo e l&#39;orecchio destro con OVA. Questa è seguita da una iniezione endovenosa di Blu di Evans colorante. Dieci minuti dopo l&#39;iniezione di Blu di Evans, l&#39;animale è eutanasia e il colorante che è uscito dai vasi inper le orecchie viene estratto durante la notte in formammide. L&#39;assorbanza del colorante estratto viene poi quantificato con uno spettrofotometro. Questo metodo assicura in maniera affidabile una manifestazione visiva e quantificabile di una reazione allergica locale.

Gli animali che hanno subito il test con successo avranno la pelle e gli occhi che appaiono blu. PBS animali sensibilizzati non dovrebbero reagire a uno o PBS sfida OVA, quindi entrambe le orecchie dovrebbero rimanere bianco (Figura 1A). Negli animali sensibilizzati OVA, l&#39;orecchio riceve la sfida PBS (sinistra) dovrebbe essere completamente bianca o leggermente blu in modo localizzato nel sito di iniezione. L&#39;orecchio riceve la sfida OVA (a destra) dovrebbe diventare progressivamente più scuro...

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Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Reazioni allergiche, caratterizzate da attivazione dei mastociti e dei basofili, sono guidati dal cross-linking delle IgE e il rilascio di mediatori proinfiammatori. Una valutazione quantitativa delle risposte allergiche può essere ottenuto utilizzando Evans colorante blu per monitorare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dopo la sfida allergene.

Misurare Anafilassi locali nei topi

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.2K Views.  Uniformed Services University of the Health Sciences.  Reazioni allergiche, caratterizzate da attivazione dei mastociti e dei basofili, sono guidati dal cross-linking delle IgE e il rilascio di mediatori proinfiammatori. Una valutazione quantitativa delle risposte allergiche può essere ottenuto utilizzando Evans colorante blu per monitorare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dopo la sfida allergene. 

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modello murino di asma indotta da allergene

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is less straightforward than it is in human patients. A widely used behavioral surrogate for hypnosis in rodents is the loss of righting reflex (LORR), or the point at which the animal no longer responds to their innate instinct to avoid the vulnerability of dorsal recumbency. We have developed a system to assess LORR in 24 mice simultaneously while carefully controlling for potential confounds, including temperature fluctuations and varying gas flows. These chambers permit reliable assessment of anesthetic sensitivity as measured by latency to return of the righting reflex (RORR) following a fixed anesthetic exposure. Alternatively, using stepwise increases (or decreases) in anesthetic concentration, the chambers also enable determination of a population's sensitivity to induction (or emergence) as measured by EC50 and Hill slope. Finally, the controlled environmental chambers described here can be adapted for a variety of alternative uses, including inhaled delivery of other drugs, toxicology studies, and simultaneous real-time monitoring of vital signs.

Loss of the righting reflex has long served as a standard behavioral surrogate for unconsciousness, also called hypnosis, in laboratory animals. Alterations in volatile anesthetic sensitivity caused by pharmacological interventions can be detected with a carefully controlled high-throughput assessment system, which may be adapted for delivery of any inhaled therapeutic.

Valutare Variazioni Volatile generale anestetico sensibilità dei topi dopo l&#39;intervento farmacologico locale o sistemica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Medicina

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Neuroscienze

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biologia

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for vaccination as well as understand how pathogenic antibody responses develop in allergies and autoimmune disease. Generating robust antigen-specific antibody responses is not always trivial. In mouse models, it often requires multiple rounds of immunizations with adjuvant that leads to a great deal of variability in the levels of induced antibodies. One example is in mouse models of peanut allergies where more robust and reproducible models that minimize mouse numbers and the use of adjuvant would be beneficial. Presented here is a highly reproducible mouse model of peanut allergy anaphylaxis. This new model relies on two key factors: (1) antigen-specific splenocytes are adoptively transferred from a peanut-sensitized mouse into a na&#239;ve recipient mouse, normalizing the number of antigen-specific memory B- and T-cells across a large number of mice; and (2) recipient mice are subsequently boosted with a strong multivalent immunogen in the form of liposomal nanoparticles displaying the major peanut allergen (Ara h 2). The major advantage of this model is its reproducibility, which ultimately lowers the number of animals used in each study, while minimizing the number of animals receiving multiple injections of adjuvant. The modular assembly of these immunogenic liposomes provides relatively facile adaptability to other allergic or autoimmune models that involve pathogenic antibodies.

Described is the preparation of antigenic liposomal nanoparticles and their use in stimulating B-cell activation in vitro and in vivo. Consistent and robust antibody responses led to the development of a new peanut allergy model. The protocol for generating antigenic liposomes can be extended to different antigens and immunization models.

Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

Misurazione della temperatura corpo del mouse utilizzando il termometro a infrarossi durante passiva anafilassi sistemica e la valutazione di allergia alimentare

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

Modello di iniezione guancia per la misurazione simultanea del dolore e dei comportamenti correlati all'itch

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Analysis of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor-Producing T Helper Cells in a Mouse Model of Contact Hypersensitivity

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified as a distinct subset of T helper cells (GM-CSF+ IFN-&#947;- IL-17A- IL-22- effector CD4+ T cells) in human and mice. Contact hypersensitivity (CHS) is considered an excellent animal model for allergic contact dermatitis (ACD) in human, manifesting an intact T cell-mediated immune response. To provide a standardized and comprehensive assay to analyze the Th-GM cell subset in the T cell-dependent immune response in vivo, a murine CHS model was induced by sensitization/challenge with a reactive, low-molecular-weight, organic hapten, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB). The Th-GM subset in effector CD4+ T cells generated upon immunization with the hapten was analyzed by flow cytometry. We found that Th-GM was mainly expanded in lesions and draining lymph nodes in the DNFB-induced CHS mouse model. This method can be applied to further study the biology of Th-GM cells and pharmacological research of therapeutic strategies centered on GM-CSF in various conditions, such as ACD.

<meta charset="utf8"></head><body>Analisi delle cellule T helper produttrici di fattori stimolanti le colonie di granulociti-macrofagi in un modello murino di ipersensibilità da contatto

Here, we present a simple and standardized method of analyzing the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper subset in vivo.

Analisi delle cellule T helper produttrici di fattori stimolanti le colonie di granulociti-macrofagi in un modello murino di ipersensibilità da contatto

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified ...

Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an objective laboratory method that may help to study the CHS reaction in mice, which can be measured and quantified by various tests. To induce CHS, on day "0", mice were sensitized on a previously shaved spot by abdominal skin painting with the hapten 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB) in an acetone-ethanol mixture, whereas negative control mice were sham sensitized with vehicle alone-acetone-ethanol mixture. On day "4", the baseline ear thickness was measured with a micrometer prior to the elicitation of CHS (challenge) by painting both ears with diluted TNCB both in the test and control groups. After 24 h, the ear swelling was measured with a micrometer. CHS is an example of a T cell-mediated immune response that causes swelling in inflamed tissue, peaking 24 h after the skin challenge with the same hapten. An increase in ear edema correlated with augmented ear weight, myeloperoxidase (MPO) activity, pro-inflammatory cytokine concentration in the ear extracts, increased thickening of the edematous dermis in the histological examination, and ear vascular permeability. There was also an increase in the concentration of TNP-specific IgG1 antibodies in the sera of the test group when compared with the control mice. Additionally, CHS can be successfully transferred with the CHS-effector cells obtained from donors previously sensitized with TNCB. The CHS-effector cells were administered intravenously into na&#239;ve recipient mice, which were subsequently challenged with the same diluted hapten. Ear swelling was measured with a micrometer 24 h later.

Contact hypersensitivity (CHS) is a murine experimental model of allergic contact dermatitis (ACD). CHS is based on sensitization with reactive hapten by painting the shaved skin of the chest and abdomen, with a subsequent ear skin challenge with a diluted hapten, causing a swelling reaction that is assessed in various ways.

Ipersensibilità da contatto come modello murino di dermatite allergica da contatto

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an ...

Misurare Anafilassi locali nei topi

Riepilogo

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Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

Misurazione della temperatura corpo del mouse utilizzando il termometro a infrarossi durante passiva anafilassi sistemica e la valutazione di allergia alimentare

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Analisi delle cellule T helper produttrici di fattori stimolanti le colonie di granulociti-macrofagi in un modello murino di ipersensibilità da contatto

Analisi delle cellule T helper produttrici di fattori stimolanti le colonie di granulociti-macrofagi in un modello murino di ipersensibilità da contatto

Ipersensibilità da contatto come modello murino di dermatite allergica da contatto