The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.

1. الفئران توعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون عن طريق تمييع OVA OVA في برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز النهائي من 20 ملغ / مل. تجميد أسفل مأخوذة في cryovials وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق واحد أو أكثر aliquots من 20 ملغ / مل الأسهم OVA إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع OVA في برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في أنبوب 5 مل البوليسترين جولة القاع مع قبعة. دوامة لفترة وجيزة لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين عقد أنبوب البوليسترين التي تحتوي على 1 ملغ / مل OVA على دوامة وضعت في سرعة متوسطة، إضافة حجم مساو من المتجانس تماما Imject الشب (40 ملغ / مل) قطرة قطرة مع الاستمرار في دوامة أنبوب لإنتاج نسبة 1: 1 ل الشب لمستمنع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء على أنبوب وأنبوب الشريط لدوامة. تحويل دوامة على أدنى الإعداد والسماح OVA بأن يمتص إلى الشب لمدة 30 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تسمح كمية كبيرة من الوقت لتمرير بين إعداد OVA / الشب وتوعية الفئران. إذا التوعية لا يمكن إتمام مباشرة بعد OVA / الشب preparatأيون، مخزن OVA / الشب في درجة حرارة الغرفة. دوامة لمدة 1 دقيقة قبل استخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الأنسولين حقنة 1 مل مع OVA / الشب الخليط. سقف الحقنة مع إبرة قياس 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 100 ميكرولتر من OVA / الشب في الصفاق من BALB / ج الفئران لجرعة في الماوس من 50 ميكروغرام من OVA و 2 ملغ من الشب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمراقبة سلبية، توعية مجموعة أخرى من الفئران إلى برنامج تلفزيوني. إعداد 1: 1 خليط من الشب وPBS في بنفس الطريقة المذكورة أعلاه، حذف OVA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توعية جميع الفئران (OVA والسيطرة PBS) مرة واحدة في الأسبوع لمدة 3 أسابيع ليصبح المجموع 3 الحقن. بعد الحقن النهائي، انتظر على الأقل 2 أسابيع قبل إجراء فحص الحساسية المفرطة المحلي. </li></ol> 2. المحلية العوار الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب OVA محلول المخزون إلى درجة حرارة الغرفة. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وتمييع 20 ملغ / مل الأسهم OVA إلى تركيز النهائي من 5 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني (1: 4 التخفيف من OVA في 1X PBS). دوامة لفترة وجيزة لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران باستخدام RC 2 &lt;/ سوب&gt; القوارض نظام التخدير (أو نظام مماثل تسليم يتبخر). ملء خزان مع isoflurane، وبدوره على تدفق الهواء O 2. مكان الفئران في غرفة تحريض وضبط قرص التحكم الأيزوفلورين إلى 5٪ لبدء التخدير. مرة واحدة يتم تخدير الفئران تماما، يتبين من عدم الحراك، وضبط قرص التحكم الأيزوفلورين إلى 3٪ للحفاظ على التخدير العميق. الغرض من التخدير في هذا الإجراء هو شل الحيوان. الحقن الأذن والذيل الوريد لا تسبب الألم أو الضيق كبيرا للحيوان. ملاحظة: الأيزوفلورين يمكن أن يكون لها آثار سلبية على الجهاز التناسلي البشري. تأكد من استخدام في غرفة جيدة التهوية وإرفاق اسطوانة الكسح إلى غرفة تحريض لتحييد النفايات الغازية. إذا كنت حاملا أثناء استخدام الأيزوفلورين، وارتداء قناع فلتر الكربون لتقليل التعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل OVA إلى حقنة الأنسولين 3/10 سم مكعب توج مع إبرة 31 G. تحميل 3/10 سم مكعب حقنة الأنسولين آخر مع 10 ميكرولترمن 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح، وضخ 10 ميكرولتر من OVA في الأذن اليمنى من الماوس تخدير لجرعة التحدي من 50 ميكروغرام من OVA. جرعات أخرى، مثل 20 ميكروغرام، هي أيضا مقبولة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق الاستقرار في الأذن للحقن، والتفاف الاسكتلندي (الجانب زجة متابعة) حوالي 15 مل أنبوب مخروطي. تأمين الجانب الظهري من الأذن اليمنى إلى الشريط. إدراج الجانب شطبة إبرة يصل بين الأوراق اثنين من الأذن. حقن ببطء OVA في وسط النسيج الأذن، مع الحرص على عدم ضرب أي الأوعية الدموية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نفس الطريقة المذكورة أعلاه، وضخ 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الأذن اليسرى كعنصر تحكم السلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 3 دقائق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذا الوقت، ضع الماوس في رادع وعقد ذيل تحت مصباح الحرارة أو في حمام ماء دافئ لمدة 1 دقيقة إلى تمدد الأوعية الدموية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 1 مل الأنسولين توج مع إبرة 27 G، حقن ببطء 200 ميكرولتر من 0.5٪ ايفانز الأزرق صبغة في الذيل الخامسعين من الفأرة. تدار الحقن السريع قد تدمر هيكل السفينة قبل كامل 200 ميكرولتر. إذا حدث هذا، محاولة لحقن حجم ما تبقى من الصبغة في الوريد على الجانب الآخر من الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس وإزالة كلتا الأذنين باستخدام ملقط ومقص جراحي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على حواف الأذن مع ملقط، والتأكد من أن أي ضغط يطبق على موقع الحقن في مركز الأذن. إزالة أكبر قدر ممكن من أنسجة الأذن ممكن عن طريق خفض بالقرب من، ولكن ليس من خلال سلسلة من التلال الغضروف الحاضر في قاعدة الأذن. كميات صغيرة من الفراء قد تكون موجودة على الأذن استئصاله. هذا لن يؤثر على الفحص. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 700 ميكرولتر من الفورماميد إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إعداد أنبوب واحد في الأذن (أنبوبين في الماوس). ملاحظة: الفورماميد هو ماسخة، مطفرة، ومصدرا للإزعاج. ارتداء القفازات، وحماية العين، وحماية الوجه. النساء الحوامل يجب توخي الحذر عند التعامل معقد تكون ق الفورماميد سمي جنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى آذان الفورماميد، وكأب الأنابيب، واحتضان بين عشية وضحاها في حمام الحرارة الجافة المنصوص إلى 63 درجة مئوية. الأذنين قد لا تزال تظهر اللون الأزرق قليلا بعد الحضانة. ولكن يتم استخراج معظم الصبغة في الفورماميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من كل عينة من نسختين إلى 96 لوحة جيدا. تجنب نقل الفراء إذا كان موجودا في العينة. ضمان عدم وجود فقاعات الموجودة في الآبار، لأنها سوف تؤثر على القراءة الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من الفورماميد، في نسختين، إلى 96 لوحة جيدا. وسوف تستخدم هذه الآبار والفراغات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مطياف لقياس الامتصاصية في 620 نانومتر. آبار الفورماميد طرح من كل قراءة العينة. ملاحظة: تم تنفيذ جميع التجارب في إطار البروتوكولات وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة الخدمات الموحدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Kojima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+Bbasophils+are+selectively+activated+in+vitro+and+in+vivo+through+CD200R3+in+an+IgE-independent+manner.">Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner.</a> The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).</li><li>Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+enzymes+in+mast+cell+granules+and+their+potential+role+in+allergic+rhinitis.">Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).</li><li>Amin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mast+cells+in+allergic+inflammation.">The role of mast cells in allergic inflammation.</a> Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).</li><li>Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+histamine+receptor+subtypes+in+human+inferior+turbinates.">Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).</li><li>Ramsdell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Trypan+Blue+to+demonstrate+the+immediate+skin+reaction+in+rabbits+and+guinea+pigs.">The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs.</a> The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).</li><li>Chase, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+sensitization+of+animals+with+simple+chemical+compounds:+X.+Antibodies+inducing+immediate-type+skin+reactions.">Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).</li><li>Goose, J., Blair, A. M. J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+rat,+induced+with+two+homologous+reagin-like+antibodies+and+its+specific+inhibition+with+disodium+cromoglycate.">Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate.</a> Immunology. 16, 749-760 (1969).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+reactions+in+the+skin+of+experimental+animals+provoked+by+antibody-antigen+interactoin.">Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin.</a> Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitiative+evaluation+of+passive+cutaneous+anaphylaxis+(PCA)+using+a+hand-held+spectrophotometer.">Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).</li><li>Teshima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+spectrophotometric+analysis+of+passive+and+active+ear+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وتستخدم علامات عديدة من أمراض الحساسية لتقييم قوة استجابات حساسية التالية التحدي حساسية، بما في ذلك التغيرات في مستويات تعميم الهستامين، إنتاج السيتوكينات الاستجابة Th2، وتجنيد خلية في السائل القصبات في وضع التحدي مجرى الهواء. في حين رصد التغيرات في هذه المعايير ال?...

وبوساطة النوع الأول من فرط الحساسية الناجمة عن مستضد عبر ربط إيج على سطح الخلايا البدينة والخلايا القاعدية. وهذا يؤدي إلى تحبب الخلوية والإفراج عن وسطاء فعال في الأوعية وproinflammatory مثل الهستامين، تريبتاز، وعامل تنشيط الصفائح الدموية 2. وعقب صدور سطاء بريفورميد خلال تحبب الخلايا البدينة توليف والافراج عن البروستاجلاندين و leukotrienes، التي تزيد من نفاذية الأوعية الدموية 3. وتحدث هذه الاستجابة السريرية الأولية بسرعة ويشار إليه على أنه &quot;رد فعل فوري&quot;. في الجلد، استجابة الانتفاخ و-مضيئة مرئيا بسهولة في غضون دقائق من التحدي مستضد. اعتمادا على جرعة من التحدي، فمن الممكن لمراقبة &quot;رد مرحلة متأخرة&quot; بعد بضع ساعة. ويرجع ذلك إلى وذمة موضعية والتوظيف الكريات البيض في الأنسجة 2 أواخر مرحلة التورم. الهستامين، يعتبر عموما أن يكون الوسيط الرئيسي يشاركون فياستجابات حساسية مباشرة، يعمل على مستقبلات الهستامين أعرب 1 (HR1) على السفن ومستقبلات الهستامين 2 (HR2) أعرب على العضلات الملساء. التأثير المشترك يزيد من تدفق الدم ونفاذية الأوعية الدموية في موقع الالتهاب 4. وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج حيوانية من الحساسية وذلك لدراسة الآليات التي تشارك في الالتهاب التحسسي، بما في ذلك نماذج من الربو التحسسي، الحساسية المفرطة النظامية، والحساسية المفرطة المحلية. وقد استخدمت إدارة صبغة عن طريق الوريد لقياس استجابات حساسية موضعية في نماذج حيوانية لمدة قرن تقريبا، مع المنشورات التي تصف هذه التقنية التي يعود تاريخها إلى 1920s 5. كانت الأرانب والخنازير الغينية على نماذج حيوانية الأولى المستخدمة لاختبار تفاعلات فرط الحساسية المباشرة، وعثر الردود الأكثر حساسية عموما في الأذن 5،6. تم التحقق من صحة الفحص في وقت لاحق للاستخدام في الجرذان والفئران 7 8. تاريخيا،وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية، بما في ذلك حقن مستضد قبل حقن الصبغة، حقن الصبغة قبل حقن المستضد، وحقن صبغة في وقت واحد والمستضد. إدارة صبغة عن طريق الوريد كوسيلة لقياس استجابات حساسية هي فحص تنوعا لأنها يمكن أن تستخدم لقياس نشطة، سلبية، وعكس ردود فعل سلبية 5،9. وقد استخدمت الأصباغ العديدة لتقييم استجابات حساسية، بما في ذلك التريبان الأزرق، Pontamine السماء الزرقاء، ايفانز الأزرق، الأزرق غايغي 536، والهند الحبر 5،6،9. هناك حل من 0.5٪ ايفانز الأزرق حاليا الصبغة القياسية المستخدمة لقياس استجابات حساسية في الجلد. الاستجابة إلى التحدي الحساسية هي عابرة. يتم التوصل إلى الحد الأقصى لكثافة الداخل 10 - 15 دقيقة من حقن الصبغة، وأي رد فعل مرئيا إذا كانت تدار صبغة أكثر من 30 دقيقة بعد التحدي، بغض النظر عن أنواع الحيوانات المستخدمة 9. كان الكمي لصبغ تسرب الأصليلاي الحصول عليها عن طريق قياس حجم الانتفاخ كما يدل على ذلك صبغة زرقاء 7-9. بالإضافة إلى ذلك، تهم الخلايا البدينة degranulated يمكن كميا بواسطة استئصال أنسجة الجلد من موقع رد الفعل وتلطيخ مع طولويدين الأزرق 7. وكثيرا ما يستخدم تحبب الخلايا البدينة كعلامة للالجلدي، استجابات حساسية إيج بوساطة، والخلايا البدينة هي خلية السكان المحليين الرئيسي معربا عن تقارب عالية إيج مستقبلات FcεRI. تم تطوير تقنيات طيفية لقياس تسرب الصبغة في الأنسجة الجلدية الحساسية المفرطة للالسلبي (PCA) في الفئران والفأر 10 11 في عام 1990. وقد تم تكييف البروتوكول الحساسية المفرطة فحص المحلية التالية من كوجيما وآخرون. 1، ويستخدم ألبومين البيض بيض الدجاج (OVA) كما مستضد لانتزاع استجابات حساسية. ومع ذلك، مستضدات أخرى من OVA قد تستخدم اذا شئت. ثم يستخدم الفحص ايفانز الأزرق صبغ لرصد التغيرات في الأوعية الدموية permeabilitذ التي تحدث بسبب الصاري خلية إيج عبر ربط وإطلاق الهستامين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BALB/c Mice</td>
			<td style="width:167px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:167px;">Quality Biologic</td>
			<td style="width:135px;">114-058-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A5503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Imject Alum</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:135px;">77161</td>
			<td style="width:225px;">Mix thoroughly before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Evans Blue Dye</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">E2129</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Formamide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">295876</td>
			<td style="width:225px;">99%+ Spectrophotometric grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Isoflurane, USP</td>
			<td style="width:167px;">Phoenix</td>
			<td style="width:135px;">NDC 57319-474-06</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1cc Insulin syringes</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">329654</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3/10 cc Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td style="width:167px;">Terumo</td>
			<td style="width:135px;">NDC 100861</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">27G Needles</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">305109</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Forceps</td>
			<td style="width:167px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:135px;">11000-12</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:167px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:135px;">14070-12</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">5ml Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td style="width:167px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.5ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Medical Supply Partners</td>
			<td style="width:135px;">15-1151</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">15ml Conical tubes</td>
			<td style="width:167px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:135px;">352097</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Flat-bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:167px;">Costar</td>
			<td style="width:135px;">3590</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">RC2 Rodent Anesthesia System</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:135px;">922100</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Vortex Genie 2</td>
			<td style="width:167px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:135px;">SI-0236</td>
			<td style="width:225px;">Model G560 with 3 inch platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring local anaphylaxis in mice

استجابات حساسية هي نتيجة لتنشيط الخلايا البدينة والخلايا القاعدية، وإطلاق سراح لاحق من فعال في الأوعية والوسطاء proinflammatory. التعرض لمسببات الحساسية في الأفراد الحساسين يمكن أن يؤدي إلى الأعراض السريرية التي تختلف من حمامي طفيف إلى الحساسية المفرطة التي تهدد الحياة. في المختبر، وقد تم تطوير نماذج حيوانية مختلفة لفهم آليات القيادة استجابات حساسية. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لقياس التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية لقياس استجابات حساسية موضعية. وذكرت وفحص الحساسية المفرطة المحلي أولا في 1920s، وقد تم تكييفها من تقنية نشرته كوجيما وآخرون. في عام 2007 1. في هذا الاختبار، يتم الطعن الفئران توعيتهم OVA في الأذن اليسرى مع السيارة وفي الأذن اليمنى مع OVA. ويلي ذلك حقنة في الوريد من ايفانز الأزرق صباغة. عشرة دقيقة بعد حقن ايفانز الأزرق، والموت الرحيم للحيوان والصبغة التي extravasated فيالى الاسماع يستخرج بين عشية وضحاها في الفورماميد. ثم يتم كميا امتصاص الصبغة المستخرجة مع طيفي. هذه الطريقة النتائج بشكل موثوق في مظهر البصرية وقابل للقياس للاستجابة تحسسية المحلية.

والحيوانات التي خضعت للفحص بنجاح يكون الجلد والعيون التي تظهر باللون الأزرق. يجب توعية PBS الحيوانات لا تتفاعل إما برنامج تلفزيوني أو OVA التحدي، ينبغي أن تظل بالتالي كلتا الأذنين الأبيض (الشكل 1A). في الحيوانات OVA توعية، الأذن تلقي التحدي PBS (يسار) وينبغي أن تكون...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Local Anaphylaxis in Mice at JoVE.com

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

استجابات حساسية، والتي تتميز تنشيط الخلايا البدينة والخلايا القاعدية، ويقودها الربط عبر ال IgE وإطلاق وسطاء proinflammatory. ويمكن تحقيق التقييم الكمي للاستجابات حساسية باستخدام ايفانز الأزرق صبغ لرصد التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية بعد التحدي حساسية.

قياس الحساسية المفرطة المحلية في الفئران

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K Views.  Uniformed Services University of the Health Sciences.  استجابات حساسية، والتي تتميز تنشيط الخلايا البدينة والخلايا القاعدية، ويقودها الربط عبر ال IgE وإطلاق وسطاء proinflammatory. ويمكن تحقيق التقييم الكمي للاستجابات حساسية باستخدام ايفانز الأزرق صبغ لرصد التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية بعد التح...

Video: Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

Measurement of &amp;#947;HV68 Infection in Mice

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

قياس γHV68 العدوى في الفئران

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry

Decreased red cell deformability is characteristic of several disorders. In some cases, the extent of defective deformability can predict severity of disease or occurrence of serious complications. Ektacytometry uses laser diffraction viscometry to measure the deformability of red blood cells subject to either increasing shear stress or an osmotic gradient at a constant value of applied shear stress. However, direct deformability measurements are difficult to interpret when measuring heterogenous blood that is characterized by the presence of both rigid and deformable red cells. This is due to the inability of rigid cells to properly align in response to shear stress and results in a distorted diffraction pattern marked by an exaggerated decrease in apparent deformability. Measurement of the degree of distortion provides an indicator of the heterogeneity of the erythrocytes in blood. In sickle cell anemia, this is correlated with the percentage of rigid cells, which reflects the hemoglobin concentration and hemoglobin composition of the erythrocytes. In addition to measuring deformability, osmotic gradient ektacytometry provides information about the osmotic fragility and hydration status of erythrocytes. These parameters also reflect the hemoglobin composition of red blood cells from sickle cell patients. Ektacytometry measures deformability in populations of red cells and does not, therefore, provide information on the deformability or mechanical properties of individual erythrocytes. Regardless, the goal of the techniques described herein is to provide a convenient and reliable method for measuring the deformability and cellular heterogeneity of blood. These techniques may be useful for monitoring temporal changes, as well as disease progression and response to therapeutic intervention in several disorders. Sickle cell anemia is one well-characterized example. Other potential disorders where measurements of red cell deformability and/or heterogeneity are of interest include blood storage, diabetes, Plasmodium infection, iron deficiency, and the hemolytic anemias due to membrane defects.

Here we present techniques to measure red cell deformability and cellular heterogeneity by ektacytometry. These techniques are applicable to general investigations of red cell deformability and specific investigations of blood diseases characterized by the presence of both rigid and deformable red cells in circulation, such as sickle cell anemia.

قياس ديفورمابيليتي وعدم تجانس الخلايا الحمراء في الدم من اكتاسيتوميتري

Decreased red cell deformability is characteristic of several disorders. In some cases, the extent of defective deformability can predict severity of ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

وصف الاستجابات ايستب الغلوبولين المناعي تعتمد على الغدة الصعترية، والغدة الصعترية مستقلة في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

قياس درجة حرارة الجسم الماوس استخدام الأشعة تحت الحمراء الحرارة خلال تاق الجهازية السلبي وتقييم الحساسية الغذائية

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

القياس الكمي لتصلب الشرايين في الفئران

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

العلاج المناعي بالتبني من خلايا iNKT في الجلوكوز-6-الفوسفات Isomerase (G6PI) الناجمة عن الفئران RA

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

قياس كثرة الفندره من الرشاشيات تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية باستخدام تدفق الخلوي

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...