המחברים מודים מאוד פייר Bourdoncle, תומאס גילבר ולואיז Rimbault של מתקן קוצ&#39;ין ההדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, CNRS וליגת העל לאומי contre le הסרטן (labellisée Equipe).

1. הכנת T לימפוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עכבר ראשוני או תאי T אנושיים כפי שתואר 10,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח תאי T אנושיים במדיום RPMI להשלים עם 10% בסרום אנושי AB בצפיפות של 2 - 3 x 10 6 תאים / מיליליטר. הערה: השימוש בסרום עוברי עגל (FCS) במקום סרום אנושי יכול לעורר קיטוב ספונטני של חלק גדול של תאי T אנושיים בתרבות. שמור את התאים הללו בתרבות ל4-5 ימים ועוד תהליך אותם בכל עת במהלך תקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי T העכבר במדיום RPMI מלא בתוספת 10% FCS בצפיפות תאים דומה. להשתמש מייד או ביום שלמחרת, לאחר O / תרבות N על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 10 ng / ml IL7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח את קו התא האנושי CEM T בRPMI המלא בתוספת 10% FCS. </li></ol> 2. chemokine גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 x 10 5 תאים לכל תנאי ניסוי במדיום HBSS חם בתוספת 10 מ&quot;מ Hepes. עבור חלק מניסויים, שיתוף transfect התאים T אנושי ראשוני היום קודם לכן עם 2 מיקרוגרם pmaxGFP ו8 מיקרוגרם pcDNA3.1 + (וקטור ריק, שליטה), kinase PKCζ המת, או פלסמידים Par6 N-terminal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במדיום HBSS-Hepes חם (0.3 להשתמש מספר x מיליליטר של תנאי ניסוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ את התאים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge. הערה: לכן, צינור אחד המתאים לתנאי ניסוי יחידים יכיל 5 x 10 5 תאים ב0.3 מיליליטר בינוני HBSS-Hepes. עבור חלק מניסויים, להוסיף 500 ננומטר Latrunculin או רכב (DMSO) ודגירת התאים למשך 30 דקות לפני גירוי chemokine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 עד 500 ng / ml CCL19 או chemokine CXCL12 בצינור אחד. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 10-200 מיליליטר chemokine / ng לתאי T אנושיים. תאי CEM אינם מבטאים את הקולטן CCR7 שנקשר CCL19. לכן, תאי CEM רק להיות מסוגלים להגיב לגירוי CXCL12. יתר על כן, שימוש בריכוזים גבוהים יותר chemokine (300-500 ng / ml) לקטב תאי T העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצינורות כמה פעמים דגירה אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 8 או 10 דקות לתאי T ראשוניים או CEM, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תהליך הקיטוב על ידי הוספה על צינור אחד 0.3 מיליליטר של פתרון חם המכיל paraformaldehyde 2% (PFA) ו -10 מ&quot;מ Hepes בPBS. הפוך את צינורות דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li></ol> 3. Stainings <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים מצינורות microcentrifuge לזרום cytometry צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון RT המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ Hepes בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה הצינורות ב 460 XG למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspend התאים של פתרון RT המכיל 5% FCS בPBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של FITC-אנטי-HLA-ABC בצינור אחד, מערבולתם, דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT, הרחק מאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם עם PBS המכיל 5% FCS,פעם אחת עם PBS רק ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב RT: להוסיף 500 μl 1% PFA, דגירה של 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף תאים עם תמיסה המכילה 1% BSA, 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ HEPES בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, למלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון של PBS המכיל BSA 0.2%, saponin 0.1%, 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ Hepes (חיץ permeabilization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים פעמיים במדיום זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצינורות כדי להסיר בינוני ומערבולתם לנתק את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר TRITC-Phalloidin ו / או 1: של נוגדן אנטי-P-100 ERM דילול על צינור אחד, מערבולתם דגירה במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם חיץ permeabilization. דגירה עם נוגדנים משני ניאון במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 200 μl PBS ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge. הערה: תאים מוכנים לרכישה. לחלופין, תוך שמירה על נפח כולל מרבי של 200 μl לכל צינור, להוסיף PFA המרוכז ל% 1 סופייםריכוז על מנת לשמר את stainings אם לא כדי לשמש התאים באותו היום לעיבוד נוסף. </li></ol> 4. תמונות רכישה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשיר (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) ולתת לו לכייל את עצמו בהתאם להוראות היצרן. הערה: תוכנת INSPIRE שימשה עם מטרת 40X (0.75 NA). תוכנת 3.0 הרעיונות שימשה לכל quantifications דיווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרה של חלונות רכישתו ניתן לשמור בתבנית לניסויים עתידיים. לצייר היסטוגרמות שלכמת את ערכי שיפוע RMS. מאוכלוסיית &quot;בפוקוס&quot;, שנבחרה על RMS היסטוגרמה שיפוע, delimitate האוכלוסייה &quot;תא יחיד&quot; על היסטוגרמה של האזור. ברגע שצינור microcentrifuge הוכנס במכונה, להתאים את כוח הלייזר, שער על תאים בודדים ולרכוש 5,000 T לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברעיונות רכיםכלי, לפתוח את קובץ הרכישה וליצור היסטוגרמה שתציג את הערך של ערך RMS שיפוע לתמונות בשדה בהיר (ערוץ 1) התקבלה לכל תא בודד. צייר שער על ההיסטוגרמה שיפוע RMS שרואה תאים מציגים RMS ערך שיפוע מעל 57. הערה: צבע RMS מאפשר לקחת בחשבון בניתוח רק לימפוציטים מסוג T הנמצאים במישור המוקד. יש לנו לקבוע באופן אמפירי שתאים בודדים המציגים ערך שיפוע RMS עדיף על 57 הם במישור המוקד, ויכולים להיחשב באופן מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח / תפריט מסכות, ליצור מסכה חדשה, שנקרא Erode (M01,2) ממסכת המורפולוגיה על תמונות brightfield M01, נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה של האזור, המחושב על מסכת Erode (M01,2). מהתאים שנבחרו בשער הקודם, לפתוח ההיסטוגרמה מראה את השטח של תאים באמצעות מסכה חדשה שנוצרה זה. מסכות המורפולוגיה זמינות על ידי: הערהברירת מחדל הוא הרבה יותר גדולה מהגודל האמיתי של התא. לכן, זה יותר מדויק לשחוק אותו עד 2 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר שער על תאי T הבודדים, לא כולל את חרוזי הכיול ופסולת (פינת קטנה) והכפילויות (שטח גדול). התאם את השער הזה בכל רכישה. הערה: וריאציות בגודל תא תשפיע על מעמדו של השער. ככל שתאי T העכבר קטנים יותר תאי T אנושיים שהם עצמם קטנים יותר מאשר תאי CEM, השטח של כל אחד מסוגי תאים יהיה יחסית לגודלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתחשב בתאים בודדים, בפוקוס שהיו סגור בשלבים הקודמים, לפתוח עלילת נקודה בהיקף של Raw מקס Pixel על הכתמת HLA-ABC (ערוץ 2, ציר x) כפונקציה של Raw מקס Pixel על phalloidin הכתמה (ערוץ 4, ציר y). צור שער שלא לכלול את אירועי ניאון בלא כתם או רוויים. שתי היסטוגרמות פתוחות המציגות את Raw מקס Pixel לHLA-ABC (ערוץ 2) וphalloidin (ערוץ 4) stainings. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח / תפריט מסכות, creatמסכת ea חדשה, הנקראת Erode (M02,2) ממסכת המורפולוגיה של התאים HLA-ABC המוכתם (ערוץ 2), נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה הכוללת את הפרמטר המעגלי, המחושבת על Erode (M02,2). הערה: פרמטר זה מודד את הסטייה של צורת התא ממעגל. לכן, תא T עגול ומושלם יהיה ערך מעגלי גבוה ואילו תאים מקוטבים מוארכים יציג מדד מעגלי נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך, ליצור היסטוגרמה אחרת שתדווח על הערכים של התכונה המעגליות מהתאים מגודר בעבר. השתמש היסטוגרמה זו עלילה ישירות ההפצה של פרט, אוכלוסיית תאים בפוקוס על פי השווי של המעגליות לכל תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מסתכלים על צורת ההיסטוגרמה עבור תאים-מגורה עישון, לצייר שער לתאים מקוטבים, החל משעת הערך המעגלי הנמוך ביותר עד לגובה שווי הגבול המעגלי שבו רוב תאי מגורה שאינוהם זממו. תראו את תצוגת הנתונים הסטטיסטיים עבור אחוז התאים מקוטבים בקרב האוכלוסייה הנשלטת (% מגודרים). הערה: יש לנו קבוצת השער הזה לערכי מדד מעגליים להלן 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסתכל על הקיטוב של ההכתמה אקטין בתאים, העלילה היסטוגרמה לערך הדמיון R3 פרט מואר, השוואת צביעת HLA-ABC (ערוץ 2) ומכתים phalloidin (ערוץ 4). הערה: גדולה יותר את הערך של תכונה זו, יותר גבי שני stainings הן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותה האסטרטגיה gating כמו קודם, עלילה שער על תאי מגורה שאינו לצביעה הנפרדת המציגה את אחוז התאים עם כתמים אקטין מקוטבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר יושלם, אחוז התאים מציג הפרדה בחלוקת MHC Class I וstainings phalloidin, אחוז התאים מקוטבים יחד עם הערכים הממוצעים של המדדים מעגליים ודמיון של כל התאים ± SD מוצג בcorrespלוחות סטטיסטיקת onding. </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

באמצעות טכנולוגיה האחרונה של זרימת ההדמיה cytometry, אסטרטגית gating מהירה ואינפורמטיבי לנתח אירועים תאיים ומולקולריים הנגרמים על ידי גירוי chemokine מוצג. מניסוי בודד, ניתן לקבל שני סוגים עיקריים של מידע: השינויים במורפולוגיה של תאים הנגרמים על ידי גירוי chemokine והפצת subcellular של חלבונים שונים בתהליך הקיטוב. מעניין, ראיות היא גם סיפקו לאפשרות לנתח מספר גדול של תאים, המאפשר חוסן סטטיסטי וניתוח רלוונטי של חלק קטן של האוכלוסייה כל התא. כפי שדווח, טכניקה זו יכולה לשמש גם לניתוח אירועים חלוקה מחדש מולקולריים בהקשר של סינפסה החיסונית 12. בנוסף, להגדיר דומה כבר נעשה שימוש בתאי T-מגורה SDF1 אבל אין ניתוח של מידת שיתוף לוקליזציה בין שני סמנים כבר סיפק 13. למרות שכך טכניקה זו יכולה להיות מתאימה לסוגים רבים של תאים, תאים חסיד לא ניתן לנתח באופן ישיר ותאים בתרחיף צריכים להיות קבועים לפני הרכישה. בנוסף למגבלות הפנימיות אלה של המכונה, זה קריטי כדי לשמור על התאים על 37 מעלות צלזיוס, כאשר גירוים. הטמפרטורה היא אכן מפתח להשגת קיטוב תא T הראוי שכן שינויי cytoskeletal, כגון פילמור אקטין שמניע שינויי צורה, הם מאוד תלויים בטמפרטורה. הניסויים שלנו עם latrunculin תאים שטופלו לאשר כי שיפוץ אקטין נאות הנגרם על ידי גירוי chemokine הוא אכן חיוני לתא על מנת להשיג המדינה המקוטבת באופן מלא שלה. בנוסף לנתונים המסופקים כאן עם התרופה הזו, אנחנו גם בדקנו את טכנולוגית cytometry זרימת הדמיה עם לימפוציטים מסוג T אנושי העיקרי transfected עם חלבוני מוטציה המעכבים את מסלול איתות Par6 / PKCζ. באופן עקבי עם התוצאות שפורסמו בעבר שלנו 7, שהוא מופיע כאן כי f המורכבת קוטביות זוavors קיטוב תא T. על גירוי chemokine, תאי T לאבד מורפולוגיה העגולה לאמץ צורה מקוטבת. מצאנו את הפרמטר המעגלי להיות מדויק ביותר לכמת שינויים מורפולוגיים אלה. עם זאת, פרמטרים אחרים המתארים שינויי צורה מוצעים על-ידי תוכנת הניתוח, כגון יחס הגובה-רוחב או Elongatedness. לכן, אפשר בקלות לבדוק את תרומתו של מסלול איתות מסוים או חלבון מסוים בתהליך זה. במחקר זה, יש לנו תמיד ציין כי אחוז התאים מציגים קיטוב מורפולוגיים גבוה מהאחד לקיטוב מולקולרי. זה מצביע על כך שחלק יחסי של תאים לאמץ שינוי במורפולוגיה אינו מציגה הפצות חוזרות מולקולריות גדולות של הסמנים למד. זה יכול לנבוע מכך שחלק מהתאים מאבדים את הצורה העגולה שלהם, כך הם מפגינים מדד מעגלי נמוך אם כי הם לא מראים בבירור leadinקצה g וuropod. תאי T מקוטבים חלקית אלה עדיין יכולים ליפול בשער של תאי T מורפולוגית מקוטבים ללא הצגת הפצות חוזרות מולקולריות ברורות של סמנים אופייניים. יתר על כן, הבדלים בסף איתות chemokine שיכולים להיות גבוהים יותר עבור סמנים חלוקים מחדש מאשר לשינויי צורה גם יכול להסביר את ההבדלים האלה. כמו כן מוצג כאן שסמן HLA-ABC לא relocalized בתאי T מקוטבים ואין כל שינוי בעוצמת צביעה זו על גירוי CCL19. לעומת זאת, אישור הניתן כאן כי עליית צביעת F- אקטין על טיפול CCL19 (איורים 1 ו -2) כידוע כבר, מאז גירוי chemokine מפעיל פילמור אקטין 5. יתר על כן, הוא הראה כי סיבי אקטין לקבל relocalized בחלק הקדמי של תאים מקוטבים. כתוצאה מכך, מדד דמיון פרט מואר המודד את מידת שיתוף הלוקליזציה בין שני markers נוטה לרדת על גירוי CCL19. לשם השוואה, ניתוח כזה מסופק כאן לקבלת תואר F- אקטין שיתוף לוקליזציה עם חלבוני phospho-ERM כי לקבל נכלל בחזית התא. אחוז תאי T-מגורה chemokine מציגים F- אקטין - MHC Class I הפרדה הוא נמוך בהרבה מהאחד לF- אקטין - phospho-ERM (לעומת 14% -48%, בהתאמה) מאז relocalizes F- אקטין בחזית ו חלבוני phospho-ERM בחלקו האחורי של תאי T מקוטבים, ואילו לחלק מחדש של מולקולות MHC Class I אינו מושפע מגירוי chemokine. מדד דמיון פרט מואר זה יכול לשמש באופן שיטתי ובכך להשוות את החלוקה של שני סמנים בתאי T מקוטבים. לכן, טכניקה זו היא מתאימה מאוד לכמת את מידת שיתוף הלוקליזציה או עמיתים להרחקה של שני סמנים שונים על מספר גדול של תאים או, באופן פוטנציאלי, באירועים נדירים קיימים באוכלוסיית תא רחבה.

כמוקינים הם חלבונים מסיסים קטנים שמושכים תאים למקומות מיוחדים 1. לכן, הם משתתפים במיקום הנכון של תאים ברקמות, תפקיד מכריע בפיתוח ופיזיולוגיה. המערכת החיסונית היא לא יוצאת מכלל זה כפי שהוא מסתמך על הפעולה של סוגי תאים שונים הפועלים בתיאום לעלות תגובה חיסונית יעילה. על ידי שליטה על המיקום הספציפי של סוג תא חיסון אחד במצב נתון, כמוקינים הם-נדרש מראש לפני שניתן להבחין אנטיגנים זרים ונטרלו. בלימפוציטים מסוג T בפרט, כמוקינים להיקשר לקולטנים ספציפיים משטח ש, על אירוסין, לעורר רבים אותות תאיים (עליית סידן, זירחון ERK, הפעלת GTPases Rho, עלייה בשינויי זיקת integrins וcytoskeletal) שמעדיפים תנועתיות תאי T 2,3. ברמה התאית, ניתן לראות שינויים מורפולוגיים שהושרו על גירוי chemokine.שינויים אלה בצורות תא הם דרמטיים במיוחד בתאי T: יש לי תאי T נחים מורפולוגיה עגולה כמו חרוז-בעת נסיעה בזרם הדם. עם זאת, החישה של הנוכחות של כמוקינים באתרים דלקתיים או בקרבתו של איברי הלימפה הולכת לשנות את הצורה של תאי T אשר כעת לאמץ מורפולוגיה טיפוסית &quot;יד-ראי&quot; בהיקף של צורה דו-קוטבית: קצה מוביל בחזית ונגרר לקצה, או uropod, בחלק האחורי 4. בנוסף, רכיבים תאיים יכולים להפריד לשני אזורים מנוגדים אלו של תאי T מקוטבים כדי לקיים הגירה. לדוגמא, עליית פילמור הסיבי אקטין על גירוי chemokine 5 ויקטין polymerized מצטברת בחלק הקדמי של תא T מקוטב 2. מצד השני, כמה חלבונים, כגון חלבוני phosphorylated של משפחת Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) המקשרת את קרום הפלזמה לשלד תא F- אקטין קליפת המוח, מחדש בתרגום בuropod של מקוטבתאי T 6. מעניין, אנחנו ואחרים הראינו שנדרש תהליך קיטוב זה לנדידת תאי T. ואכן, כל טיפול שמפריע לקיטוב ימנע תנועתיות סלולרית. לדוגמא, עיכוב של הפעילות של החברים של החלבון טיפוסי קינאז C (PKC) משפחה, קיטוב תא לוקי PKCζ וPKCι T ותהליך סריקת הנדידה שלהם של תאים דנדריטים 7. קיטוב תא T גם מוסדר על ידי Rho GTPases. הראינו כי האפנון של פעילות RhoA על ידי חלבון Fam65b תאר לאחרונה מפריע T שינויי תא במורפולוגיה והיכולת שלהם להעביר בassay Transwell 6. כקיטוב הוא צעד תנאי מוקדם לתנועתיות סלולרית, זה קריטי ובכך להיות מסוגל לכמת את זה כקריאה העיקרית של תגובות chemokine. שינויי צורת תא נמדדו בעבר באופן ידני 8. עם זאת, בכימות סוג זה הוא זמן רב מאוד, כך שבדרך כלל רק כמהעשרות תאים נלקחים בחשבון. כאן, שיטה חדשה מוצגת לכמת את מידת שינויי צורה של לימפוציטים מסוג T נחשף לchemokine גירוי במהירות. זרימת הדמיה cytometry הטכנולוגיה (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) משמש, המשלב את היתרונות של cytometer זרימה ומיקרוסקופ 9 לכמת ביעילות את כמות תאים מקוטבים בתנאים שונים של גירוי chemokine. בנוסף לכימות של השינויים מורפולוגיים שאפשר למדוד וחסונה עם הטכנולוגיה הזו, אפשר גם להעריך שינויים בלוקליזציה subcellular של חלבונים מסוימים על איתות chemokine.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;x&lt;/sup&gt; Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

תאים מגיבים לגירוי chemokine ידי לאבד הצורה העגולה שלהם בתהליך הנקרא קיטוב, ועל ידי שינוי לוקליזציה subcellular של חלבונים רבים. טכניקות הדמיה קלאסית שימשו לחקר תופעות אלה. עם זאת, הם נדרשים הרכישה הידנית של תאים רבים ואחריו כימות של המורפולוגיה ושיתוף הלוקליזציה של ההכתמה של עשרות תאים זמן רב. כאן, שיטה מהירה וחזקה מתוארת ללמוד תופעות אלה על דגימות מורכבות מכמה אלפי תאים באמצעות זרימת הדמיה cytometry טכנולוגיה המשלבת את היתרונות של מיקרוסקופ עם אלה של cytometer. באמצעות לימפוציטים מסוג T מגורה עם CCL19 וצביעה למולקולות MHC Class I ויקטין פילמנטיות, אסטרטגית gating מוצגת למדוד בו זמנית מידת שינויי צורה והמידה של שיתוף לוקליזציה של סמנים שמושפעים מאיתות CCL19. יתר על כן, אסטרטגית gating זה אפשרה לנו observדואר ההפרדה אקטין פילמנטיות (בחזית) וEzrin-Radixin-Moesin פוספורילציה (phospho-ERM) החלבונים (בחלק האחורי) בתאי T מקוטבים לאחר גירוי CXCL12. טכניקה זו הייתה שימושית גם כדי לבחון את השפעת החסימה על קיטוב של שני אלמנטים שונים: עיכוב של פילמור אקטין ידי מעכב וביטוי תרופתי של מוטציות של / מסלול PKC איתות לא טיפוסי Par6. לפיכך, ראיות הראו כי טכניקה זו שימושית כדי לנתח את שני שינויים מורפולוגיים והפצה מחדש חלבון.

הדוגמא הראשונה שנבחרה כאן נוגעת לשימוש בלימפוציטים מסוג T האנושי העיקרי מגורה עם CCL19. עם זאת, באותה האסטרטגיה ניתן להשתמש בתאי עכבר העיקרי T, שורות תאי T או כל סוג תא אחר מגיב לגירוי chemokine. אסטרטגית gating מוצגת כאן כוללת סדרה של חלונות שבחר את האירועים ממוקדים, אז תאים בודדים. לבסוף הטווח של עוצמת הקרינה ואחריו כאן כדוגמא על שני סמנים: MHC Class I HLA-ABC ויקטינו פילמנטיות למנוחה (איור 1) או מגורה CCL19 (איור 2) לימפוציטים מסוג T. ראשון, המדד המעגלי נמדד במטופל (איור 1) או מגורה CCL19 (איור 2) לימפוציטים מסוג T. העובדה שיש לי תאי מנוחה שיא יחיד גדול עם ערך מדד מעגלי גבוה מצביעה על כך שרוב התאים קרובים לסיבוב. עם זאת, ברור כי גירוי CCL19 מעורר את המראה oתת-אוכלוסיית fa השנייה של תאים עם מדד מעגלי נמוך. תת-אוכלוסייה זו כוללת תאים שאימצו מורפולוגיה מקוטבת. כמו כן, כאשר מייצגים את פרט מואר מדד הדמיון בין HLA-ABC וצביעת F- אקטין, ניתן לראות כי חלק מהתאים להציג ירידה בערכו של מדד זה על טיפול CCL19, צוין כי שני הסמנים להראות דרגה נמוכה יותר של שיתוף לוקליזציה . מעניין, מהנקודה-החלקות שהוצגו בעבר, ניתן למקם בסמן על כל נקודה מסוימת כדי לקבל תמונה של התא המורכב מתמונת brightfield ותמונה לכל אחד מstainings ביצע. איור 3 ובכך מציג דוגמאות של CCL19 מגורה T לימפוציטים שנופלים בשער של מקוטב שאינו (איור 3 א) או תאים מקוטבים (איור 3). אחד יכול לדמיין בבירור את ההבדלים במורפולוגיה בין שני האוכלוסיות. מטבלאות הנתונים הסטטיסטיים מתחת להיסטוגרמות המעגלי מאיורים 1 </strong&gt; ו 2, אחד יכול לתכנן את אחוז התאים שנופלים בשער המקוטב בהעדר או הנוכחות של CCL19 (איור 3 ג). כצפוי, זה ברור שגירוי chemokine מגדיל את אחוז תאי T המקוטב (11.2% ל50.6%). אפשר גם לתכנן את המדד המעגלי הממוצע של האוכלוסייה כל התא שהושגה בשני התנאים (איור 3D). גירוי CCL19 מעורר ירידה במדד זה. עם זאת, כפי שרק חצי מהתאים מקוטבים, השינוי במדד המעגלי הממוצע שנצפה על גירוי CCL19 הוא קטן. באופן דומה, איור 4 מייצג דוגמאות של תאי מגורה CCL19, שבי stainings שני HLA-ABC ו- F- אקטין לעשות (איור 4 א) או לא colocalize (איור 4). מטבלאות הנתונים הסטטיסטיים מתחת להיסטוגרמות דמיון פרט מוארת מוצגים איורים 1 ו -2, ניתן לקבל הפרופורציהשל תאים שמציגים ערך מדד מתחת 1.5, המייצג את התאים שמפגינים מידה נמוכה מאוד של שיתוף לוקליזציה בין HLA-ABC ו- F-אקטין. איור 4C מראה כי החלק היחסי של תאים שנופל בעליות השער הזה על גירוי CCL19 ( מ -3.4% ל -13.9%). איסוף ערכי המדד עבור כל תא בודד, אפשר גם לתכנן את מדד הדמיון הממוצע פרט מואר של האוכלוסייה כל התא שהושגה בשני התנאים (איור 4D). CCL19 מעורר ירידה במדד, לעומת זאת, מאותן סיבות כמו בעבר, שינויים קטנים. על ידי הסתכלות על התמונות של התאים המתאימים, נראה כי ירידה זו בHLA-ABC - F-אקטין שיתוף לוקליזציה היא בעיקר בשל האשכולות של F-אקטין בקוטב אחד של התא. לעומת זאת, חלוקת subcellular של מולקולות HLA-ABC MHC Class I לא נראית להיות מושפעת באופן בוטה על ידי גירוי CCL19. זו הסיבה מדוע החלטנו הבא כדי לבדוק נוסףהמתודולוגיה על ידי ניתוח שני סמנים (F- אקטין וphospho-ERM) ידועים להפריד בהתנגדות קטבים של תאי T-מגורה chemokine. תאי T האנושי מגורה עם CXCL12 מקוטבים מאוד, כלכמת באיור 5 א &#39;עם אותה אסטרטגית gating מאשר לפני (מ5.95% לתאים מקוטבים 79.10% לאחר 8 דקות של גירוי עם 50 ng / mL CXCL12). בתנאים אלה, יש ירידה חזקה במדד דמיון פרט מואר הממוצע כפי שמוצג באיורי 5 ו5D, כלומר F- אקטין וphospho-ERM colocalize פחות לאחר גירוי CXCL12. כצפוי, אחוז התאים מציגים הפרדה של הסמנים שנבחרו כאן הוא גבוה יותר (48%, איור 5 ג), בהשוואה לאלה שלמדו בעבר (14%, איור 4C). בהתאם לכך, הירידה במדד הדמיון הממוצע של כל מצב היא גם יותר ברורה (איור 5D). לכן, טכניקת cytometry זרימת הדמיה שהוצגה כאן הוא suitable לכמת את מידת שיתוף הלוקליזציה של שני stainings במסגרות שונות. לבסוף, החלטנו להמחיש עד כמה ההפרעות של כמה אלמנט cytoskeletal או מסלול איתות הידוע להשפיע שינויים במורפולוגיה של תאי T על גירוי chemokine, ניתן היה למדוד על ידי ההדמיה cytometry זרימה. תאי הבקרה T הושוו ראשון עם כמה קודם לכן בתרופה משבש אקטין latrunculin (איור 6 א). תאים היו מגורה עם CXCL12, מוכתמים בphalloidin הניאון ונותח על ידי ההדמיה cytometry זרימה. היסטוגרמות מראה את עוצמת הגלם מקס Pixel של הכתמת F- אקטין מוצגת עבור שני אוכלוסיות התאים (איור 6 א, למעלה). כצפוי מפעילות ניתוק latrunculin כלפי סיבי אקטין, את עוצמת מכתים phalloidin נמוכה בתאים אלה (פנל מימין) לעומת שליטת לימפוציטים מסוג T שטופל ברכב DMSO (פנל משמאל). יתר על כן, latrunculin-TRתאי T eated תערוכת מדד מעגלי גדול מצביע על כך שהם נשארים עגולים יותר תאי ביקורת (איור 6 א, למטה). זה ניתן לכמת בשער שנקבע בהיסטוגרמות כדי למדוד את אחוז התאים כי תערוכת שינויים מורפולוגיים. למרות 32% מתאי שליטה לקבל מקוטבים במצב זה, רק 10% מlatrunculin T -treated ימפוציטים תערוכה כל שינויי צורה (איור 6). לכן, הוא מוצג כאן, כי תזרים ההדמיה cytometry הטכנולוגיה מתאים כדי למדוד הבדלים בשינויים מורפולוגיים כאשר אחד לומד את ההשפעה הפוטנציאלית של כמה אלמנטי cytoskeletal בתופעה זו. שנית, רכישת מספר גדול של תאים בשיטה זו גם פותחת את האפשרות לנתח במהירות תת קטן של תאים הנוכחיים כמיעוט. באיור 7, דוגמא מוצגת בי הניתוח שלנו הוא מוגבל באופן ספציפי להתנהגותם של תאי T שיתוף transfected עם GFP יחד עם פלסמידים קידוד למוטציות שליליות דומיננטיות של מתחם קוטביות Par6 / PKCζ. היסטוגרמה המתאימה לתאים-transfected לא אפשרה לנו השער באופן ספציפי על GFP הרלוונטי + תאי T (איור 7 א, משמאל). העצמה של ה- GFP נמדדת כהיסטוגרמות שלכמת את ההפצה של עוצמת הקרינה של הערוץ 2 אכן מראה כי רק חלק קטן של האוכלוסייה כל התא כבר transfected (איור 7 א). מידת הקיטוב מורפולוגי של תאי transfected אלה הייתה אז לכמת על ידי המדידה רק מדד המעגליות של GFP התאים + (איור 7). שער נוסף לתאי T המציגים ערכים נמוכים של המעגליות אפשר הערכה של אחוז התאים מקוטבים בכל מצב (איור 7 ג). התוצאות מראות כי הפרעה של הפונקציה של מסלול Par6 / PKCζ האיתות בלמה polarizati תא Tעל הנגרם על ידי שני כמוקינים CCL19 וCXCL12, בקנה אחד עם הממצאים הקודמים שלנו 7. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52140/52140fig1.jpg" width="650" /> איור 1. תוצאות מכתים מגורה שאינו נציג בתאי T האנושי ראשוניים. הפנל העליון השמאלי מציג את לחלק מחדש היסטוגרמה של צבע RMS מחושב עם מסכת M01 על תמונות שדה בהירות (ערוץ 1). הפנל הימני העליון מציג את האזור של מסכת M01 נשחקה של 2 פיקסלים, המבוססת על תמונות brightfield (ערוץ 1) של התאים בפוקוס מגודר מהעלילה הקודמת. לוחות האמצע להראות ערכי הגלם מקס Pixel של שני stainings HLA-ABC וPhalloidin (ערוצי 2 ו -4, בהתאמה) או כ( פנל משמאל) עלילת נקודה או כהיסטוגרמות (באמצע ולוחות מימין) עבור הפרט, ב- להתמקד תאים שנבחרו בשלב הקודם. מאוכלוסייה זו של תאים בודדים, בפוקוס עם כתמים נכונים,<html> מחושב התכונה המעגליות על מסכת M02 נשחקה של 2 פיקסלים של הכתמת HLA-ABC (פנל שמאלי תחתון) ותכונת הדמיון R3 פרט מואר (פנל ימני תחתון) מראה את מידת הדמיון בין HLA-ABC וstainings Phalloidin . לשתי חלקות אלה האחרונים, סטטיסטיקה מצביעה על לחלק מחדש של האוכלוסייה (% מגודרות, אומרת של התכונה, SD) מצוינים בטבלה שלהלן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52140/52140fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52140/52140fig2.jpg" width="650" /> איור 2:. תוצאות מכתים נציג בתאי T האנושי ראשוני מגורה עם 200 מיליליטר CCL19 / ng במשך 8 דקות אסטרטגית פריסת הלוח וgating זהה לאיור 1.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52140/52140fig3highres.jpg" /> איור 3: כימות המעמד המורפולוגי של לימפוציטים מסוג T מגורה על ידי CCL19. (A, B) דוגמאות של תאים מהאיור 2 בחוץ או בשער &quot;המקוטב&quot;, בהתאמה (C) היסטוגרמה המציגה את אחוז תאי T המקוטב המתקבלים בהעדר CCL19. (איור 1, -) או עם 200 ng / מיליליטר CCL19 (איור 2, +) היסטוגרמה (D) המייצגת את הערכים הממוצעים של המדד המעגלי ± SE באדם, אוכלוסיית תאים בפוקוס בהעדר. (-) או הנוכחות (+) של CCL19. *** P &lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52140/52140fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a><html><img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52140/52140fig4highres.jpg" /> איור 4. כימות מידת שיתוף הלוקליזציה בין HLA-ABC וstainings phalloidin. (A, B) דוגמאות של תאים מהאיור 2 בחוץ או בשער &quot;לא colocalized&quot; מהפרט מואר היסטוגרמה דמיון, בהתאמה. (ג) היסטוגרמה המציגה את אחוז תאי T שאינה מראים שום שיתוף לוקליזציה בין שני הסמנים בבלתי מגורה (-). או (+) תנאי מגורה CCL19 היסטוגרמה (D) המייצגת את הערכים הממוצעים של מדד דמיון ± SE באדם, אוכלוסיית תאים בפוקוס בהעדר (-) או הנוכחות (+) של CCL19. *** P &lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52140/52140fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> p-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52140/52140fig5highres.jpg" /> איור 5. ניתוח של F-אקטין - הדרת phospho-ERM על גירוי CXCL12 של תאי T עיקריים אנושיים. אחוז () של תאי T מקוטבים בהעדר או הנוכחות של CXCL12 (10 או 50 ng / mL). (ב) זרימת הדמיה cytometry היסטוגרמות מראה לחלק מחדש של הפרט, אוכלוסיית תאים בפוקוס על פי מדד דמיון פרט מואר כימות שמשווה את היקף שיתוף הלוקליזציה בין stainings phospho-ERM וphalloidin, בהעדר CXCL12 או עם 10 ng / ml או 50 ng / ml CXCL12. (C) של חלקם של תאים שאינה מראים שום שיתוף לוקליזציה של פרם וstainings phalloidin בתאי T מגורה או לא עם CXCL12. כימות (D) של הערכים הממוצעים של מדד דמיון ± SE בכל מצב. *** P &lt;0.001.להעלות / 52,140 52140fig5large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52140/52140fig6highres.jpg" /> אפקט איור 6. של פילמור אקטין על קיטוב תא T. () F-אקטין עוצמת מכתים (לוחות העליונים) ומעגלי (לוחות נמוכים יותר) של תאי T אנושיים הראשוניים שטופלו בLatrunculin (500 ננומטר, 30 דקות) או DMSO ולאחר מכן מגורה עם 100 ng / ml CXCL12 במשך 8 דקות. ( B) היסטוגרמה המציגה את אחוז תאי T המקוטב שטופלו בDMSO או Latrunculin לאחר 8 דקות של גירוי עם CXCL12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52140/52140fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52140/52140fig7.jpg" width="650" /> איור 7. ביטוי של המוטציה kinase-מת PKCζ או המוטציה N-terminal של בלוקים Par6 קיטוב תא T לאחר טיפול CCL19 או CXCL12. (א) זרימת הדמיה cytometry היסטוגרמות מראה את עוצמת הביטוי של ה- GFP, בתאי T העיקרי-transfected הלא או תאי T העיקרי שיתוף transfected עם GFP ווקטור ריק (בקרה) או המוטציה kinase-המת של PKCζ או N-terminal חלק מPar6 (B) זרימת הדמיה cytometry היסטוגרמות המייצגת את מדד המעגליות של אוכלוסיית תאי GFP החיובי מבטא את המבנים השונים ברמה הבסיסית (NS: לא גירוי). או לאחר CCL19 או גירוי CXCL12 (100 / מיליליטר ng במשך 8 דקות ). (ג) כימות של אחוז תאי מורפולוגית המקוטב T מבטאים את המבנים השונים ברמה הבסיסית או לאחר גירוי CCL19 או CXCL12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52140/52140fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר Ver</a>שיאון של נתון זה.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

ניתוח מהיר וחזק של תאי ומולקולרי קיטוב המושרה על ידי chemokine איתות

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Universidad Científica del Sur

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

8.1K Views.  Institut Cochin. Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Video: Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biochemistry

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Neuroscience

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Developmental Biology

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Bioengineering

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Biology

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...