The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.

1. souris Sensibiliser <ol><li> Préparer une solution stock OVA par dilution de l&#39;OVA en 1x PBS à une concentration finale de 20 mg / ml. Congeler bas aliquotes dans des cryotubes et conserver à -80 ° C pour une utilisation future. </li><li> Apportez un ou plusieurs aliquotes de 20 mg / ml OVA actions à la température ambiante. Diluer OVA dans du PBS 1x à une concentration finale de 1 mg / ml dans un tube en polystyrène de 5 ml à fond rond avec un capuchon. Vortex brièvement pour mélanger. </li><li> Tout en maintenant le tube en polystyrène contenant 1 mg / ml OVA sur un vortex réglé à vitesse moyenne, ajouter un volume égal de bien homogénéisé Imject alun (40 mg / ml) goutte à goutte tout en continuant à vortex le tube pour produire un rapport de 1: 1 de L&#39;alun de immunogène. </li><li> Placez bouchon sur le tube et la bande tube vortex. Tournez vortex sur le réglage le plus bas et permet OVA pour adsorber Alum pendant 30 min. <ol><li> Ne laissez pas une grande quantité de temps à passer entre la préparation OVA / alun et la sensibilisation des souris. Si la sensibilisation ne peut être effectuée directement après OVA / Alum preparation, magasin OVA / Alum à la température ambiante. Vortex pour 1 min avant de l&#39;utiliser. </li></ol></li><li> Charger un 1 ml seringue à insuline avec le mélange OVA / Alum. Boucher la seringue avec une aiguille de calibre 27. </li><li> Injecter 100 ul de OVA / alun dans le péritoine de souris BALB / c à une dose de 50 par souris pg d&#39;OVA et 2 mg d&#39;alun. </li><li> Pour un témoin négatif, sensibiliser un autre groupe de souris à PBS. Préparer un mélange 1: 1 de PBS et alun de la même manière que ci-dessus, en omettant l&#39;OVA. </li><li> Sensibiliser toutes les souris (OVA et PBS contrôle) une fois par semaine pendant 3 semaines pour un total de 3 injections. Après injection final, attendre au moins 2 semaines avant l&#39;analyse de l&#39;anaphylaxie locale. </li></ol> 2. local anaphylaxie Assay <ol><li> Apportez OVA solution stock à la température ambiante. Dans un tube de 1,5 ml, diluer 20 mg / ml OVA actions à une concentration finale de 5 mg / ml avec du PBS (dilution 1: 4 d&#39;OVA dans du PBS 1X). Vortex brièvement pour mélanger. </li><li> Anesthésier la souris en utilisant RC 2 &lt;/ Sup&gt; Système d&#39;anesthésie rongeurs (ou système comparable de livraison vaporisé). Remplir le réservoir avec de l&#39;isoflurane, et tourner sur O 2 flux d&#39;air. La place la souris dans la chambre induction et ajuster molette de commande isoflurane à 5% pour initier une anesthésie. Une fois les souris sont entièrement anesthésié, indiqué par manque de mobilité, ajuster molette de commande isoflurane à 3% pour maintenir l&#39;anesthésie profonde. Le but de l&#39;anesthésie dans cette procédure consiste à immobiliser l&#39;animal. Les injections oreille et la queue veines ne causent pas de douleur importante ou une détresse à l&#39;animal. NOTE: L&#39;isoflurane peut avoir des effets négatifs sur le système reproductif humain. Veillez à utiliser dans une pièce bien aérée et joindre une cartouche de balayage de la chambre d&#39;induction pour neutraliser le gaz des déchets. Si vous êtes enceinte pendant l&#39;utilisation de l&#39;isoflurane, porter un masque de filtre de carbone pour minimiser l&#39;exposition. </li><li> Charge: 10 ul de 5 mg / ml d&#39;OVA dans une seringue à insuline de 10.3 cc coiffé avec une aiguille 31 G. Charger une autre seringue à insuline 3/10 cc avec 10 ulde 1 x PBS. </li><li> En utilisant un microscope à dissection, injecter 10 pi de OVA dans l&#39;oreille droite d&#39;une souris anesthésiée pour une dose de 50 mg d&#39;OVA de défi. D&#39;autres doses, par exemple 20 ug, sont également acceptables. <ol><li> Pour stabiliser l&#39;oreille pour injection, enrouler la bande de scotch (côté collant de haut) autour d&#39;un tube de 15 ml conique. Fixer la face dorsale de l&#39;oreille droite de la bande. Insérez le côté aiguille conique entre les deux feuilles de l&#39;oreille. Injecter lentement OVA dans le centre du tissu de l&#39;oreille, en prenant soin de ne pas frapper des vaisseaux sanguins. </li></ol></li><li> En utilisant la même méthode décrite ci-dessus, l&#39;injection de 10 ul de PBS dans l&#39;oreille gauche comme témoin négatif. </li><li> Attendre 3 min. <ol><li> Pendant ce temps, placer la souris dans un dispositif de retenue et tenir la queue sous une lampe chauffante ou dans un bain d&#39;eau chaude pendant 1 min à dilater les vaisseaux sanguins. </li></ol></li><li> En utilisant une seringue de 1 ml d&#39;insuline coiffé d&#39;une aiguille 27 G, injecter lentement 200 pi de 0,5% colorant bleu Evans dans la queue vein de la souris. Une injection rapide peut détruire la structure du bateau avant tout le 200 pi est administré. Dans ce cas, la tentative d&#39;injecter le volume restant de colorant dans la veine du côté opposé de la queue. </li><li> Attendez 10 min. </li><li> Euthanasier la souris et enlever les deux oreilles à l&#39;aide de pinces et de ciseaux chirurgicaux. <ol><li> Saisir les bords de l&#39;oreille avec une pince, en prenant soin qu&#39;aucune pression n&#39;est appliquée au site d&#39;injection au centre de l&#39;oreille. Eliminer le plus tissu de l&#39;oreille que possible en coupant tout près de, mais pas à travers, la crête du cartilage présent à la base de l&#39;oreille. De petites quantités de poils peuvent être présents sur l&#39;oreille excisé; cela n&#39;affecte pas le dosage. </li></ol></li><li> Aliquote de 700 pi de formamide dans 1,5 ml microtubes. Préparer un tube par l&#39;oreille (deux tubes par la souris). REMARQUE: Le formamide est tératogène, mutagène, et un irritant. Porter des gants, des lunettes de protection et un masque de protection. Les femmes enceintes devraient faire preuve de prudence lors de la manipulation d&#39;uns formamide peut être foetotoxique. </li><li> Ajouter oreilles au formamide, boucher les tubes, et incuber pendant la nuit dans un bain de chaleur sèche réglé sur 63 ° C. Oreilles peuvent encore être légèrement bleu après incubation; Toutefois, la majorité de la teinture est extrait dans le formamide. </li><li> Ajouter 300 ul de chaque échantillon en double exemplaire, à une plaque à 96 puits. Éviter de transférer fourrure si elle est présente dans l&#39;échantillon. S&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles présentes dans les puits, car ils influeront sur la lecture de l&#39;absorbance. </li><li> Ajouter 300 ul de formamide, en double exemplaire, à la plaque de 96 puits. Ces puits seront utilisés comme des blancs. </li><li> Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l&#39;absorbance à 620 nm. Soustraire les puits de formamide de chaque lecture de l&#39;échantillon. NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux Université services en uniforme. </li></ol>

<ol>
	<li>Kojima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+Bbasophils+are+selectively+activated+in+vitro+and+in+vivo+through+CD200R3+in+an+IgE-independent+manner.">Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner.</a> The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).</li><li>Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+enzymes+in+mast+cell+granules+and+their+potential+role+in+allergic+rhinitis.">Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).</li><li>Amin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mast+cells+in+allergic+inflammation.">The role of mast cells in allergic inflammation.</a> Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).</li><li>Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+histamine+receptor+subtypes+in+human+inferior+turbinates.">Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).</li><li>Ramsdell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Trypan+Blue+to+demonstrate+the+immediate+skin+reaction+in+rabbits+and+guinea+pigs.">The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs.</a> The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).</li><li>Chase, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+sensitization+of+animals+with+simple+chemical+compounds:+X.+Antibodies+inducing+immediate-type+skin+reactions.">Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).</li><li>Goose, J., Blair, A. M. J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+rat,+induced+with+two+homologous+reagin-like+antibodies+and+its+specific+inhibition+with+disodium+cromoglycate.">Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate.</a> Immunology. 16, 749-760 (1969).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).</li><li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+reactions+in+the+skin+of+experimental+animals+provoked+by+antibody-antigen+interactoin.">Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin.</a> Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitiative+evaluation+of+passive+cutaneous+anaphylaxis+(PCA)+using+a+hand-held+spectrophotometer.">Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).</li><li>Teshima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+spectrophotometric+analysis+of+passive+and+active+ear+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse.">Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

De nombreux marqueurs de la maladie allergique sont utilisés pour évaluer la force des réactions allergiques suivantes provocation allergénique, y compris les changements dans les niveaux d&#39;histamine circulation, production de cytokines Th2, et le recrutement de cellules dans le liquide broncho dans le cadre de défi des voies respiratoires. Tout en surveillant les changements de ces paramètres est important pour l&#39;étude des réactions allergiques, des marqueurs biologiques ne correspondent pas toujours à...

Je hypersensibilité de type est médiée par l&#39;antigène induit la reticulation de l&#39;IgE à la surface des mastocytes et des basophiles. Cela se traduit par une dégranulation cellulaire et la libération de médiateurs vasoactifs et pro-inflammatoires telles que l&#39;histamine, la tryptase, et le facteur d&#39;activation des plaquettes 2. Après la libération de médiateurs préformés pendant la dégranulation, les mastocytes synthétisent et libèrent des prostaglandines et leucotriènes, qui augmentent encore la perméabilité vasculaire 3. La réponse clinique initiale se produit rapidement et est appelé une &quot;réaction immédiate&quot;. Dans la peau, une réponse papule et érythème est facilement visible à quelques minutes de provocation par l&#39;antigène. En fonction de la dose de la difficulté, il est possible d&#39;observer une &quot;réaction en phase tardive&quot; quelques heures plus tard. Fin gonflement de phase est due à un œdème localisé et le recrutement des leucocytes dans les tissus 2. L&#39;histamine, généralement considéré comme le principal médiateur de participer àréactions allergiques immédiates, agit sur des récepteurs de l&#39;histamine 1 (HR1) exprimé sur les navires et les récepteurs de l&#39;histamine 2 (HR2) exprimé sur le muscle lisse. L&#39;effet combiné augmente le flux sanguin et de la perméabilité vasculaire au niveau du site d&#39;inflammation 4. Une variété de modèles animaux d&#39;allergie ont été développées pour étudier les mécanismes impliqués dans l&#39;inflammation allergique, y compris des modèles d&#39;asthme allergique, l&#39;anaphylaxie systémique, et l&#39;anaphylaxie locale. Administration intraveineuse de colorant a été utilisé pour mesurer les réactions allergiques localisées dans des modèles animaux pour près d&#39;un siècle, avec des publications décrivant cette technique datant des années 1920 5. Les lapins et les cochons d&#39;Inde ont été les premiers modèles animaux utilisés pour tester les réactions d&#39;hypersensibilité immédiate, et les réponses les plus sensibles ont été généralement dans l&#39;oreille 5,6. Le test a été validé plus tard pour une utilisation chez les rats et les souris 7 8. Historiquement,une variété de méthodes expérimentales ont été utilisées, notamment par injection de l&#39;antigène avant l&#39;injection du colorant, du colorant injection avant l&#39;injection de l&#39;antigène, et l&#39;injection simultanée de l&#39;antigène et de colorant. Administration par voie intraveineuse de colorant comme un moyen pour mesurer les réponses allergiques est un dosage polyvalent car il peut être utilisé pour mesurer active, passive, et inverser les réactions passives 5,9. De nombreux colorants ont été utilisés pour évaluer les réactions allergiques, y compris Bleu Trypan, Pontamine Blue Sky, Evans Bleu, Bleu Geigy 536, et l&#39;encre de Chine 5,6,9. Une solution de 0,5% de bleu d&#39;Evans est actuellement le colorant de référence utilisé pour mesurer les réponses allergiques de la peau. La réponse anaphylactique défi est transitoire; l&#39;intensité maximum est atteint dans les 10 - 15 min après l&#39;injection de colorant, et aucune réaction visible si colorant est administrée plus de 30 minutes après la provocation, quelle que soit l&#39;espèce animale utilisées 9. La quantification de l&#39;extravasation de colorant d&#39;origine étaitment obtenue par la mesure de la taille papule, comme indiqué par le colorant bleu 9.7. En outre, les chiffres de mastocytes dégranulés peuvent être quantifiés par l&#39;excision de tissus de la peau sur le site de la réaction et coloration au bleu de toluidine 7. Dégranulation des mastocytes est souvent utilisé comme un marqueur pour cutanée, des réactions allergiques médiées par les IgE, comme les mastocytes sont la principale population de cellules exprimant locale de haute affinité des IgE récepteur FceRI. Techniques spectrophotométriques pour mesurer colorant extravasation dans les tissus ont été développés pour l&#39;anaphylaxie cutanée passive (PCA) chez le rat et la souris 10 11 dans les années 1990. Le protocole de test de l&#39;anaphylaxie locale suivant a été adapté à partir de Kojima et al. 1, et utilise l&#39;ovalbumine d&#39;oeuf de poulet (OVA) comme antigène pour induire des réponses allergiques. Cependant, les antigènes autres que l&#39;OVA peuvent être utilisés si on le souhaite. Le test utilise ensuite colorant bleu Evans à surveiller les changements dans permeabilit vasculairey qui se produisent en raison de mastocytes IgE réticulation et la libération d&#39;histamine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BALB/c Mice</td>
			<td style="width:167px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:167px;">Quality Biologic</td>
			<td style="width:135px;">114-058-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A5503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Imject Alum</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:135px;">77161</td>
			<td style="width:225px;">Mix thoroughly before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Evans Blue Dye</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">E2129</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Formamide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">295876</td>
			<td style="width:225px;">99%+ Spectrophotometric grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Isoflurane, USP</td>
			<td style="width:167px;">Phoenix</td>
			<td style="width:135px;">NDC 57319-474-06</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1cc Insulin syringes</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">329654</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3/10 cc Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td style="width:167px;">Terumo</td>
			<td style="width:135px;">NDC 100861</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">27G Needles</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">305109</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Forceps</td>
			<td style="width:167px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:135px;">11000-12</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:167px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:135px;">14070-12</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">5ml Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td style="width:167px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.5ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Medical Supply Partners</td>
			<td style="width:135px;">15-1151</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">15ml Conical tubes</td>
			<td style="width:167px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:135px;">352097</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Flat-bottom 96 well plate</td>
			<td style="width:167px;">Costar</td>
			<td style="width:135px;">3590</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">RC2 Rodent Anesthesia System</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:135px;">922100</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Vortex Genie 2</td>
			<td style="width:167px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:135px;">SI-0236</td>
			<td style="width:225px;">Model G560 with 3 inch platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring local anaphylaxis in mice

Les réactions allergiques sont le résultat de l&#39;activation des mastocytes et les basophiles, et la libération subséquente de médiateurs pro-inflammatoires et vasoactifs. L&#39;exposition à un allergène chez un individu sensibilisé peut entraîner des symptômes cliniques qui varient de l&#39;érythème mineur à la vie en danger anaphylaxie. Au laboratoire, différents modèles animaux ont été mis au point pour comprendre les mécanismes d&#39;entraînement des réactions allergiques. Nous décrivons ici un procédé détaillé destiné à mesurer les changements dans la perméabilité vasculaire de quantifier les réponses allergiques localisées. Le dosage de l&#39;anaphylaxie locale a été signalée pour la première dans les années 1920, et a été adapté à partir de la technique publié par Kojima et al. en 2007 1. Dans cet essai, des souris sensibilisées à l&#39;OVA sont contestées dans l&#39;oreille gauche avec le véhicule et dans l&#39;oreille droite avec l&#39;OVA. Ceci est suivi par une injection intraveineuse de colorant bleu d&#39;Evans. Dix minutes après l&#39;injection de bleu d&#39;Evans, l&#39;animal est euthanasie et le colorant qui s&#39;est épanché danspour les oreilles est extraite pendant une nuit dans du formamide. L&#39;absorbance du colorant extraite est ensuite quantifiée avec un spectrophotomètre. Cette méthode permet de manière fiable une manifestation visuelle et quantifiée d&#39;une réaction allergique locale.

Les animaux qui ont subi le test avec succès auront la peau et les yeux qui apparaissent en bleu. PBS animaux sensibilisés ne doivent pas réagir à PBS ou le défi de l&#39;OVA, donc les deux oreilles doivent rester blanc (figure 1A). Chez les animaux sensibilisés OVA, l&#39;oreille recevoir le défi PBS (à gauche) doit être soit complètement blanc ou légèrement bleu de façon localisée au niveau du site d&#39;injection. L&#39;oreille recevoir le défi OVA (à droite) devrait devenir progressi...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Local Anaphylaxis in Mice at JoVE.com

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Les réponses allergiques, caractérisé par l&#39;activation des mastocytes et des basophiles, sont entraînés par la reticulation d&#39;IgE et la libération de médiateurs pro-inflammatoires. Une évaluation quantitative de réactions allergiques peut être obtenue en utilisant le colorant bleu d&#39;Evans pour suivre l&#39;évolution de la perméabilité vasculaire après provocation allergénique.

Mesure de l&#39;anaphylaxie locaux chez la souris

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K vues.  Uniformed Services University of the Health Sciences.  Les réponses allergiques, caractérisé par l'activation des mastocytes et des basophiles, sont entraînés par la reticulation d'IgE et la libération de médiateurs pro-inflammatoires. Une évaluation quantitative de réactions allergiques peut être obtenue en utilisant le colorant bleu d'Evans pour suivre l'évolution de la perméabilité vasculaire après provocation allergénique. 

Vidéo: Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mesure de l&#39;activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Recherche

Immunologie et infection

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

Measurement of &amp;#947;HV68 Infection in Mice

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

Mesure de γHV68 infection chez les souris

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry

Decreased red cell deformability is characteristic of several disorders. In some cases, the extent of defective deformability can predict severity of disease or occurrence of serious complications. Ektacytometry uses laser diffraction viscometry to measure the deformability of red blood cells subject to either increasing shear stress or an osmotic gradient at a constant value of applied shear stress. However, direct deformability measurements are difficult to interpret when measuring heterogenous blood that is characterized by the presence of both rigid and deformable red cells. This is due to the inability of rigid cells to properly align in response to shear stress and results in a distorted diffraction pattern marked by an exaggerated decrease in apparent deformability. Measurement of the degree of distortion provides an indicator of the heterogeneity of the erythrocytes in blood. In sickle cell anemia, this is correlated with the percentage of rigid cells, which reflects the hemoglobin concentration and hemoglobin composition of the erythrocytes. In addition to measuring deformability, osmotic gradient ektacytometry provides information about the osmotic fragility and hydration status of erythrocytes. These parameters also reflect the hemoglobin composition of red blood cells from sickle cell patients. Ektacytometry measures deformability in populations of red cells and does not, therefore, provide information on the deformability or mechanical properties of individual erythrocytes. Regardless, the goal of the techniques described herein is to provide a convenient and reliable method for measuring the deformability and cellular heterogeneity of blood. These techniques may be useful for monitoring temporal changes, as well as disease progression and response to therapeutic intervention in several disorders. Sickle cell anemia is one well-characterized example. Other potential disorders where measurements of red cell deformability and/or heterogeneity are of interest include blood storage, diabetes, Plasmodium infection, iron deficiency, and the hemolytic anemias due to membrane defects.

Here we present techniques to measure red cell deformability and cellular heterogeneity by ektacytometry. These techniques are applicable to general investigations of red cell deformability and specific investigations of blood diseases characterized by the presence of both rigid and deformable red cells in circulation, such as sickle cell anemia.

Mesure de la déformabilité et hétérogénéité des globules rouges dans le sang par ektacytomètre

Decreased red cell deformability is characteristic of several disorders. In some cases, the extent of defective deformability can predict severity of ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

Mesure de température de corps de souris avec le thermomètre à infrarouge pendant Passive systémique anaphylaxie et évaluation d’allergie alimentaire

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

Quantification de l'athérosclérose chez les souris

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Immunothérapie adoptive des cellules iNKT dans les souris de RA induites par l'isomérase de glucose-6-Phosphate (G6PI)

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...