We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

הערה: שלושה חלקים של הפרוטוקול מתארים את החשיפה המימית של תרופת DZNep ליתושי זחל, חשיפה מבוססת דם של DZNep לנשים בוגרות ללמוד את השפעתו של פוריות, ועיכוב hydrolase SAH ידי DZNep נמדד באמצעות טכניקת colorimetric פשוטה. ייצוג סכמטי של מבחני אלה מוצג באיור 1. 1. מבחני כילה נגד פיתוח והישרדות ילדותיים הערה: סעיף זה מסביר את השימוש בתרופה מסיס במים המשפיעה על התפתחות זחלי יתושים והישרדות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האץ ביצי gambiae על 28 מעלות צלזיוס במים מזוקקים (DH O 2) וזחלי instar להם 2 nd אחוריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח DNAse שש היטב, צלחת תרבית תאים חופשית RNAse ולשפוך 10 מיליליטר DH 2 O היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זחלי יתושים ב2 nd instar ולהוסיף 15 זחלים בכל טוב. לפני הוספת זחלי instar 2 nd לצלחת, עמ &#39;ut אותם על מגבת נייר במשך 2-3 שניות כדי להסיר עודפי מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות תווית עם קלטות בצבעים באקראי ניסוי. לייבל 2 בארות לריכוז מבחן על כל צלחת (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן hydrochloride 1 מ&quot;מ DZNep פתרון מניות (MW = 298.73) על ידי המסת DZNep 0.3 מ&quot;ג ב 1 מיליליטר של DH 2 O. הוספת פתרון מניות של DZNep.HCl לבארות שכותרתו כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר ו5.0 מיקרומטר. הערה: פתרון המניות יכול להיות מאוחסן על 4 ° C לטווח קצר (יום 1 לחודש) או -20 מעלות צלזיוס למשך זמן ארוך (יותר מאחד בחודש). הערה: תוספת של פתרון המניות לריכוזים האמורים לא תשנה את נפח מים בבארות באופן משמעותי. אולם במקרה של ריכוזים גבוהים בהרבה, רצוי לפזר את המתחם במדיום הזחל כדי למנוע דילול מיותר של המתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמות שווה של מזון דגי פתית היטב כל אחד. מכסה את הצלחתשל דגירה אותם ב 28 ° C באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התמותה ליתושי זחל שטופל DZNep ואינו מטופלים לאחר תקופת חשיפה של 24 שעות. להסיר ולסלק כל זחלים מתים. חזור על הקלטה זה כל יום עד שכל קוביית הזחלים או pupate ולהתגלות כמבוגרים. רשום את הגודל של זחלים בכל יום שני, כלומר, יום 0, 2, 4, 6, 8, עד שהם pupate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני פיתוח ותמותת זחל באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית הולמת. הערה: גרף עמודות ניתן להשתמש כדי לייצג את נתוני התמותה ב- Microsoft Excel. ניתוח רב משתני שונה (MANOVA) הופיע עם תוכנה כגון JMP או SPSS יגלה אם מינונים שונים של התרופה לגרום להישרדותם של זחלי יתושים שונים באופן משמעותי. </li></ol> 2. פוריות Assay על ידי מתן תרופות באמצעות מזין מלאכותי ליתושי נקבה הערה: סעיף זה מפרט את התוספת של התרופה לדםnd להאכיל אותו ליתושי נקבה בוגרים באמצעות מערכת מזין מלאכותית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כלובי יתושים בוגרים עם מספר שווה של יתושים ממין זכר ונקבה לשליטה וכלוב מבחן. לספק 10% תמיסת סוכר ספוגים בכדורי צמר גפן לשני כלובים עד הנקבות מוכנים להאכלה (3-5 ימים הוא אופטימליים עבור אנופלס gambiae). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 שעות לפני האכלת הדם, להסיר את כדורי צמר גפן כדי להבטיח נקבות רעבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שני מתקני האכלת דם מלאכותיים שמורכבים ממשפך הפוך רחב תחתית כוס (קוטר = 50 מ&quot;מ, אורך = 70 מ&quot;מ) ופלסטיק המקיף אטום עם דבק תעשייתי. צרף צינורות פלסטיק (קוטר = 7 מ&quot;מ) לשני שקעים &#39;מתקני ההאכלה (קוטר = 10 מ&quot;מ) באמצעות מחברים ליבוא ויצוא של מים. תווית שני מתקני ההאכלה כמו &quot;שליטה&quot; ו- &quot;5 מיקרומטר DZNep.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגוף חימום זמין מסחרי, הגדיר את התכנית להאכלה. ב&quot; תפריט &quot;ללכת&quot; הגדרות &quot;ובחר &quot;Setpoints&quot;; תוכניות שנטענו מראש יופיעו. בחר באפשרות &quot;SP1&quot; ולהגדיר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: גוף החימום מבטיח כי הדם מנוהל נשמר בטמפרטורה קבועה. הגדרות תכנית נוספות עשויות לשמש למיני יתושים או חרקים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא דלי במים ולטבול את גוף החימום למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה מרובעת של Parafilm (50 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) ולמתוח אותו לעשות סרט קרומי דק. מכסה את חלקו התחתון של מתקני ההאכלה המלאכותיים עם Parafilm. לחתוך חתיכת Parafilm (50 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ) אחרת, למתוח וסוגר את הקצוות של מתקני ההאכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את המערכת, חיבור מתקני ההאכלה וגוף חימום על ידי הצינורות. ברגע שסיים, לעבור על המערכת ובחר באפשרות &quot;SP1&quot;. לחץ על &quot;Enter&quot; כדי להפעיל את מערכת. הערה: המים יקבלו מחוממים ל 37 ° C ונשמר בטמפרטורה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג הטמפרטורת דואר של מים באמצעות מדחום בדלי המים. הערה: המחברים והצינורות לעזור לשמור על זרימה קבועה של מים במערכת, כך שהטמפרטורה של הדם נשארת על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מגש תחתון שטוח עם פתרון אקונומיקה 10% שישמש כדי לטהר כל נשפך דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של דם הכבשים defibrillated לצינור microcentrifuge. תווית זו כ&quot; שליטה &quot;. חזור על התהליך עבור הצינור הניסיוני שכותרתו &quot;5 מיקרומטר DZNep&quot; .Add μl 6 של פתרון מניות DZNep (ראה שלב 1.5) לצינור הניסיוני שכותרתו &quot;5 מיקרומטר DZNep&quot; בעדינות מערבב את הדם וסמים על ידי היפוכו כמה פעמים. דגירה צינור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להוסיף 2 מיליליטר של שליטה ודם מבחן לחלק העליון של מתקני האכלה שכותרתו בהתאם. מחק את פיפטה בפתרון אקונומיקה. לכסות את הכלוב עם שקית כהה ולנשום אוויר בכלוב מעת לעת כדי לעודד females להאכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו היתושים להאכיל למשך כ -30 דקות. ברגע ההאכלה הושלמה, לכבות את גוף החימום, לקחת את מתקני ההאכלה החוצה ולהפשיט את Parafilm. משרים את המזין בפתרון אקונומיקה למשך כ -5 דקות ולשטוף היטב במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתקני ההאכלה ולשים כדורי צמר גפן במי סוכר בכלובים במשך 48 שעות. מניחים צלחת ביצה המכילה מים ונייר סינון בכלובי לילה כדי להקל על הטלת ביצים. לייבל כל צלחת ביצה עם ריכוז מבחן או שליטה בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת הביצה למחרת ולבחון את המספר והמבנה של ביצים תחת מיקרוסקופ סטריאו. להשיג תמונות באמצעות תוכנת Q-colors5. לספור את מספר הביצים. לנתח הבדל במספר הביצים המתקבלות מכלובים בדיקה ובקרה. הערה: מבחן t מזווג ניתן להשתמש כדי לקבוע אם מספר הביצים שונים באופן משמעותי (p ≤0.05). </li></ol> 3. ביוכימיים Assay של יתוש אנזים עיכובעל ידי תרופות הערה: סעיף זה מתאר assay פעילות אנזים באמצעות DTNB כאינדיקטור לקבוע את ההשפעה של DZNep על עיכוב hydrolase SAH בזכר בוגר ויתושים ממין נקבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 HPO 4 פתרון 0.1 M Na (פוספט נתרן dibasic) על ידי הוספת 14.19 גרם של Na 2 HPO 4 לL 1 של DH 2 O. בשלב הבא, להכין 4 פתרון 0.1 M לאא 2 PO (פוספט נתרן monobasic) על ידי הוספת 13.79 גר &#39;לאא 2 PO 4 לL 1 של DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל M Na פתרון 0.1 2 HPO 4 עם פתרון 0.1 M לאא 2 PO 4 לpH 8.5. הערה: זה יהיה פתרון המניות החוזרת של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הומוגניזציה של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) על ידי הוספת 0.3% Triton X-100. הערה: פתרון הומוגניזציה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepare פתרון 1.6 מ&quot;מ SAH (MW = 384.4) על ידי המסת 6.15 מ&quot;ג של SAH ב 10 מיליליטר של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1.6 מ&quot;מ DTNB (MW = 396.4) על ידי המסת 6.3 מ&quot;ג של DTNB ב 10 מיליליטר של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). שמור את פתרון DTNB הטרי על קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ&quot;מ DZNep.HCl 1 (MW = 298.73) פתרון על ידי המסת 0.3 מ&quot;ג של DZNep ב1ml DH 2 O. בשלב הבא, לדלל את פתרון מ&quot;מ DZNep 1 לסדרה של ריכוזים מ1,000 מיקרומטר ל0.002 מיקרומטר ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את עיכוב hydrolase SAH ידי DZNep, להכין תמצית אנזים גולמי של יתושים: Homogenize 10 יתושים בוגרים שאינם דם-fed ב 1 מיליליטר של קר כקרח 0.1 M לאא 2 PO 4 (pH 8.5), המכילים 0.3% Triton X- 100, באמצעות homogenizer רקמת זכוכית. מעביר את homogenate לצינור microcentrifuge 1.5ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate 5 דקות ב10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. מעביר את supernatant לנקי1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. השתמש supernatant כמקור האנזים לassay ביוכימיים SAH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפול הריק (כלומר, לא DZNep, אין אנזים), להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, ו -100 μl 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) לבארות בודדות של 96-היטב, microplate תחתית שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשליטה (כלומר, אין DZNep), להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, 50 μl 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) ו -50 אנזים μl (hydrolase SAH מתקבל מתמצית גולמי) ליחיד בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפולי DZNep, להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, 50 אנזים μl ו -50 μl ריכוז DZNep נבחר לבארות בודדות. הכן 4 חזרות לכל טיפול ושליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצפיפות האופטית (OD) של דגימות אנזים SAH ב 405 ננומטר במשך 5 דקות במרווחים של 20 שניות באמצעות קורא microplate 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסר OD הריק משליטהnd טיפול OD המתקבל מכל טוב. לחשב את האחוזים הנותרים פעילות hydrolase SAH באמצעות המשוואה הבאה:% פעילות שיורי = (הטיפול OD / הבקרה OD) x 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ישנם מספר צעדים חיוניים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. עבור assay הזחל, יש להקפיד לתייג בצורה נכונה ולשכפל את כל ריכוז בדיקה. באופן אקראי, דגימות בדיקה והוספת הסכום המיועד של תרופה לבארות מבחן המתאימות היא חלק חשוב מניסיוני זה להגדיר. לפני הוספת זחלי היתושים instar 2 nd ...

מלריה היא אחראית למספר הגבוה ביותר של מקרי מוות הקשורים חרקים בעולם. 219 מיליון מקרים מוערכים מתרחשים מדי שנה ברחבי העולם, וכתוצאה מכך כ 660,000 מקרי מוות, בעיקר באפריקה 1. למרות מאמצי תוכניות מלריה, בפני מספר אתגרים. בעוד bednets חרקים טופלו ורכיבי מפתח צורת ריסוס שייר מקורה של התכנית, התנגדות לחומרי הדברה באוכלוסיות מקומיות לעכב את המאמצים אלה 2. הגידול המהיר באוכלוסיות יתושים עמידות חרקים מיוחסים במידה רבה ליכולתם של יתושי המלריה להסתגל במהירות לשינויים בסביבה שלהם ולנצל נישות שונות 3,4,5. כדי להתגבר על המנגנונים קיימים התנגדות חרקים, החקירה של מטרות הדברה רומן ותרכובות הדור הבא היא מוצדקת. פרוטוקול פשוט, צעד-אחר-צעד לקביעת היעילות של חומרי הדברה ניסיוניות בשלבי החיים השונים של מלריה מ &#39;osquitoes היה לשפר באופן משמעותי את המאמצים הללו. מחקרים פרמקולוגיים של שפעות תרופה על שורות תאים ומודלים של בעלי החיים הקימו את השימוש בסמים אפיגנטיים ככלי שימושי לויסות הגנטיקה והפיסיולוגיה של תאים ואורגניזמים. מתילציה DNA ושינוי היסטון שני מנגנונים אפיגנטיים המשפיעים על ביטוי גנים ביצורים רב-תאיים, מבלי לשנות את רצף ה- DNA הבסיסי 6. שינויי ההודעה translational כגון מתילציה לשחק תפקיד מכריע בשמירה על שלמות תאים וביטוי גנים, ועשויים להשפיע על מספר תהליכים בסיסיים 7,8,9. מחקר בכמה מיני חרקים הדגיש את החשיבות של אפיגנטיקה בתהליכים מעורבים אאוגנזה ותאי גזע תחזוקה 10, וכן פיצוי מינון 11. עם זאת, כגון היבטים בוקטורי מחלה טרם נחקרו. שימוש במתחם לווסת מערכת זו ביתושים עשוי לספק לנו במראות למסלולי יעד הדברה הרומן. 3-Deazaneplanocin (DZNep) הוא מעכב מתילציה היסטון ידוע, המשפיעים על סוגים שונים של הסרטן נחקרו 12,13,14,15,16. DZNep הוא תרופה יציבה מסיסים במים אפיגנטיים שבעקיפין מעכבת -methyltransferase N ליזין היסטון (EZH2), מרכיב של Polycomb המורכב המדכא 2 (PRC2) בתאי יונקים. PRC2 משחק תפקיד חשוב בויסות הצמיחה של תאי גזע ביצורים רב-תאיים, ומתילציה היסטון היא היבט מרכזי של השתקת גני PRC2 תיווך. בעכברי מדוכאי חיסון, תאים טרום שטופלו בDZNep הוכחו להיות פחות tumorigenic 17. תרופה זו הופכת משמשת לחקר מחלות אחרות, כגון מחלת כבד השומני שאינו אלכוהוליים, שבו הוא מעורבת EZH2 18. DZNep הוא מעכב -adenosylhomocysteine ​​S הוקם (SAH) hydrolase 19, 20. העיכוב של תוצאות hydrolase SAH בהצטברות של SAH ו, בתורו, מובילה לעיכוב של פעילות methyltransferase ידי הגבלת קבוצות תורמות מתיל זמינות. SAH הוא נגזר של חומצת אמינו מנוצל על ידי אורגניזמים רבים, כוללים חרקים, במסלולים המטבוליים שלהם. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי DZNep במינונים נמוכים עלולים להשפיע דיאפאוזה ולעכב את ההתפתחות בחרקים 21. כאן, פרוטוקול חזק כדי לחקור את ההשפעות של מתחם מסיס במים בשלבי חיים שונים של יתושים מפותח. שלושה החלקים של פרוטוקול זה כוללים הוראות לבחינת ההשפעות של מתחם מסיס במים ביתושים בוגרים, נקבות האכלה-דם למבוגרים, ופעילות אנזים של זכר בוגר ונקבת יתושים. ראשית, DZNep מומס במים ללמוד פיתוח יתושים בוגר והישרדות. המהלך זה מתבצע בשני ריכוזים להשוות כל הבדלים הנובעים מגידול של פי 10 בחשיפה לסמים. כדי לחקור את ההשפעה של תרופה על יתושי נקבה, DZNep הבוגרמתווסף לדם כבשים defibrillated והאכיל את הדם באופן מלאכותי לנקבות. בהמשך לכך, התוצאה של התרופה על פוריות נבחנה. לבסוף, assay פעילות אנזים מתבצע באמצעות 5,5&#39;-dithiobis- (חומצת 2-nitrobenzoic) (DTNB) כאינדיקטור לקבוע את ההשפעה של DZNep על עיכוב hydrolase SAH בזכר בוגר ויתושים ממין נקבה. בעוד פרוטוקול זה הוא פותח עם יתושים מלריה, אנופלס gambiae, זה יכול להתאים בקלות לחקר ההשפעות של תרכובות של ריבית על כל מינים של יתושים או חרקים אחרים. הטכניקות מפורטות בפרוטוקול זה לא יכולה להיות מיושמות ביעילות לתרופה עם מסיסות מוגבלת או לא במים או בתקשורת מימית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of the Reagent/Equipment&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:125px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorvall Fresco</td>
			<td>76003758</td>
			<td>A different centrifuge can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colored tape rolls</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S68134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTNB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DZNep.HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMLO305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg dish cups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter papers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-795E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass feeders</td>
			<td>Virginia Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass tissue homogenizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating element</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">NC0520091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Percival scientific</td>
			<td>I36VLC8</td>
			<td>A different incubator can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, &#160;2 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>22-283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.5 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-3154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-8643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo 7easy</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9384</td>
			<td>store at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

התנגדות חרקים מהווה בעיה גדולה עבור תוכניות שליטת מלריה. יתושים להתאים למגוון רחב של שינויים בסביבה במהירות, מה שהופך את המלריה לשלוט בעיה בכל מקום בארצות טרופיות. הופעתם של אוכלוסיות עמידות חרקים מצדיק את החקירה של מסלולי רומן יעד סמים ותרכובות לשליטת יתוש וקטור. תרופות אפיגנטיים מבוססות היטב בחקר הסרטן, אך לא הרבה ידועה על ההשפעות שלהם על חרקים. מחקר זה מספק פרוטוקול פשוט לבחינת ההשפעות הרעילות של 3-Deazaneplanocin (DZNep), תרופה ניסיונית אפיגנטיים לטיפול בסרטן, על וקטור המלריה, אנופלס gambiae. עליית ריכוז תלוי בתמותה וירידה בגודל נצפתה ביתושים בוגרים שנחשפו לDZNep, ואילו המתחם הפחית את הפוריות של יתושים בוגרים יחסית לשלוט טיפולים. בנוסף, חלה ירידה בסמים תלויים בS -adenosylhomocysteine ​​פעילות (SAH) hydrolase ביתושים בעקבות החשיפה לDZNep יחסי לשלוט טיפולים. פרוטוקולים אלה מספקים חוקר עם הליך פשוט, צעד-אחר-צעד כדי להעריך נקודות קצה טוקסיקולוגית מרובות עבור תרופה ניסיונית ו, בתורו, להפגין גישה רבת-שיניים ייחודיות לחקר ההשפעות הרעילות של תרופות אפיגנטיים מסיסים במים או תרכובות של עניין נגד יתושי וקטור וחרקים אחרים.

איור 1 הוא ייצוג סכמטי של מבחני; זה מתאר את השלבים השונים של ההליך המפורט במאמר זה. כפרוטוקול מבוסס על שלבי חיים שונים של יתושים, אין רצף מסוים כדי להיות במעקב במשך הניסויים המפורטים כאן. המשתמש יכול לבחור לנהל מבחני אחד או יותר באותו הזמן, בהתאם לזמינות מדגם. <...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Video: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

למנוע את התפשטות המלריה וקדחת דנגי באמצעות יתושים מהונדסים גנטית

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...