הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את הפונקציה של כימוקין ואת ההתנהגות של מקרופאג ' ב vivo. רוב המודלים הניסיוניים הקיימים של chemotaxis התא מבוססים על ניסויים בתאי במבחנה. אבל ניסויים במבחנה לפעמים הם פשוטים מדי כדי מודל הסביבה המורכבת ב vivo.
כמו כן, הם לא יכולים לייצג את יכולת הכימותרפיה ב vivo. שיטות אלה מנצלות את היתרון הספציפי של דגי זברה לתצפית ישירה על התנהגות התא, דבר שקשה לעכברים. התחל על ידי יצירת TGFABP-10A אינטרלוקין-34 מבנים מהופנטים.
להזריק את FABP-10A interleukin-34 מבנים לתוך תא אחד שלב Tg(mpeg1:GFP)מהופנט עוברי דגים מסוג בר יחד עם MRNA טרנספוסאז. להעלות ולאסוף את העוברים על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן, לתקן אותם עם 4% paraformaldehyde לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר הקיבעון, לשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לייבש את העוברים בנפרד עם 50% מתנול ב PBST, ואחריו 100% מתנול, ואז לשנות טרי 100% מתנול, ולאחסן אותם שלילי 20 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות. כאשר מוכן להכלאה בדיקה, rehydrate העוברים בנפרד ב 50% מתנול ב PBST.
לאחר מכן, לשטוף אותם עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לעכל את העוברים עם proteinase K ב PBST בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השלך את פתרון העיכול, וחזור על קיבעון עם 4%paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הקיבעון, לשטוף את העוברים פעמיים עם PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף. בצע prehybridization עם חיץ הכלאה מחומם ב 65 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת. לאחר מכן, מחממים את הבדיקה אינטרלוקין-34 ל 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
למחזר את חיץ ההכלאה לתוך הצינור המקורי ולבצע הכלאה עם בדיקה שחומם מראש ב 65 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את העוברים עם 50% formamide ו 2X SSCT ואחריו 2X SSCT ולאחר מכן 0.2X SSCT ב 65 מעלות צלזיוס. חוזרים על כל שטיפה שלוש פעמים עם 20 דקות לכביסה.
לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף. חסום את הדגימות עם 600 מיליליטר של חיץ חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של פתרון נוגדנים נגד digoxigenin HRP ולהדגיר את העוברים בארבע מעלות צלזיוס לילה.
למחרת, להסיר את הנוגדן ולשטוף את העוברים שש פעמים עם PBST במשך 20 דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לשטוף כל מדגם עם 30 microliters של 1X בתוספת דילואנט הגברה במשך חמש דקות. הדגירה את הדגימות בפתרון טיראמין פלואורופור במשך חמש עד 15 דקות בחושך.
הארכת זמן הדגירה ל-30 דקות אם האותות חלשים. לאחר מכן, לשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 10 דקות לכל לשטוף. ותדיגר אותם עם הנוגדן העיקרי ב-4 מעלות צלזיוס בן לילה.
ביום שלמחר, לשטוף את העוברים חמש פעמים עם PBST במשך 30 דקות לכל לשטוף, ולהדקר אותם עם הנוגדנים המשניים בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף, ולאחסן אותם 70% גליצרול בחושך בארבע מעלות צלזיוס או שלילי 20 מעלות צלזיוס במשך זמן רב יותר. לפני ההדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחור את העוברים החיוביים האדומים וה-GFP של DS.
כדי להרים את הדגים, השתמש באמבט מתכת כדי לחמם מיליליטר אחד של 1% התכה נמוכה התעוררה מעל 90 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לקרר אותו לטמפרטורת הגוף ומערבבים 50 microliters של 0.2% tricaine. מעבירים את העוברים הרדמה לצלחת קטנה המותקנת עם מגלשת כיסוי בתחתית.
מוציאים את המים שמסביב ומפילים באיטיות את ההמסה הנמוכה שעל העוברים. בזהירות להגדיר את המיקום של הדג לפני agarose התגבש, שמירה על אזור הכבד קרוב למגלשת הכיסוי. לאחר שהתעוררות התגבשה, בזהירות לכסות אותו עם שכבה אחרת של התעוררות כדי לחזק אותו.
מניחים את המנה על שולחן נושאת המיקרוסקופ הקונפוקל, מכסים את הדגים בתתווית E2 בטרקאין ומתחילים בהדמיה. כדי להפעיל את מיקרוסקופ הקונפוקל, פתח את תוכנת Zen Black 2.3 ולחץ על אתר, לאחר מכן הדגירה, ולאחר מכן הגדר את הטמפרטורה ל -29 מעלות צלזיוס. לחץ על תפריט הרכישה ובחר את מצב הסריקה הנדרש ואת הלייזרים בתפריט ההתקנה החכמה.
לאחר מכן בחר מחסנית Z ומיקום. לחץ על תפריט מעצב ניסיוני ובחר לאפשר ניסוי בלוק רב בבלוק הראשון כדי למצוא את המדגם תחת הגדלה נמוכה. לאחר מכן, עבור להגדלה הגבוהה ותן לאזור שנצפה במרכז שדה הראייה.
הגדר את המיקום ואת מידע מחסנית Z. לאחר מכן, בחרו בעוצמת הלייזר המתאימה, בשכבות הסריקה ומהירות ההדמיה. לאחר הגדרת כל הבלוקים, הגדר את המספר המתאים של לולאות והתחל להקליט.
פרוטוקול זה שימש להזרקת interleukin-34 ספציפי לכבד מעל ביטוי פלסמיד לעוברים דגים מהופנטים, אשר מקרופאגים תויגו עם GFP. פלואורסצנטיות מלאה של הר בהכלאה ו immunostaining situ שימשו כדי לנתח את הביטוי של אינטרלוקין-34 ואת מקרופאגים שכותרתו GFP. מספרי תאי המקרופאג' נותחו כמותית באזור העוברים והזנב הלא מנוגנים והוזרקו.
הדמיה חיה שימשה להתבוננות ישירה מקרופאגים, שכותרתו ירוק, עובר על ידי הכבד של דג שליטה נודד לתוך הכבד של interleukin-34 מעל ביטוי דגים. השלבים החשובים של פרוטוקול זה כוללים את הבחירה של קו מהומר מתאים כדי לתייג את התא של עניין. ורקמות מתאימות להדמיה הביטוי שלך של גן מהומר, כמו גם חלון זמן תצפית מתאים.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הפונקציה של כימוקינים אחרים על ההתנהגות של תאים אחרים, כגון תאי T ונויטרופילים ב vivo.
