We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

ملاحظة: الأجزاء الثلاثة للبروتوكول تصف التعرض مائي من المخدرات DZNep للبعوض اليرقات، والتعرض القائم على دم DZNep إلى الإناث البالغات لدراسة تأثيرها على الخصوبة، وSAH هيدرولاز تثبيط من قبل DZNep تقاس باستخدام تقنية اللونية البسيطة. ويرد التمثيل التخطيطي من هذه المقايسات في الشكل 1. 1. غير ناضج تنمية البعوض والوراثة فحوصات ملاحظة: يوضح هذا القسم استخدام دواء للذوبان في الماء الذي يؤثر على تطور يرقات البعوض والبقاء على قيد الحياة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هاتش A. البيض الغامبية في 28 ° C في الماء المقطر (DH 2 O) والخلفية منهم إلى 2 الثانية الطور اليرقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الدناز ستة جيدا، ريبونوكلياز خالية لوحة زراعة الخلايا وتصب 10 مل درهم 2 O إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد يرقات البعوض في 2 الثانية الطور وإضافة 15 يرقات لكل بئر. قبل إضافة 2 الثانية الطور اليرقات لوحة، صالتحرير لهم على منشفة ورقية لمدة 2-3 ثانية لإزالة الماء الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آبار التسمية مع الأشرطة مرمزة بطريقة عشوائية التجربة. تسمية 2 آبار في تركيز الاختبار على كل لوحة (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد هيدروكلوريد 1 ملم DZNep (MW = 298.73) حل الأسهم عن طريق إذابة 0.3 ملغ DZNep في 1 مل من درهم 2 O. إضافة محلول المخزون من DZNep.HCl إلى الآبار وصفت لتحقيق تركيز النهائي من 0.5 ميكرومتر و 5.0 ميكرومتر. ملاحظة: يمكن تخزين الحل السهم عند 4 ° C للالمدى القصير (1 يوم لمدة شهر) أو -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل (شهر أطول من واحد). ملاحظة: سوف إضافة محلول المخزون لتركيزات المذكورة أعلاه لا يغير من حجم المياه في الآبار بشكل كبير. ولكن في حالة تركيزات أعلى من ذلك بكثير، فإنه من المستحسن أن حل المجمع في المتوسط ​​اليرقات لتجنب أي تخفيف لزوم لها للمجمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مبلغ مساو من الأسماك الغذاء تقشر إلى كل بئر. تغطية لوحةالصورة واحتضان لهم في 28 ° C في حاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل وفيات للبعوض اليرقات DZNep المعاملة وغير المعالجة بعد فترة تعرض على مدار 24 ساعة. إزالة وتجاهل أي اليرقات الميتة. كرر هذا التسجيل كل يوم حتى جميع اليرقات يموت أو تخدر تصبح خادرة وتظهر وكأنها البالغين. تسجيل حجم اليرقات كل يوم الثاني على التوالي، أي يوم 0، 2، 4، 6، 8، حتى تخدر تصبح خادرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات تطوير وفيات اليرقات باستخدام برنامج التحليل الإحصائي المناسب. ملاحظة: رسم بياني شريط يمكن استخدامها لتمثيل البيانات وفيات في Microsoft Excel. تحليل التباين متعدد المتغيرات (MANOVA) يؤديها مع برامج مثل أحزاب اللقاء المشترك أو SPSS سوف تكشف إذا جرعات مختلفة من الدواء يؤدي إلى بقاء تختلف اختلافا كبيرا من يرقات البعوض. </li></ol> 2. الخصوبة الفحص بواسطة بإدارة المخدرات من خلال تغذية الاصطناعية لأنثى البعوض ملاحظة: تفاصيل هذا القسم إضافة الدواء إلى دمالثانية تغذية أن إناث البعوض الكبار باستخدام نظام تغذية الاصطناعي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء أقفاص البعوض الكبار مع عدد متساو من البعوض من الذكور والإناث من أجل السيطرة واختبار القفص. توفير 10٪ من محلول السكر غارقة في كرات القطن إلى كل من الأقفاص حتى الإناث على استعداد لتغذية (3-5 أيام والأمثل لالأنوفيلة الغامبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ساعة قبل تغذية الدم، وإزالة كرات القطن لضمان الإناث الجائعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع اثنين من مغذيات الدم الاصطناعية التي تتكون من واسع مقلوب قمع القاع الزجاجي (القطر = 50 ملم، وطول = 70 ملم) والبلاستيك المحيطة مختومة مع الغراء الصناعي. إرفاق أنابيب بلاستيكية (القطر = 7 ملم) لاثنين من منافذ مغذيات &quot;(القطر = 10 ملم) عن طريق وصلات لتدفق وتدفق المياه. تسمية مغذيات اثنين كما &quot;السيطرة&quot; و &quot;5 ميكرومتر DZNep&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عنصر التسخين المتاحة تجاريا، وإعداد برنامج للتغذية. في &quot;القائمة&quot; انتقل إلى &quot;إعدادات&quot;وحدد &quot;Setpoints&quot;. ستظهر البرامج المحملة مسبقا. حدد &quot;SP1&quot; وضبط درجة الحرارة لمدة 37 ° C. ملاحظة: يضمن عنصر التسخين أن دم تدار يتم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة. ويمكن استخدام إعدادات البرنامج إضافية للأنواع البعوض أو الحشرات المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء دلو من الماء وتزج عنصر التدفئة في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة مربع من بارافيلم (50 ملم × 50 ملم) وامتداد لتقديم فيلم غشائي رقيقة. تغطية الجزء السفلي من مغذيات اصطناعية مع بارافيلم. قطع قطعة أخرى من بارافيلم (50 ملم × 10 ملم)، وتمتد عليه وختم حواف مغذيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع النظام، وربط مغذيات وعنصر التسخين بواسطة الأنابيب. وبمجرد الانتهاء، والتحول على النظام وحدد &quot;SP1&quot;. اضغط على &quot;أدخل&quot; لبدء النظام. ملاحظة: إن الماء سوف تحصل تسخينها إلى 37 ° C والحفاظ على أن درجة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة عشردرجة الحرارة (ه) من الماء باستخدام ميزان حرارة في دلو الماء. ملاحظة: موصلات وأنابيب مساعدة في الحفاظ على دوران مستمر من المياه من خلال النظام بحيث أن درجة حرارة الدم لا يزال في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء علبة مسطحة القاع مع 10٪ محلول التبييض التي سيتم استخدامها لتطهير أي انسكابات الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من الدم الأغنام defibrillated لأنبوب microcentrifuge. تسمية هذا ب &quot;السيطرة&quot;. كرر العملية لأنبوب التجريبية وصفت بأنها &quot;5 ميكرومتر DZNep&quot; .Add 6 ميكرولتر من DZNep حل سهم (راجع الخطوة 1.5) إلى أنبوب التجريبي المسمى &quot;5 ميكرومتر DZNep&quot; المزيج برفق الدم والمخدرات عن طريق عكس ذلك عدة مرات. احتضان دقيقة أنبوب 10 في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، إضافة 2 مل من السيطرة واختبار الدم إلى الجزء العلوي من مغذيات وصفت تبعا لذلك. تجاهل ماصة في محلول التبييض. تغطية القفص مع حقيبة سوداء وتنفس الهواء في القفص بشكل دوري لتشجيع وemales للتغذية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للالبعوض تتغذى لحوالي 30 دقيقة. بمجرد الانتهاء من التغذية، وإيقاف عنصر التدفئة، واتخاذ مغذيات الخروج وتجريد بارافيلم. نقع وحدة التغذية في محلول التبييض لمدة 5 دقائق ويشطف جيدا في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مغذيات ووضع كرات من القطن مع الماء والسكر على الأقفاص لمدة 48 ساعة. وضع طبق البيض التي تحتوي على المياه ورقة الترشيح في أقفاص بين عشية وضحاها لتسهيل وضع البيض. تسمية كل طبق البيض مع اختبار أو السيطرة تركيز المعنيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طبق البيض اليوم التالي ودراسة عدد وهيكل من البيض تحت المجهر ستيريو. الحصول على الصور باستخدام برنامج Q-colors5. حساب عدد البيض. تحليل الفرق في عدد البيض التي تم الحصول عليها من اختبار ومراقبة أقفاص. ملاحظة: إن أونبايريد اختبار t يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان عدد البيض تختلف اختلافا كبيرا (ع ≤0.05). </li></ol> 3. الكيمياء الحيوية الفحص من البعوض انزيم تثبيطمن المخدرات ملاحظة: يصف هذا القسم مقايسة نشاط انزيم باستخدام DTNB كمؤشر لتحديد تأثير DZNep على SAH هيدرولاز تثبيط في الذكور البالغين وإناث البعوض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.1 M نا 2 هبو 4 (ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم) حل بإضافة 14.19 غرام من نا 2 هبو 4 الى 1 L من درهم 2 O. وبعد ذلك، إعداد 0.1 M ناه 2 PO 4 (أحادي فوسفات الصوديوم) حل بإضافة 13.79 غرام من ناه 2 PO 4 الى 1 L من درهم 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عاير 0.1 M نا 2 هبو 4 حل مع 0.1 M ناه 2 PO 4 حل لدرجة الحموضة 8.5. ملاحظة: سوف يكون هذا هو الحل الأسهم العمل من 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل تجانس 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5) وذلك بإضافة 0.3٪ تريتون X-100. ملاحظة: يمكن تخزين حل التجانس في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاقات العامةepare 1.6 ملي SAH (MW = 384.4) حل عن طريق إذابة 6.15 ملغ من SAH في 10 مل من 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 1.6 ملي DTNB (MW = 396.4) عن طريق إذابة 6.3 ملغ من DTNB في 10 مل من 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5). حافظ على حل DTNB الطازجة على الجليد حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 ملم DZNep.HCl (MW = 298.73) حل عن طريق إذابة 0.3 ملغ من DZNep في 1ML درهم 2 O. التالي، يخفف من 1 ملم DZNep حل في سلسلة من التركيزات من 1،000 ميكرومتر إلى 0.002 ميكرومتر في DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس هيدرولاز تثبيط SAH التي كتبها DZNep، وإعداد مستخلص إنزيم الخام من البعوض: التجانس 10 البعوض البالغ غير الدم التي تغذيها في 1 مل من الجليد الباردة 0.1 M ناه 2 PO 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5)، التي تحتوي على 0.3٪ تريتون X- 100، وذلك باستخدام الخالط الأنسجة الزجاجية. نقل جناسة لأنبوب 1.5ml ميكروسنتريفوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لجناسة لمدة 5 دقائق عند 10،000 x ج في 4 درجات مئوية. نقل طاف لتنظيف1.5 مل أنبوب microcentrifuge. استخدام طاف كمصدر للإنزيم للمقايسة البيوكيميائية SAH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعلاج فارغة (أي، لا DZNep، لا إنزيم)، إضافة 50 ميكرولتر 1.6 ملي SAH، 50 ميكرولتر 1.6 ملي DTNB، و 100 ميكرولتر 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5) إلى الآبار الفردية ل96-جيدا، صفيحة ميكروسكوبية مسطحة القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل السيطرة (أي، لا DZNep)، إضافة 50 ميكرولتر 1.6 ملي SAH، 50 ميكرولتر 1.6 ملي DTNB، 50 ميكرولتر 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5) و 50 ميكرولتر انزيم (SAH هيدرولاز الحصول عليها من استخراج النفط الخام) للفرد الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعلاج DZNep، إضافة 50 ميكرولتر 1.6 ملي SAH، 50 ميكرولتر 1.6 ملي DTNB، 50 ميكرولتر انزيم و 50 ميكرولتر اختيار تركيز DZNep إلى الآبار الفردية. إعداد 4 مكررات لكل معاملة والسيطرة عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الكثافة الضوئية (OD) من العينات انزيم SAH في 405 نانومتر لمدة 5 دقائق في 20 ثانية فترات باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح OD فارغة من السيطرة علىالثانية العلاج OD تم الحصول عليها من كل جانب. حساب في المئة المتبقية SAH النشاط هيدرولاز باستخدام المعادلة التالية:٪ آخر المتبقية = (علاج OD / OD التحكم) × 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هناك عدة خطوات حيوية لنجاح تطبيق هذا البروتوكول. للمقايسة اليرقات، ينبغي الحرص على تسمية بشكل صحيح وتكرار كل تركيز الاختبار. التعشءه عينات الاختبار وإضافة كمية معينة من المخدرات إلى الآبار اختبار كل جزء مهم من هذا التجريبية اقامة. قبل إضافة 2 الثانية الطور يرق?...

الملاريا هو المسؤول عن أكبر عدد من الوفيات المرتبطة حشرة في العالم. تحدث ما يقدر بنحو 219 مليون حالة سنويا في جميع أنحاء العالم، مما أدى إلى ما يقرب من 660،000 حالة وفاة، في المقام الأول في أفريقيا 1. على الرغم من الجهود المتضافرة، تواجه برامج مكافحة الملاريا العديد من التحديات. في حين المعالجة بمبيدات الحشرات ومكونات مفتاح شكل الرش الثمالي داخل المباني البرنامج، ومقاومة للمبيدات الحشرية في السكان المحليين تعرقل هذه الجهود 2. وتعزى الزيادة السريعة في مبيدات الحشرات أسراب البعوض المقاوم إلى حد كبير إلى قدرة البعوض الملاريا على التكيف بسرعة مع التغيرات في بيئتهم واستغلال منافذ مختلفة 3،4،5. للتغلب على الآليات القائمة لمقاومة المبيدات الحشرية، هناك ما يبرر استكشاف أهداف الحشرات رواية ومركبات الجيل القادم. A، خطوة بخطوة بروتوكول بسيط لتحديد مدى فعالية من المبيدات الحشرية التجريبية على مختلف مراحل حياة الملاريا مسوف osquitoes يعزز إلى حد كبير هذه الجهود. وقد أثبتت الدراسات الدوائية من آثار المخدرات على خطوط الخلايا والنماذج الحيوانية استخدام العقاقير جينية كأداة مفيدة لتحوير علم الوراثة وعلم وظائف الأعضاء من الخلايا والكائنات الحية. مثيلة الحمض النووي وتعديل هيستون نوعان من آليات جينية تؤثر على التعبير الجيني في الكائنات متعددة الخلايا دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي 6. التعديلات آخر متعدية مثل مثيلة تلعب دورا حاسما في الحفاظ على سلامة الخلوية والتعبير الجيني، ويمكن أن تؤثر العديد من العمليات الأساسية 7،8،9. وقد أبرزت الأبحاث في بعض أنواع الحشرات أهمية علم التخلق في العمليات التي تنطوي على مراحل تكوين البويضات وتنبع صيانة خلية 10، فضلا عن تعويض الجرعة 11. ومع ذلك، لا يزال يتعين استكشاف هذه الجوانب في ناقلات الأمراض. باستخدام مركب لتعديل هذا النظام في البعوض يمكن أن توفر لنا مع فيمشاهد في رواية مسارات الهدف الحشرات. 3-Deazaneplanocin ألف (DZNep) غير معروف مثبط هيستون مثيلة، والتي تم دراستها تأثير على أنواع مختلفة من السرطانات 12،13،14،15،16. DZNep هو للذوبان في الماء المخدرات مستقرة جينية الذي يمنع بشكل غير مباشر هيستون يسين N -methyltransferase (EZH2)، وهو مكون من polycomb القمعي معقدة 2 (PRC2) في خلايا الثدييات. PRC2 يلعب دورا هاما في تنظيم نمو الخلايا الجذعية في الكائنات متعددة الخلايا، وهيستون مثيلة هو جانب رئيسي من PRC2 بوساطة إسكات الجينات. في الفئران المناعة، وقد ثبت الخلايا المعالجة قبل مع DZNep إلى أن تكون أقل مكون للأورام 17. وأصبح يستخدم هذا الدواء لدراسة أمراض أخرى، مثل مرض الكبد الدهني غير الكحولي، والتي EZH2 هو متورط 18. DZNep هو ثابت S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) هيدرولاز مثبط 19 و 20. تثبيط النتائج هيدرولاز SAH فيتراكم SAH و، بدوره، يؤدي إلى تثبيط النشاط ناقلة الميثيل عن طريق الحد من المجموعات المانحة الميثيل المتاحة. SAH هو مشتق من الأحماض الأمينية التي تستخدمها العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الحشرات، في ممراتها الأيض. وقد أظهرت دراسة حديثة أن DZNep في الجرعات المنخفضة قد تؤثر على السكون وتأخير التنمية في الحشرات 21. هنا، يتم تطوير بروتوكول قوي للتحقيق في الآثار المترتبة على مجمع للذوبان في الماء على مختلف مراحل حياة البعوض. الأجزاء الثلاثة لهذا البروتوكول تتضمن تعليمات لدراسة الآثار المترتبة على مجمع للذوبان في الماء على البعوض غير ناضجة، الإناث الرضاعة الدم الكبار، ونشاط انزيم من الذكور البالغين وإناث البعوض. أولا، تم حل DZNep في الماء لدراسة تطوير البعوض غير ناضجة والبقاء على قيد الحياة. يتم تنفيذ ذلك في اثنين من تركيزات لمقارنة أي خلافات تنشأ عن زيادة بنسبة 10 أضعاف في التعرض للمخدرات. لاستكشاف تأثير المخدرات على إناث البعوض الكبار، DZNepيضاف إلى defibrillated الدم الأغنام وتغذية الدم اصطناعيا للإناث. وفي وقت لاحق، يتم فحص نتائج المخدرات على الخصوبة. وأخيرا، يتم تنفيذ انزيم النشاط فحص باستخدام 5،5&#39;-dithiobis- (حمض 2-nitrobenzoic) (DTNB) كمؤشر لتحديد تأثير DZNep على SAH هيدرولاز تثبيط في الذكور البالغين وإناث البعوض. في حين تم تطوير هذا البروتوكول مع بعوضة الملاريا، الأنوفيلة الغامبية، ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة آثار مركبات الفائدة على أي نوع من البعوض أو الحشرات الأخرى. التقنيات بالتفصيل في هذا البروتوكول قد لا يتم تطبيق بكفاءة لدواء مع الذوبان محدود أو معدومة في المياه أو وسائل الإعلام المائي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of the Reagent/Equipment&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:125px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorvall Fresco</td>
			<td>76003758</td>
			<td>A different centrifuge can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colored tape rolls</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S68134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTNB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DZNep.HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMLO305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg dish cups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter papers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-795E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass feeders</td>
			<td>Virginia Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass tissue homogenizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating element</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">NC0520091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Percival scientific</td>
			<td>I36VLC8</td>
			<td>A different incubator can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, &#160;2 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>22-283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.5 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-3154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-8643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo 7easy</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9384</td>
			<td>store at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

مقاومة الحشرات تشكل مشكلة كبيرة لبرامج مكافحة الملاريا. البعوض على التكيف مع مجموعة واسعة من التغيرات في البيئة بسرعة، مما يجعل مكافحة الملاريا مشكلة منتشرة في كل مكان في البلدان الاستوائية. ظهور مقاومة مبيدات الحشرات السكان يبرر استكشاف مسارات جديدة الهدف المخدرات والمركبات لمكافحة ناقلات البعوض. وتنشأ المخدرات جينية جيدا في أبحاث السرطان، ولكن لا يعرف الكثير عن تأثيرها على الحشرات. وتقدم هذه الدراسة بروتوكول بسيط لفحص الآثار السمية ل3-Deazaneplanocin ألف (DZNep)، وهو دواء جينية التجريبية لعلاج السرطان، على نواقل الملاريا، الأنوفيلة الغامبية. ولوحظ وجود زيادة تعتمد على التركيز في معدل الوفيات وانخفاض في حجم البعوض في غير ناضجة تتعرض لDZNep، في حين خفضت مجمع خصوبة البعوض البالغ النسبية للسيطرة على العلاجات. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك انخفاض تعتمد على المخدرات في S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) النشاط هيدرولاز في البعوض بعد التعرض لDZNep قريب للسيطرة على العلاجات. وتوفر هذه البروتوكولات الباحث مع ذلك، خطوة بخطوة إجراء بسيط لتقييم نهايات سمية متعددة للدواء التجريبية و، بدوره، يبرهن على وجود نهج متعدد الشق فريد لاستكشاف الآثار السمية للمخدرات أو مركبات جينية للذوبان في الماء الفائدة ضد البعوض الحامل للمرض والحشرات الأخرى.

الرقم 1 هو تمثيل تخطيطي للفحوصات. فهو يصف الخطوات المختلفة من الإجراء المذكورة في هذه المقالة. كما هو أساس بروتوكول بشأن مراحل الحياة المختلفة من البعوض، وليس هناك تسلسل معين الواجب اتباعها للتجارب بالتفصيل هنا. قد يختار المستخدم لإجراء واحد أو أكثر المقايس...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

فحوصات السمية للاختبار تأثيرات جينية من المخدرات للتنمية، الخصوبة والوراثة من الملاريا البعوض

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Video: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

حقن آن. stephensi الجنين لتوليد الملاريا مقاومة البعوض

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

بروتوكول للعدوى حمى الضنك في البعوض (بعوض ألف) ، وتحديد النمط الظاهري العدوى

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

بروتوكول للعدوى الملاريا المنجلية في تحديد النمط الظاهري البعوض والعدوى

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

منع انتشار الملاريا وحمى الضنك عن طريق البعوض المعدل وراثيا

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

بناء عالم أفضل البعوض : تحديد الجينات تمكين الملاريا وحمى الضنك حمى المقاومة في الغامبية ألف وألف البعوض بعوض

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم C أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

بروتوكولات لاختبار السمية لرواية كيمياء مبيدات الحشرات للبعوض

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...