אנו מודים בני הזוג. אנתוני קורנל ולורה נוריס בUC Davis וד&quot;ר Katharina Kreppel באוניברסיטת גלזגו למתן דגימות יתושים מטנזניה. אנו מודים לגב &#39;Smita Das וד&quot;ר דאגלס נוריס מבית הספר לג&#39;ונס הופקינס לבריאות הציבור לשיתוף דגימות יתושים מזמביה. כמו כן, אנו מודים למר לי V. millon במעבדה לגנטיקה וטרינריים להכשרה בעיצוב assay. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק R01AI 078,183 וR21AI062929.

1. PCR הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל צבעי יסוד PCR (ראה טבלת S1 המשלים) בmicrotube 1.5ml. לכל אחד יש שני SNP פריימרים (קדימה ואחורה). ודא שהמניה הריכוז של כל צבע יסוד PCR נשמר ב 100 מיקרומטר. לעשות מספיק תערובת פריימר ל500-1,000 תגובות להפחית pipetting שגיאה וזמן על הספסל (ראה טבלת S2 המשלים). אם תרצה, להכין aliquots ל100-200 תגובות לכל צינור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קוקטייל PCR, כמתואר בפרוטוקול של היצרן (טבלת 1). הנפח 96 תגובות כולל הסככה של 20%. מערבולת הצינור המכיל קוקטייל PCR קל ו צנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 3 μl של קוקטייל PCR לבאר כל הלא עקף 96 צלחת גם. פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של הדנ&quot;א הגנומי המתאים של יתושים בכל טוב. הערה: תהליך קבלת הדנ&quot;א הגנומי ממ &#39;<html> רקמות osquito (ראש / חזה, בטן או כל גוף) מתוארות בספרויות אחרות 29-32. בחר פרוטוקול מיצוי DNA מתאים כדי לבדל את אלה עם Plasmodium בדם (הבטן) מיתושים מזהמים (Plasmodium בראש / החזה). אנחנו בדרך כלל להשתמש ב- DNA שחולץ מחלקי גוף (ראש / חזה או בבטן) של יתושים, כך ריכוז ה- DNA משתנה מ0.05-2ng / μl. למרות שסכתי תשומת DNA היא נמוכה מהמלצת היצרן (5-10ng / rxn), אנחנו בדרך כלל מקבלים SNP חזק קורא מ -98% מהדגימות DNA בלי ההגברה הגנום כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש בפרוטוקול thermocycler הבא כדי לבצע PCR הגברה: (1) 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, (2) 94 ° C למשך 30 שניות, (3) 56 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, (4) 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 , (5) חזרו על שלב (2) - (4) במשך 45 מחזורים, (6) 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, ו -4 אחיזת מעלות צלזיוס. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. SAP טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון אנזים SAP בצלחת גם 96 (ראה טבלה 2). לעבד 96 דגימות בצלחת. הנפח 96 תגובות כולל הסככה של 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הצינור של פתרון SAP אנזים קל ו צנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x. לוותר על 2 μl של פתרון אנזים SAP לכל אחד. שוב, פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם. דגירה את הצלחת באופן הבא: (1) 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות, (2) 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית את האנזים, (3) אחיזת C 4 מעלות. בסיום שלב זה, לאחסן את הצלחת ב -20 ° C לפני שתמשיך. לעבד את הצלחת מאוחסנת בתוך 2 שבועות. </li></ol> 3. SNP Extension <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צלחת המדגם היא קפוא לאחר טיפול SAP, לאפשר לו להפשיר לRT לפני שנמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת פריימר הארכה (נוסף הטבלה S2). לכל אחד יש SNP exte אחדפריימר nsion. שמור את מניית הריכוז של כל צבע יסוד הארכה ב -500 מיקרומטר. לחלופין, aliquot ל100-200 תגובות לכל צינור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת הארכה כמפורט בטבלה 3. 96 תגובת כרך כולל הסככה של 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הצינור של קוקטייל סיומת קלה וצנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x. לוותר על 2 μl של קוקטייל הארכה לכל אחד. שוב, פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם. Thermocycle הצלחת כפי שמוצג באיור 1. בשלב זה, להמשיך לספקטרומטר מסה או לאחסן את הצלחת ב -20 ° C עד 2 שבועות. </li></ol> 4. אוויר המוצרים הרחבה SNP לייעל ניתוח ספקטרומטריית המסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צלחת המדגם היא קפוא לאחר הארכה SNP, לאפשר לו להפשיר לRT לפני שנמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 15mg של שרף מcontainer לצלחת הגומה באמצעות כף מוארכת. השתמש במגרד להפיץ שרף לתוך הבארות של צלחת הגומה. לטאטא את המגרד מצד לצד פני צלחת הגומה כדי להפיץ את השרף. ודא שיש שרף בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד שרף עודף מצלחת הגומה באמצעות המגרד. בואו השרף עומד בצלחת הגומה לפחות 20 דקות. בעת נותנת השרף עומד בצלחת הגומה, להוסיף 41 μl מים כיתה HPLC היטב בכל צלחת המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את צלחת מדגם הפוכה, לצלחת הגומה. ודא המדגם מתאפס צלחת נגד הפוסט הקטן המעוגל של צלחת הגומה, שמיישר את הבארות בצלחת המדגם עם הבארות בצלחת הגומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק צלחת המדגם וצלחת הגומה יחד, בעדינות להעיף אותם מעל כל כך השרף נופל מצלחת הגומה לתוך הבארות של צלחת המדגם. הקש על צלחת הגומה כך השרף נופל לתוך צלחת המדגם. ודא שכל השרף בdi<html> צלחת mple נופלת לתוך בארות צלחת מדגם. צנטריפוגה את הצלחת ב3,200 XG למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צלחת המדגם על הכתף במשך 5 דקות בRT. Rotator חייב לסובב את צלחת המדגם של 360 מעלות על ציר הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחת המדגם ב3,200 XG במשך 5 דקות. לאחר שלב זה, לאחסן את צלחת המדגם ב -20 ° C עד 2 שבועות לפני שתמשיך לשלב הבא. </li></ol> 5. MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מוצר הארכת SNP המותנה על bioarray כגון SpectroCHIP לפי הוראות יצרן. אנו משתמשים בMassArray Nanodispenser לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שההעברה תסתיים, להגדיר כיצד מבחני וצלחות שיוקמו באתר assay. שם assay וצלחות כאלה שיש לכל צלחת מזהה ייחודי שמקשר לעיצוב assay הספציפי (משלימה לוח S3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay והצלחת הוגדרו, לרכוש ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מסה. </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת פרשנות נתונים בזמן אמת ניתוח PCR כמו Typer Analyzer או TyperViewer (Sequenom). לקבל נתונים ב.xml פורמט המכיל את פריסת המדגם, ספקטרוגרמה המונית לכל טוב, מידע הסמן כוללים שם, המוני צפוי לכל גרסה של SNP המקביל, וכל טעות או הודעות אזהרה הקשורים לכל תגובה. ראה איור 2 לספקטרוגרמה מסה וכתוצאה מכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח אשכולות גנוטיפ SNP על ידי קביעת סף הגילוי (גודל או יחס אות לרעש) וסובלנות / שונות אפשר לכל גנוטיפ. איור 3 מציג דוגמא של 04,707 #-KDR 2 אשכולות גנוטיפ SNP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את שיחות גנוטיפ SNP וכתוצאה מכך לתכנית גיליון אלקטרוני. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מד&quot;א מורכב מחמישה שלבים עיקריים: הגברה PCR, תגובת phosphatase אלקליין השרימפס (SAP), הארכת SNP, מוצר הארכת אוויר, וdesorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס - זמן טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסת 33-37. צעד ההגברה PCR הראשון מגביר DNA איגוף כל SNP כך שתבנית ה- DNA מספיק יהיה זמין בשלב הארכת SNP. תג...

arabiensis אנופלס, coluzzii אנופלס ואנופלס gambiae הם הווקטורים העיקריים האחראים להעברת מלריה באפריקה 1. שלושת מינים אלה הם מורפולוגית נבדלו 2 וניתן להבחין רק במבחנים מולקולריים 3-9. בנוסף, יש מבחני במורד הזרם רבים שנערכו באופן שגרתי כדי לסייע מחקרים אפידמיולוגיים וגנטיקת אוכלוסייה. אלה כוללים (1) assay genotyping לאיי התפצלות 10-12, (2) assay genotyping הכרת SNPs שאינו שם נרדף ב1,014 ה עמדת חומצת אמינו קודון של גן para (ההתנגדות לדפוק למטה, או kdr, SNP) 13 -18, (3) גילוי טפיל PCR 19-23, ו- (4) להקרנת DNA מארח ספציפי בmidguts יתוש 24,25. פיתחנו assay רב-זיהוי (מד&quot;א) שמשלב את כל מבחני הללו לתגובה זמנית בודדת במטרהalyzing מאפיינים חשובים אפידמיולוגיה של מלריה באפריקה. Assay מד&quot;א כולל סמנים מרובים לאיתור (1) מין (arabiensis א, א gambiae, coluzzii א, או אחר (אף אחד משלוש)), (2) התנגדות החרקים המיוצגות בkdr SNPs (שני L1014F וL1014S) , (3) נוכחות של שני טפילי מלריה עיקריים, Plasmodium falciparum וP. vivax, ו- (4) מקור דם מעופות אחד ושישה מארחי יונקים. באופן מסורתי, אלה מבחני נערכו בתגובות נפרדות שרשרת של פולימראז. כאשר כל אלה מבחני נעשים באמצעות פלטפורמת PCR קונבנציונלית, זה מחייב ביצוע 8-10 מבחני תגובת PCR ומלווה את צעדי ג&#39;ל אלקטרופורזה. כל תגובת PCR בודדת מהכנה לתוצאות תיעוד לוקחת 4-5 שעות, ואילו שיטת מד&quot;א שהוצגה כאן לוקחת בערך 5 שעות במכלול. זה שווה חיסכון של 90% בעלויות עבודה לבד. מד&quot;א שהוצג כאן עולה 5 $לדגימה לגנוטיפ כל 33 SNPs. זה הרבה פחות יקר מאשר מבחני בודדים agarose מבוסס ג&#39;ל, שעולים כ $ 1.50 לכל מדגם. מבחני איתור כל המאפיינים מכוסים על ידי מד&quot;א ידרשו מינימום של 8-10 מבחני מבוססי ג&#39;ל agarose נפרדים במחיר של 12-15 דולרים למדגם. יתר על כן, מד&quot;א מקטין באופן משמעותי את הסיכוי ליצירת שקר חיובי או שלילי על ידי שימוש בלפחות שלושה סמנים לכל גילוי טפיל או מקור מארח. הפלטפורמה שנוצלנו אינה מוגבלת למלריה, אבל ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים, כגון רפואה, רפואת וטרינרית, וביולוגיה בסיסית 26-28. במחקרים מעמיקים עמותה או גנטיקה של אוכלוסיות המחקרים שכללו מספר רב (לפי סדר 100s) של דגימות דורשים הקרנת מבחני עלות-תועלת לסמנים מרובים בו זמנית. רוב המחקרים שעושים שימוש בשניים או יותר מבחני PCR נפרדים יכולים ליישם את מד&quot;א לתוצאות מהר יותר בעלות נמוכה יותר. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

מתחם מיני אנופלס gambiae כולל המלריה העיקרית העברת יתושים באפריקה. כי מינים אלה הם בעלי חשיבות רפואית כגון, כמה תכונות הן בדרך כלל מאופיינות באמצעות מבחני מולקולריים לסיוע במחקרים אפידמיולוגיים. תכונות אלה כוללות זיהוי מינים, התנגדות חרקים, מצב זיהום טפיל, והעדפת מארח. מאז אוכלוסיות של מתחם אנופלס gambiae הן מורפולוגית נבדלו, תגובת שרשרת של פולימראז (PCR) משמשת באופן מסורתי לזיהוי מינים. ברגע שהמינים ידוע, כמה מבחני במורד הזרם מבוצעים באופן שיגרתי על מנת להבהיר מאפיינים נוספים. למשל, מוטציות הידועות כKDR בגן para להקנות עמידות נגד DDT וחומרי הדברה pyrethroid. בנוסף, מבחני צמודי אנזים immunosorbent (ELISAs) או מבחני PCR לגילוי DNA הטפיל Plasmodium המשמשים לאיתור טפילים הנמצאים ברקמות יתושים. לבסוף, combination של PCR ומעכל אנזים הגבלה ניתן להשתמש כדי להבהיר העדפת מארח (למשל, אדם לעומת דם בעלי חיים) על ידי הקרנת bloodmeal היתושים לDNA מארח ספציפי. פיתחנו assay רב-זיהוי (מד&quot;א) שמשלב את כל מבחני הנ&quot;ל ל33SNPs genotyping התגובה זמנית יחיד עבור 96 או 384 דגימות בכל פעם. בגלל מד&quot;א כולל סמנים מרובים עבור מינים, זיהוי Plasmodium, וזיהוי דם מארח, הסבירות ליצירת תוצאות חיוביות או שליליים שגויות מופחתת במידה ניכרת ממבחנים קודמים הכוללים סמן אחת בלבד לכל תכונה. assay חזק וזה פשוט יכול לזהות תכונות יתוש מפתח אלה חסכוניים ובשבריר של הזמן של מבחני קיימים.

זיהוי מינים: 5 SNPs הבא ביחד לזהות שלושה מינים (arabiensis א, א coluzzii וא gambiae) (לוח 4). אם מדגם הוא לא אחד משלושת המינים, שלושה SNPs (01,073-213, 04,679-157 ו10313 -052) לא מצליחים להגביר. גנוטיפ kdr ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes at JoVE.com

מבחן רב זיהוי ליתושים המעבירים מלריה | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Evolution

Speciation and Diversity

SCIENTISTS IN ACTION

13.0K Views.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Video: A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several genera of these whitefly-transmitted plant viruses (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) include several hundred species of emerging and economically significant pathogens of important food and fiber crops (reviewed by9,10,16). These viruses do not replicate in their vector but nevertheless are moved readily from plant to plant by the adult whitefly by various means (reviewed by2,6,7,9,10,11,17). For most of these viruses whitefly feeding is required for acquisition and inoculation, while for others only probing is required. Many of these viruses are unable or cannot be easily transmitted by other means. Therefore maintenance of virus cultures, biological and molecular characterization (identification of host range and symptoms)3,13, ecology2,12, require that the viruses be transmitted to experimental hosts using the whitefly vector. In addition the development of new approaches to management, such as evaluation of new chemicals14 or compounds15, new cultural approaches1,4,19, or the selection and development of resistant cultivars7,8,18, requires the use of whiteflies for virus transmission. The use of whitefly transmission of plant viruses for the selection and development of resistant cultivars in breeding programs is particularly challenging7. Effective selection and screening for resistance employs large numbers of plants and there is a need for 100% of the plants to be inoculated in order to find the few genotypes which possess resistance genes. These studies use very large numbers of viruliferous whiteflies, often several times per year.
Whitefly maintenance described here can generate hundreds or thousands of adult whiteflies on plants each week, year round, without the contamination of other plant viruses. Plants free of both whiteflies and virus must be produced to introduce into the whitefly colony each week. Whitefly cultures must be kept free of whitefly pathogens, parasites, and parasitoids that can reduce whitefly populations and/or reduce the transmission efficiency of the virus. Colonies produced in the manner described can be quickly scaled to increase or decrease population numbers as needed, and can be adjusted to accommodate the feeding preferences of the whitefly based on the plant host of the virus.
There are two basic types of whitefly colonies that can be maintained: a nonviruliferous and a viruliferous whitefly colony. The nonviruliferous colony is composed of whiteflies reared on virus-free plants and allows the weekly availability of whiteflies which can be used to transmit viruses from different cultures. The viruliferous whitefly colony, composed of whiteflies reared on virus-infected plants, allows weekly availability of whiteflies which have acquired the virus thus omitting one step in the virus transmission process.

Improving our understanding of and our ability to manage many of the insect-transmitted plant viruses requires the use of the vector. Insect transmission of plant viruses is a tritrophic interaction, and as such requires the manipulation of insects, virus, and plant. Vectors must be reared in large numbers and manipulated in such a way as to insure high rates of transmission to test plants. The basics of rearing and manipulating the whitefly, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), a vector of plant viruses belonging to several emerging plant virus genera, representing a large number of economically significant viruses is presented.

וירוסי צמח באמצעות העברת Whiteflies

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable production of mosquitoes is currently inhibited by the supply of fresh vertebrate blood. Alternatives to blood are required to promote efficient control strategies for malaria and other vector borne diseases that are transmitted by blood feeding insects. With this in mind, artificial liquid diets were formulated as substitutes for fresh vertebrate blood. Herein we report a blood-free artificial liquid diet that delivers feeding rates similar to blood and mimics the physiological effects of a fresh vertebrate blood meal. The diet induces ovarian and egg maturation of Anopheles mosquitoes and also produces good larval survival and development of functional adults. The formulated blood-free liquid diet is an important advance towards sustainable mosquito breeding in captivity and will reduce the maintenance costs of mosquito colonies and eliminate the need for fresh vertebrate blood.

A protocol is presented for formulation of a blood-free artificial diet to feed Anopheles mosquitoes in captivity. This diet has a similar performance to vertebrate blood and triggers oogenesis and egg maturation and produces viable adult progeny.

דיאטה ללא דם ליתושים Anopheline אחוריים

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts whose expression is associated with insecticide resistance phenotypes in Anopheles gambiae mosquitoes. The application can be used online or downloaded and used locally by anyone. The local application can be modified to add new insecticide resistance datasets generated from multiple -omics platforms. This guide demonstrates how to add new datasets and handle missing data. Furthermore, IR-TEx can be completely and easily recoded to use-omics datasets from any experimental data, making it a valuable resource to many researchers. The protocol illustrates the utility of IR-TEx in identifying new insecticide resistance candidates using the the microsomal glutathione transferase, GSTMS1, as an example. This transcript is upregulated in multiple pyrethroid resistant populations from C&#244;te D&#39;Ivoire and Burkina Faso. The identification of co-correlated transcripts provides further insight into the putative roles of this gene.

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx explores insecticide resistance-related transcriptional profiles in the species Anopheles gambiae. Provided here are full instructions for using the application, modifications for exploring multiple transcriptomic datasets, and using the framework to build an interactive database for collections of transcriptomic data from any organism, generated in any platform.

IR-TEx: שילוב נתונים קוד פתוח כלי אינטגרציה עבור נתונים גדולים הטרנססקריפט מיועד וקטור מלריה אנופלס gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been conducted to investigate the effect of gut microbes as a whole; however, different microbes could exert distinct effects toward the host. This article provides the methodology to study the effect of each specific mosquito gut microbe and the potential mechanism.
This protocol contains two parts. The first part introduces how to dissect the mosquito midgut, isolate cultivable bacteria colonies, and identify bacteria species. The second part provides the procedure to generate antibiotic-treated mosquitoes and reintroduce one specific bacteria species.

This article presents a protocol to investigate the effect of individual mosquito gut bacteria, including isolation and identification of mosquito midgut cultivable microbes, antibiotic depletion of mosquito gut bacteria, and reintroduce one specific bacteria species.

תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no prevention. Control of mosquito vectors can rely on chemicals applied to the immature and adult stages, which can contribute to the mortality of non-targets and more importantly, lead to insecticide resistance in the vector. The sterile insect technique (SIT) is a method of controlling populations of pests through the release of sterilized adult males that mate with wild females to produce non-viable offspring. This paper describes the process of producing sterile males for use in an operational SIT program for the control of Aedes aegypti mosquitoes. Outlined here are the steps used in the program including rearing and maintaining a colony, separating male and female pupae, irradiating and marking adult males, and shipping Aedes aegypti males to the release site. Also discussed are procedural caveats, program limitations, and future objectives.

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The sterile insect technique (SIT) is used to control specific, medically important mosquito populations that may be resistant to chemical controls. Here, we describe a method of mass rearing and preparation of sterile male mosquitoes for release in an operational SIT program targeting the Aedes aegypti mosquito.

הכנת יתושי Aedes aegypti זכרים מוקרנים ומסומנים לשחרור בתוכנית טכניקת חרקים סטרילית מבצעית

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...