This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT &#8211; A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.

<ol>
	<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).</li><li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biology. 14, 124 (2013).</li><li>Farias-Hesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+library+preparation+for+high-throughput+DNA+sequencing+platforms.">Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms.</a> Journal of Biomedicin., &amp; Biotechnology. 2010, (2010).</li><li>Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AG-NGS:+a+powerful+and+user-friendly+computing+application+for+the+semi-automated+preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+open+liquid+handling+platforms.">AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms.</a> BioTechniques. 56, 28-35 (2014).</li><li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data.">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25, 1952-1958 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li></ol>

The authors of this article, at the time of its writing, are employed by Diagenode S.A. and Diagenode, Inc., the manufacturer of the automated system described.

immunoprecipitation הכרומטין ואחריו רצף הוא כעת הליך סטנדרטי. הנה פרוטוקול שבב seq אוטומטי שיכול ליצור פרופילים אפיגנטיים הכרומטין עם כמה כמו 10,000 תאים של חומר מוצא מוצג. אוטומציה של מבחני שבב והכנת הספרייה מאפשרת תקנון הליך שבב הייעול והפחתת שונות ניסיוני. מערכת הטיפול הנוזלית המוצגת כאן מבטלת רב של התהליכים ידניים הקשורים לשבב הפחתת הידיים בזמן לדקות רק 30, ממזערת אובדן מדגם, ומאפשרת שבב seq מדויק עם רק כמה picograms של קלט ספרייה. על מנת להשיג ניסויי שבב seq אוטומטיים מוצלחים, הוא גם חיוני לשימוש הכנות באיכות גבוהה טעון הכרומטין ונוגדני כיתה שבב seq בכל ניסוי המערכת משתמשת בטכנולוגיה מבוססת חרוז מגנטית ומציע גמישות לשנות פרמטרים ניסיוניים כגון דגירה זמן למעייל הנוגדןing וצעדי immunoprecipitation או שינוי של תנאי הכביסה מאפשרים לחוקר לנהל את כל הניסויים הנחוצים לאופטימיזציה שבב seq. המערכת האוטומטית היא פלטפורמה &quot;פתוחה&quot; שמאפשרת גם השוואה של חומרים כימיים מרובים במקביל לאופטימיזציה של תנאי ניסוי עבור כל קו תא בודד ונוגדנים ומאפשרת השוואה ישירה מסוגים שונים וריכוזים של הכרומטין, נוגדנים שונים וסוגים שונים של אפילו מגנטי חרוזים. אחת המגבלות של המערכת האוטומטית הוא הצורך של הפיכה כל הפרוטוקולים בכמויות שנעות בין 5 μl 200 μl. עם זאת, המזעור של הניסויים בפלטפורמה אוטומטי זה גם מאפשר חיסכון בעלויות בחומרים כימיים. בנוסף לפרוטוקולים שתוארו במחקר זה, המערכת ניתנת להתאמה וגם לאוטומטי מגוון רחב של יישומי חרוז מגנטי אחרים המבוססים כגון immunoprecipitationnd לכידתו של DNA מפוגל (טכנולוגיות MeDIP וMethylCap), immunoprecipitation של DNA hydroxylmethylated (hMEDIP), immunoprecipitation רציפה הכרומטין (ReChIP), immunoprecipitation RNA (RNA-IP), המרת bisulfite, ומבחני טיהור DNA.

ככל שטכנולוגיות של הדור הבא הרצף (NGS) הפכו נפוצות ונגישה יותר, השיטה העיקרית למיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA כעת הכרומטין immunoprecipitation אחרי גילוי NGS (שבב seq), המאפשר הגילוי של גורם שעתוק אתרי קישור או דפוסים של שינויי היסטון. שבב seq יש יתרון במתן נתונים תפוקה גבוהה של הגנום כולו שיכול לשמש לניתוח כמותי ואיכותי של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי המדידה של שברי DNA המועשר. עם זאת, יש כמה חסרונות בניסויי שבב seq סטנדרטיים כגון הקושי בהשגת מספיק חומר כדי ליצור ספריית רצף. ניסויי שבב מחולקים לשישה שלבים בסיסיים כוללים אזורים מחייבים 1) החלבון-DNA crosslinking 2 הכנת מדגם) הכוללת תמוגה תא וגז הכרומטין ידי sonication, 3) היווצרות immunocomplexes,4) משקעים של immunocomplexes, 5) שטיפת immunocomplexes, ו -6) elution של חומר המועשר וניתוח על ידי qPCR וNGS. ההצלחה של assay שבב תלויה בשלושה גורמים עיקריים: הכנה טובה הכרומטין, כמות האנטיגן במדגם המקורי, ואת הספציפיות וזיקה של הנוגדן לאנטיגן המקור שלה. מגבלה העיקרית היא הדרישה לכמויות גבוהות של החל מספרים סלולריים על מנת לקבל DNA מספיק מועשר כדי ליצור ספריית רצף. למדענים שעובדים עם כמויות מדגם מוגבלות, כגון דגימות ביופסיה או תת-אוכלוסיות תאים, ניסויי שבב seq מאוד מאתגרים. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי ניתן לבצע מבחני שבב seq כאשר עובדים עם כמות נמוכה של תאי 1, 2. Diagenode פיתח מערכת טיפול נוזל רובוטית שיכולה להפוך באופן מלא ניסויי שבב seq כאשר מתחילים עם מספר מצומצם של תאים. אוטומציה מספקתיתרונות רבים על פני הכנה ידנית של דגימות שבב seq כפי שמפחית טעויות אנוש, מפחיתים שונות, ומצמצם את עלות ניסוי. פרוטוקולים חצי אוטומטי לimmunoprecipitation הכרומטין והכנת ספרייה כבר דיווחו אבל אף אחד ממחקרים אלה הראה נתונים בעת שימוש במספרים נמוכים תא 3, 4, 5, 6. במאמר זה זרימת עבודה אוטומטית מלאה מתוארת בשני מבחני immunoprecipitation והכנת ספריית הכרומטין במערכת טיפול נוזל רובוטית שמשתמשת בטכנולוגיה מבוססת חרוז מגנטי ושיכולים לתת מענה למספר רב של פרמטרים באופטימיזציה הפרוטוקול. כאן, ניסויי שבב seq אוטומטיים בוצעו בהצלחה במספר מצומצם של תאים במטרה לפשט, תקנון, ומתן פתרון אמין ללמוד פרופילים אפיגנטיים באוכלוסיות תאים קטנות. פרוטוקול השבב האוטומטי המתואר במאמר זה כבר מותאם בתאי הלה באמצעות נוגדני היסטון ספציפיים וחומרים כימיים בut זרימת העבודה יכולה להיות מותאם לקווים אחרים תא ונוגדנים עם מקביל ניסיונית אופטימיזציה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:333px;">Product Description</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:367px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Formaldehyde 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">1,25M Glycine Solution</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Shearing Buffer iS1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protease Inhibitors Mix (200x)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer tL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP Buffer tC1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ideal ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagneode</td>
			<td>C01010051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP-Buffer H</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td>Component of the Auto Histone ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto Histone ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto True Micro ChIP kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K79me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15310068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K27me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me2 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K36me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Rabbit IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protein-A coated paramagnetic beads</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto IPure</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroChIP DiaPure columns</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>DMMLD2D100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quant-IT dsDNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroPlex Library Preparation Kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C05010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Library prep Quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">IP-Star Compact&#160; Automated System</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B03000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Qubit system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Hiseq systems</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating chip-seq experiments to generate epigenetic profiles on 10,000 hela cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

אופטימיזציה של ניסויי שבב seq אוטומטיים לשמונה סמני היסטון שונים על מנת לפתח בהצלחה ולאמת את הפרוטוקולים האוטומטיים שבב, נוגדני כיתה שבב seq שאומתו בעבר בניסויי שבב Seq ידניים (מידע לא מוצג) נבחרו. נוגדני הכיתה שבב seq הבאים נבחרו למחקר זה: אנטי-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 ו-H3K9me3. הסגוליות של כל נוגדני הכיתה שבב seq אושר בעבר על ידי כתם נקודה, מערכי פפטיד וניסויים המערביים כתם (מידע לא מוצג). ניסויי פיילוט שבב qPCR עם כמויות נוגדני הגדלת בוצעו כדי לקבוע את הרגישות של הנוגדנים (איור 3). qPCR עם לפחות שתי חיוביים ושני יעדי בקרה שליליים נותחו ופרופילים עם מוספים של חיובי על היעד שלילי גבוהים מפי חמישה מוסמכים לexper רצף<html> iments. חשוב לבצע ניסויי שבב והשבב seq עם איכות גבוהה של הכרומטין טעון. כל ניסויי השבב מוצגים בפרסום זה בוצעו באמצעות הכרומטין הטרי. אפשר גם להקפיא את התאים הקבועים ב -80 ° C ולהמשיך בהכנת הכרומטין וגז ביום אחר. עם זאת, הכרומטין הוכן מהתאים קבועים קפוא עשויים להתנהג באופן שונה מהכרומטין מוכן טרי ולכן תנאי sonication ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים עבור כל הכנת הכרומטין. כאשר עובדים עם סוגי תאים שונים, ניתן להשתמש במאגרי גז בהרכבים שונים של חומרי ניקוי (SDS). סוגי תאים כגון קווים עיקריים תא או תא גדלו בהשעיה הם תאים קשים לגזירה וידרשו מריכוזים גבוהים SDS (1%) ואילו שורות תאים כי הם קלים לגזירה כגון הלה ידרוש ריכוזים נמוכים SDS (0.1%) ב מאגרי גז. res.jpg &quot;/&gt; איור 3. אישור של נוגדני כיתה שבב באמצעות מערכת האוטומציה. השבב בוצע עם אנטי-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, נוגדני polyclonal ארנב -H3K36me3 ו-H3K9me3 על הכרומטין טעון מ 1 מיליון תאי הלה-S3 בהתאם לשינויי היסטון. פרוטוקולי שבב אוטומטיים עם כרכים עובדים 200 μl שמשו במכשיר האוטומציה לניסויי טיטרציה הנוגדן. כמויות נוגדנים של 1, 2, 5 ו -10 מיקרוגרם נבדקו לכל ניסוי שבב ו -2 מיקרוגרם IgG שימש כביקורת שלילית בכל ניסוי. מוספים להוערכו על ידי qPCR. תוצאות מוצגות כ% מקלט (הכמות היחסית של DNA immunoprecipitated לעומת הקלט DNA לאחר ניתוח qPCR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לאחר אימות וקביעת אופטימה<html> כמויות l נוגדני כיתה שבב לשימוש במערכת האוטומציה, ניסויי שבב seq אוטומטיים בוצעו על מנת ליצור פרופילי רצף עבור כל שינוי היסטון (איור 4). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" /> פרופילי שבב seq 4. היסטון איור נוצרו על ידי ניסויי שבב seq אוטומטיים. איור מציג את פרופילי שבב seq באזורים הגנומי שונים עבור H3K4me3, H3K9ac וH3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3, וH3K36me3. 4A מציג את התפלגות השיא לאורך X המלא -chromosome ו4B ההפצה באזור 75 kb המקיף את גן GAPDH. 4C מראה את הפרופילים של H3K27me3, H3K36me3 וH3K4me3 באזור 500 kb המקיף את גן MYT1 ו4D מציג את התפלגות H3K9me3 בZNF12 סביב 200 kb אזור.&quot;Target =&quot; large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. פרופילים אפיגנטיים היסטון לשישה שינויי היסטון שונים הקשורים לביטוי גנים נוצרו (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 וH3K36me3). איור 4 א מציג פרופילי שבב seq לאורך X כרומוזום לסמני היסטון השונים. מתאם השיא מאוד נצפה בין 6 פרופילי היסטון השונים מציין את היכולות של מערכת אוטומטית להפיק נתונים מדויקים ואמינים. איור 4, 4C ו4D להראות ההפצה של פסגות לשינויים היסטון שונים באזורים הגנומי ספציפיים. ניסויי immunoprecipitation הכרומטין אוטומטיים עד 200 תאים הסכום המינימאלי של תאים שיכולים לשמש בניסויי שבב תלוי באיכות של הכרומטין, specificity ורגישות של הנוגדן והשפע של שינוי היסטון או החלבון למד. בחירת נוגדני כיתה שבב seq טובים היא חשובה בעת עבודה עם כמויות מוגבלות של מדגם והבחירה של חומרים כימיים אופטימליים וספקים שונים משפר את היעילות של התאוששות DNA ולתרום להצלחתו של ניסוי השבב. כדי לקבוע את הסכום המינימאלי של תאים שפרוטוקול השבב האוטומטי יכול לעבד, כמויות שונות של הכרומטין, נוגדן, וחרוזים מגנטיים נבדקו במערכת האוטומטית IP-Star באמצעות ריאגנטים שבב מותאמים במיוחד לעבודה עם כמויות נמוכות של הכרומטין. ראשית, הכרומטין מ10,000 תאים היה sonicated כפי שתואר בפרוטוקול. תוצאות השבב אושרו על ידי qPCR (איור 5 א) שמראה העשרה משמעותית עם נוגדן H3K4me3 באזורי שליטה חיוביים ואות זניחה באזורי שליטה שליליים. לשם השוואה והוכחה של עקביות, additionaנתונים l הושגו עם H3K27ac, H3K9me3, ונוגדני H3K27me3, באמצעות 10,000 תאים מסופקים. ניסויי שבב אוטומטיים בוצעו לאחר מכן כדי להדגים את היכולות של המערכת האוטומטית לעבודה עם כמויות נמוכות של תאים תוך שימוש באותו הנוגדן H3K4me3. השבב האוטומטי מבוצע היטב, הפגין על ידי סדרה של עשר תגובות IP שהיו לשחזור ולהשוות מאוד עם תוצאות מדריך לשבב (איור 5). ניסויים ידניים ואוטומטיים בוצעו ויתרונות של הפרוטוקולים האוטומטיים נראו בהפחתת ניסוי לניסוי שונות (איור 5 ג). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" /> איור 5. אופטימיזציה של ניסויי שבב והשבב אוטומטי על 10,000 תאי ניסויי שבב ידניים בוצעו על 10,000 תאים ובאמצעות 0.25 מיקרוגרם של H3K4me3, 0.1 מיקרוגרם של H3K27ac, 0.5 מיקרוגרם של H3K9me3 ו -0.25 מיקרוגרם של נוגדני H3K27me3. כמויות זהות של IgG הארנב שמשו כביקורת. QPCR בוצע עם פריימרים לשני לוקוסים חיוביים ושני לוקוסים שליליים עבור כל assay שבב. איור 5 א &#39;מציג את ההתאוששות, מבוטאת באחוזים של קלט (הכמות היחסית של DNA immunoprecipitated לעומת הקלט DNA לאחר ניתוח qPCR). איור 5 מופעים 10 תגובות שבב לרוץ על IP-הכוכבים קומפקטיים באמצעות 0.25 מיקרוגרם נוגדן polyclonal H3K4me3 ו 0.25 מיקרוגרם של IgG ארנב נוגדני שליטה שליליים. לאחר מכן ניתוח qPCR בוצע עם פריימרים לאמרגן החיובי EIF4A2 הלוקוסים וGAPDH TSS וexon2 מיוגלובין לוקוסים השלילי וSat2. איור מציג את ההתאוששות, כאחוז מהקלט (כמות היחסית של DNA immunoprecipitated לעומת הקלט DNA לאחר ניתוח qPCR). איור 5 ג מציג נתונים H3K4me3 שבב של 10 ניסויי שבב ידניים בהשוואה ל -10 ניסויי שבב אוטומטיים. ברים שגיאה מייצגים s<html> סטיות tandard של כל אחד מעשר חזרות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> על מנת להבין את הרגישות של פרוטוקולי שבב האוטומטיים, ניסויים בוצעו באמצעות כמות התאים שנעו בין 100,000 עד 200 תאים לכל IP. הנוגדן אנטי H3K27me3 שימש כזה הוא שינוי היסטון נפוץ מאוד. השימוש בנוגדני היסטון או אי-היסטון אחרים עשויים לדרוש יותר או פחות תאים, בהתאם לשפע של epitope והאיכות של הנוגדן. הניסויים אומתו על ידי PCR כמותי וזה היה ציין כי על ידי הפחתת כמויות של חרוזים ורקע נוגדנים בניסויים מצטמצם ומאפשרים תוצאות שבב qPCR מוצלחות עם קטן כמו 200 תאי נוגדנים (איור 6). Iles / ftp_upload / 52,150 / 52150fig6highres.jpg &quot;/&gt; איור 6. אוטומטי מבחני שבב על 200 תאים. תאי הלה-S3 ונוגדן מכוון נגד H3K27me3. הכרומטין היה טעון בין 1 מיליון תאים ודילולי סדרתי של הכרומטין זה (100,000 עד 200 שווה ערך תא) שמשו לכל תגובת שבב. 1 מיקרוגרם של H3K27me3 ו -10 μl של מצופה חרוזים מגנטיים חלבון שימש בניסוי 100,000 תאים, 0.5 מיקרוגרם של H3K27me3 ו -10 μl של חרוזים על 10,000 ו1,000 תאים, ו0.25 מיקרוגרם של H3K27me3 ו -5 μl של חרוזים עם 500 ו -200 תאים. 1 מיקרוגרם ו -0.5 מיקרוגרם של IgG של הארנב שמשו כנוגדן שליטה שלילי בעת ביצוע ניסויים עם 100,000 תאים ו1,000 תאי בהתאמה. 6A מציג את התפוסה של גני TSH2B וGAPDH ב% מעל הקלט. 6B תערוכות התפוסה היחסית של TSH2B לעומת שליטת GAPDH שלילית אזור גנומי. ניתוח במורד הזרם של תוצאות שבב seq על10,000 תאים על מנת להעריך את האיכות הגלובלית של ניסויי שבב seq האוטומטי עם מספרי המוצא נמוכים של תאים, אוטומטי מבחני שבב seq בוצעו עם 0.25 מיקרוגרם של נוגדן H3K4me3 על 10,000 תאי הלה וניסויים שבב על 100,000 תאי הלה-S3 שמשו כביקורת חיובית לניסוי. הספריות האוטומטיות הוכנו באמצעות ריאגנטים ערכת הכנת ספריית MicroPlex מותאמים לספריות מוכנות עם כמויות DNA נמוכות. שימו לב שלמרות שניתן לבצע שבב ניסויים אוטומטיים מוצלחים עם פחות מ -10,000 תאים, הכמויות של DNA הוריד לא תהיינה מספיק כדי להכין את הספריות באמצעות ריאגנטים הערכה. דור ורצף אשכול בוצעו על פי הוראות היצרן. ביואינפורמטיקה ניתוחים לאחר התוצאות יוצאות דופן תכנית רצף מדגימות שבב מספר התא הנמוכה. בסיס נתוני 30 pg (המקביל ל -10,000 תאים של חומר מוצא<html> ) מכיל רעשי רקע נמוכים ופסגות העשרה אמינות ביותר אשר אושר על ידי שניהם במערך 300 pg (המקביל ל 100,000 תאים של חומר מוצא) ובסיס נתוני H3K4me3 שנוצרו על ידי המכון ברוד לפרויקט ENCODE ששימש כהתייחסות חיצונית. חשוב לציין את נתוני Top 40 חפיפה היחס, שמתייחס לשיטה סטנדרטית המשמשת בפרויקט ENCODE 11 שבשבב seq נחשב לשחזור אם השוואה בין שני מערכי נתונים יש לפחות 80% חפיפה של 40% הטובים ביותר של הפסגות דורגו על ידי ציון משמעות. בסיס נתוני 30 pg ממלא קריטריונים אלה בהשוואה לשתי בסיס נתוני 300 pg (שוקל את כל הפסגות שלה, ולא רק 40% הטובים ביותר) והנתונים רחבים המכון (טבלת 1). בסיס הנתונים של 300 pg מראה פסגות כמעט זהות לנתונים רחבים מכון עם יחס 98% Top 40 חפיפה (איור 7). ighres.jpg &quot;/&gt; איור 7. מבחני שבב ודור ספרייה על 10,000 תאי ניסויי שבב seq נוצרו על 10,000 ו100,000 תאי הלה-S3 באמצעות נוגדן H3K4me3 (0.25 מיקרוגרם / μl). התגים נ&quot;ב 35 מופו להגנום האנושי עם aligner Eland. בתקופת השיא שלאחר מכן קורא SICER יכול לזהות באופן אמין מוספים ממספרים סלולריים נמוכים, כמו גם ממיליוני תאים. מערכי נתונים נותחו ולעומת אחד עם השני ולנתוני ההתייחסות שנוצרו על ידי המכון ברוד. דגימות התאים נמוכות עולות בקנה אחד ויש לי גבוה מאוד דמיון. מדגם 30 pg ממלא את 11 קריטריונים (קידוד דקות. 80% של 40% העליונים של הפסגות צריכים חפיפה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" /> טבלת 1. </strong&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells at JoVE.com

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

אוטומציה של ניסויי שבב seq כדי ליצור פרופילים אפיגנטיים על 10,000 תאים הלה

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

automating-chip-seq-experiments-to-generate-epigenetic-profiles-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  Diagenode S.A.. Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Video: Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Genetics

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of associated loci. In addition, the presence of specific modifications has been used to determine the position and identity non-coding functional elements such as enhancers. In recent years, chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) has become a powerful tool in determining the genome-wide profiles of individual histone modifications. However, it has become increasingly clear that the combinatorial patterns of chromatin modifications, referred to as Chromatin States, determine the identity and nature of the associated genomic locus. Therefore, workflows consisting of robust high-throughput (HT) methodologies for profiling a number of histone modification marks, as well as computational analyses pipelines capable of handling myriads of ChIP-Seq profiling datasets, are needed for comprehensive determination of epigenomic states in large number of samples. The HT-ChIP-Seq workflow presented here consists of two modules: 1) an experimental protocol for profiling several histone modifications from small amounts of tumor samples and cell lines in a 96-well format; and 2) a computational data analysis pipeline that combines existing tools to compute both individual mark occupancy and combinatorial chromatin state patterns. Together, these two modules facilitate easy processing of hundreds of ChIP-Seq samples in a fast and efficient manner. The workflow presented here is used to derive chromatin state patterns from 6 histone mark profiles in melanoma tumors and cell lines. Overall, we present a comprehensive ChIP-seq workflow that can be applied to dozens of human tumor samples and cancer cell lines to determine epigenomic aberrations in various malignancies.

Here, we describe an optimized high-throughput ChIP-sequencing protocol and computational analyses pipeline for the determination of genome-wide chromatin state patterns from frozen tumor tissues and cell lines.

פלטפורמה משולבת עבור מיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית באמצעות שבב בתפוקה גבוהה-רצף ברקמות הגידול

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Cancer Research

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic marks in a single cell and requiring data from other cells to distinguish signal from experimental background noise in a single cell. This paper describes a method to reuse the same single cell for iterative epigenomic analyses. 
In this experimental method, cellular proteins are first anchored to a polyacrylamide polymer instead of crosslinking them to protein and DNA, alleviating structural bias. This critical step allows repeated experiments with the same single cell. Next, a random primer with a scaffold sequence for proximity ligation is annealed to the genomic DNA, and the genomic sequence is added to the primer by extension using a DNA polymerase. Subsequently, an antibody against an epigenetic marker and control IgG, each labeled with different DNA probes, are bound to the respective targets in the same single cell. 
Proximity ligation is induced between the random primer and the antibody by adding a connector DNA with complementary sequences to the scaffold sequence of the random primer and the antibody-DNA probe. This approach integrates antibody information and nearby genome sequences in a single DNA product of proximity ligation. By enabling repeated experiments with the same single cell, this method allows an increase in data density from a rare cell and statistical analysis using only IgG and antibody data from the same cell. The reusable single cells prepared by this method can be stored for at least a few months and reused later to broaden epigenetic characterization and increase data density. This method provides flexibility to researchers and their projects.

The present protocol describes a single-cell method for iterative epigenomic analyses using a reusable single cell. The reusable single cell allows analyses of multiple epigenetic marks in the same single cell and statistical validation of the results.

תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Bioengineering

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...