This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT &#8211; A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.

<ol>
	<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).</li><li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biology. 14, 124 (2013).</li><li>Farias-Hesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+library+preparation+for+high-throughput+DNA+sequencing+platforms.">Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms.</a> Journal of Biomedicin., &amp; Biotechnology. 2010, (2010).</li><li>Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AG-NGS:+a+powerful+and+user-friendly+computing+application+for+the+semi-automated+preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+open+liquid+handling+platforms.">AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms.</a> BioTechniques. 56, 28-35 (2014).</li><li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data.">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25, 1952-1958 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li></ol>

The authors of this article, at the time of its writing, are employed by Diagenode S.A. and Diagenode, Inc., the manufacturer of the automated system described.

مناعي لونين تليها التسلسل هو الآن إجراء القياسية. هنا يرد على رقاقة وما يليها بروتوكول الآلية التي يمكن أن تولد ملامح جينية لونين مع عدد قليل من 10،000 خلايا بدءا المادية. أتمتة الشذرة وإعداد المقايسات مكتبة يتيح توحيد الإجراء الشذرة الأمثل والحد من التقلبات التجريبية. نظام معالجة السائل المقدمة هنا يلغي العديد من الإجراءات اليدوية المرتبطة الشذرة الحد يد في الوقت المناسب لدقيقة فقط 30، ويقلل من فقدان العينة، وتمكن دقيق رقاقة وما يليها مع عدد قليل من بيكوغرام من المدخلات المكتبة. من أجل تحقيق نجاح التجارب رقاقة وما يليها الآلي، بل هو أيضا حاسما لاستخدام ذات جودة عالية التحضيرات لونين المنفصمة والأجسام المضادة الصف رقاقة وما يليها في كل تجربة نظام يستخدم التكنولوجيا القائمة على حبة المغناطيسي، ويوفر المرونة اللازمة لتغيير المعلمات التجريبية الرئيسية مثل حضانة الوقت للمعطف الأجسام المضادةخطوات مناعي أو تعديل الشروط غسل السماح للباحث لإجراء جميع التجارب اللازمة لرقاقة وما يليها الأمثل جي و. النظام الآلي هو منصة &quot;فتح&quot; التي تسمح أيضا مقارنة الكواشف متعددة في نفس الوقت لتعظيم الاستفادة من الظروف التجريبية لكل خط الخلية الفردية والأجسام المضادة وتمكن المقارنة المباشرة من مختلف الأنواع وتركيزات الكروماتين، والأجسام المضادة المختلفة وأنواع مختلفة من حتى المغناطيسي الخرز. واحد من أوجه القصور في النظام الآلي هو الحاجة للأتمتة كافة البروتوكولات في وحدات التخزين التي تتراوح بين 5 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر. ومع ذلك، فإن التصغير من التجارب في هذا المنبر الآلي يمكن أيضا توفير التكاليف في الكواشف. وبالإضافة إلى البروتوكولات المذكورة في هذه الدراسة، فإن هذا النظام قابل للتكيف وبأتمتة مجموعة متنوعة من التطبيقات الأخرى المستندة حبة المغناطيسية مثل مناعي وأيضاالثانية القبض على الحمض النووي ميثليته (تقنيات MeDIP وMethylCap)، مناعي من الحمض النووي hydroxylmethylated (hMEDIP)، متتابعة مناعي لونين (ReChIP)، مناعي RNA (RNA-IP)، وتحويل بيسلفيت، والمقايسات تنقية DNA.

كما أصبحت الجيل التالي من التسلسل (NGS) التقنيات على نطاق واسع وأيسر منالا، والطريقة الأساسية لرسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات-DNA البروتين لونين الآن مناعي تليها الكشف NGS (رقاقة وما يليها)، والتي تمكن من اكتشاف عامل النسخ مواقع أو أنماط من التعديلات هيستون ملزمة. رقاقة وما يليها هو مفيد في توفير بيانات عالية الإنتاجية من الجينوم بأكمله والتي يمكن استخدامها للتحليل الكمي والنوعي للتفاعلات-DNA البروتين عن طريق قياس شظايا الحمض النووي المخصب. ومع ذلك، هناك بعض العيوب في التجارب رقاقة وما يليها القياسية مثل صعوبة في الحصول على ما يكفي من المواد لإنشاء مكتبة التسلسل. وتنقسم التجارب الشذرة إلى ستة الخطوات الأساسية بما في ذلك المناطق ملزمة 1) يشابك البروتين DNA 2) إعداد العينات التي تضم تحلل الخلايا والقص لونين من قبل صوتنة، 3) تشكيل immunocomplexes،4) هطول الأمطار من immunocomplexes، 5) غسل immunocomplexes، و6) شطف من اليورانيوم المخصب وتحليلها من قبل QPCR وNGS. نجاح مقايسة الشذرة يعتمد على ثلاثة عوامل رئيسية هي: التحضير الجيد لونين، وكمية المستضد في العينة الأصلية، وخصوصية وتقارب من الأجسام المضادة للمستضد لها وما شابه ذلك. وجود قيود الرئيسي هو شرط لكميات عالية من بدء أعداد الخلايا من أجل الحصول على ما يكفي من الحمض النووي المخصب لإنشاء مكتبة التسلسل. للعلماء الذين يعملون مع كميات عينة محدودة، مثل عينات الخزعة أو خلية السكان الفرعية، والتجارب رقاقة وما يليها هي صعبة للغاية. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن المقايسات رقاقة وما يليها يمكن أن يؤديها عند العمل مع كمية قليلة من الخلايا 1 و 2. وقد وضعت Diagenode نظام الروبوتية معالجة السائل الذي يمكن أتمتة تماما التجارب رقاقة وما يليها عند البدء مع عدد محدود من الخلايا. يوفر أتمتةمزايا عديدة أكثر من إعداد دليل للعينات رقاقة وما يليها كما أنه يقلل الأخطاء البشرية، ويقلل من التباين، ويقلل من تكلفة التجريبية. تم الإبلاغ عن بروتوكولات الآلي نصف لمناعي الكروماتين وإعداد مكتبة ولكن أيا من هذه الدراسات أظهرت البيانات عند استخدام أرقام الهواتف المحمولة منخفضة 3، 4، 5، 6. في هذه الورقة يتم وصف سير العمل الآلي الكامل لكل من لونين مناعي وإعداد المقايسات مكتبة في نظام مناولة السائل الروبوتية التي تستخدم التكنولوجيا القائمة على حبة المغناطيسية والتي يمكن أن تعالج معلمات متعددة في تحسين البروتوكول. هنا، وأجريت التجارب رقاقة وما يليها الآلي بنجاح على عدد محدود من الخلايا مع هدف تبسيط وتوحيد، وتوفير حل موثوق بها لدراسة ملامح جينية في السكان الخلية الصغيرة. وقد تم تحسين بروتوكول الشذرة الآلي وصفها في هذه الورقة على خلايا هيلا باستخدام الأجسام المضادة هيستون محددة والكواشف بالتحرير سير العمل يمكن تكييفها لخطوط الخلايا الأخرى، والأجسام المضادة مع المقابلة الأمثل التجريبية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:333px;">Product Description</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:367px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Formaldehyde 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">1,25M Glycine Solution</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Shearing Buffer iS1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protease Inhibitors Mix (200x)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer tL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP Buffer tC1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ideal ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagneode</td>
			<td>C01010051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP-Buffer H</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td>Component of the Auto Histone ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto Histone ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto True Micro ChIP kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K79me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15310068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K27me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me2 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K36me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Rabbit IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protein-A coated paramagnetic beads</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto IPure</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroChIP DiaPure columns</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>DMMLD2D100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quant-IT dsDNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroPlex Library Preparation Kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C05010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Library prep Quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">IP-Star Compact&#160; Automated System</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B03000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Qubit system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Hiseq systems</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating chip-seq experiments to generate epigenetic profiles on 10,000 hela cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

تحسين تجارب رقاقة وما يليها الآلي لمدة ثماني علامات هيستون مختلفة من أجل تطوير بنجاح والتحقق من صحة البروتوكولات الشذرة الآلي، والأجسام المضادة الصف رقاقة وما يليها التي تم التحقق من صحتها من قبل في تجارب اليدوية رقاقة تسلسل (لا تظهر البيانات) وقد تم اختيار. وقد تم اختيار الأجسام المضادة الصف رقاقة وما يليها التالية لهذه الدراسة: مكافحة H3K79me3، -H3K27me3، -H3K4me3، -H3K4me2، -H3K9ac، -H3K9 / 14ac، -H3K36me3 و-H3K9me3. وأكد على خصوصية كل الأجسام المضادة الصف رقاقة وما يليها من قبل لطخة نقطة، صفائف الببتيد والتجارب البقعة الغربية (لا تظهر البيانات). وأجريت التجارب الرائدة الشذرة-QPCR مع زيادة كميات الأجسام المضادة لتحديد حساسية الأجسام المضادة (الشكل 3). QPCR مع اثنين على الأقل إيجابية وهدفين سيطرة سلبية وقد تم تحليل وملامح مع التخصيب الإيجابية على الهدف السلبي أعلى من خمسة أضعاف مؤهلون لتسلسل والخبير<html> iments. من المهم لأداء رقاقة ورقاقة وما يليها التجارب مع جودة عالية من لونين المنفصمة. أجريت جميع التجارب الشذرة هو مبين في هذا المنشور باستخدام لونين الطازجة. ومن الممكن أيضا لتجميد الخلايا الثابتة في -80 ° C والمضي قدما في التحضير لونين والقص في يوم مختلف. ومع ذلك، لونين أعد من خلايا ثابتة المجمدة قد تتصرف بشكل مختلف من لونين الطازجة، وبالتالي قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل إعداد لونين الظروف صوتنة. عند العمل مع أنواع مختلفة من الخلايا، ومخازن القص مع تركيبة المنظفات المختلفة (SDS) يمكن استخدامها. أنواع الخلايا مثل خطوط الخلايا الأولية أو خلية تزرع في تعليق هي خلايا صعبة للقص وسوف تتطلب تركيزات عالية SDS (1٪) في حين خطوط الخلايا التي يسهل القص مثل هيلا سيتطلب تركيزات منخفضة SDS (0.1٪) في مخازن القص. res.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. التحقق من الأجسام المضادة الشذرة الصف باستخدام نظام الأتمتة. تم تنفيذ الشذرة مع anti-H3K79me3، -H3K27me3، -H3K4me3، -H3K4me2، -H3K9ac، H3K9 / 14ac، -H3K36me3 و-H3K9me3 الأجسام المضادة الأرنب بولكلونل على لونين المنفصمة من 1 مليون دولار خلايا هيلا-S3 اعتمادا على التعديلات هيستون. واستخدمت بروتوكولات الشذرة الآلي مع وحدات التخزين العمل 200 ميكرولتر في الصك الآلي للتجارب الأجسام المضادة المعايرة. تم اختبار الأجسام المضادة كميات من 1، 2، 5 و 10 ميكروغرام في التجربة الشذرة واستخدمت 2 ميكروغرام مفتش كما سيطرة سلبية في كل تجربة. تم تقييم التخصيب التي كتبها QPCR. وتظهر نتائج كنسبة مئوية من المدخلات (المبلغ النسبي من الحمض النووي DNA immunoprecipitated مقارنة المدخلات بعد تحليل QPCR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> بعد التأكد من صحتها وتحديد أوبتيما<html> كميات لتر من الأجسام المضادة الشذرة الصف لاستخدامها في نظام التشغيل الآلي، وأجريت التجارب رقاقة وما يليها الآلي من أجل إنشاء ملفات تعريف التسلسل لكل التعديل هيستون (الشكل 4). <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" /> الشكل 4. هيستون رقاقة وما يليها محات المتولدة عن تجارب رقاقة وما يليها الآلي. ويوضح الشكل لمحات رقاقة وما يليها في المناطق الجينومية مختلفة لH3K4me3، H3K9ac وH3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3، وH3K36me3. يظهر 4A توزيع الذروة على طول X الكامل -chromosome و4B التوزيع في منطقة 75 كيلو بايت المحيطة الجينات GAPDH. يظهر 4C لمحات من H3K27me3، H3K36me3 وH3K4me3 في منطقة 500 كيلو بايت المحيطة الجين MYT1 و4D يظهر توزيع H3K9me3 في ZNF12 المحيطة 200 كيلوبايت المنطقة.large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. تم إنشاء هيستون ملامح جينية لمدة ستة التعديلات هيستون مختلفة تترافق مع التعبير الجيني (H3K4me3، H3K9ac، H3K9 / 14ac، H3K4me2، H3K79me3 وH3K36me3). ويبين الشكل 4A ملامح رقاقة وما يليها على طول الكروموسوم X لعلامات هيستون مختلفة. العلاقة ذروة عالية لوحظ بين 6 محات هيستون المختلفة يدل على قدرات نظام آلي لتوليد بيانات دقيقة وموثوق بها. الشكل 4B، 4C و 4D تظهر توزيع قمم للتعديلات هيستون مختلفة في المناطق الجينومية محددة. الآلي التجارب الكروماتين مناعي وصولا الى 200 خلية الحد الأدنى من الخلايا التي يمكن استخدامها في التجارب الشذرة يعتمد على نوعية من لونين، وspecificitذ وحساسية الأجسام المضادة وفرة من التعديل هيستون أو البروتين دراستها. اختيار الأجسام المضادة جيدة رقاقة وما يليها الصف المهم عند العمل مع كميات محدودة من العينة واختيار الكواشف الأمثل وشركات مختلفة يحسن كفاءة الانتعاش DNA والمساهمة في نجاح التجربة الشذرة. لتحديد الحد الأدنى من الخلايا التي بروتوكول الشذرة الآلي يمكن معالجة كميات مختلفة من لونين، الأجسام المضادة، وحبات مغناطيسية تم اختبارها في النظام الآلي IP-ستار باستخدام الكواشف الشذرة على وجه التحديد الأمثل للعمل مع كميات منخفضة من لونين. أولا، كان sonicated لونين من 10،000 الخلايا كما هو موضح في البروتوكول. تم تأكيد النتائج الشذرة التي كتبها QPCR (الشكل 5A) مما يدل على التخصيب كبيرة مع H3K4me3 الأجسام المضادة في مناطق السيطرة الإيجابية وإشارة تذكر في مناطق سيطرة سلبية. وعلى سبيل المقارنة وإثبات الاتساق، additionaوتقدم البيانات التي تم الحصول عليها لتر مع H3K27ac، H3K9me3، والأجسام المضادة H3K27me3، وذلك باستخدام 10،000 الخلايا. وأجريت التجارب الشذرة الآلي ثم لإثبات قدرات النظام الآلي للعمل مع كميات منخفضة من الخلايا باستخدام نفس H3K4me3 الأجسام المضادة. رقاقة الآلي أداء جيدا، ويتجلى ذلك سلسلة من عشرة ردود الفعل IP التي كانت استنساخه وقابلة للمقارنة إلى حد كبير مع اليدوية النتائج الشذرة (الشكل 5B). وأجريت التجارب اليدوية والآلية وشوهدت فوائد البروتوكولات الآلي في الحد من تجربة إلى تجربة تقلب (الشكل 5C). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" /> الشكل 5. الأمثل من رقاقة والسيارات رقاقة تجارب على خلايا 10،000 أجريت التجارب الشذرة دليل على 10،000 الخلايا وباستخدام 0.25 ميكروغرام من H3K4me3، 0.1 ميكروغرام من H3K27ac، و 0.5 ميكروغرام من H3K9me3 و 0.25 ميكروغرام من الأجسام المضادة H3K27me3. واستخدمت كميات مماثلة من أرنب مفتش كمجموعة تحكم. تم إجراء QPCR مع الاشعال لمدة مواضع إيجابي واثنين من مواضع السلبي لكل مقايسة الشذرة. ويبين الشكل 5A الانتعاش، كنسبة مئوية من المدخلات (المبلغ النسبي من الحمض النووي DNA immunoprecipitated مقارنة المدخلات بعد تحليل QPCR). الشكل 5B العروض 10 ردود الفعل رقاقة تعمل على النجوم IP المدمجة باستخدام 0.25 ميكروغرام H3K4me3 الأجسام المضادة بولكلونل و 0.25 ميكروغرام من أرنب مفتش سيطرة سلبية لأنه الأجسام المضادة. ثم تم إجراء تحليل QPCR مع الاشعال للالإيجابي المروج مواضع EIF4A2 وGAPDH TSS والسلبية مواضع الميوجلوبين exon2 وSAT2. ويوضح الشكل الانتعاش، معبرا عنه كنسبة مئوية من المدخلات (مبلغ النسبي من الحمض النووي DNA immunoprecipitated مقارنة المدخلات بعد تحليل QPCR). ويبين الشكل 5C البيانات H3K4me3 الشذرة من 10 تجارب الشذرة اليدوية بالمقارنة مع 10 رقاقة التجارب الآلي. أشرطة الخطأ تمثل الصورة<html> الانحرافات tandard كل من مكررات عشرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> من أجل فهم حساسية البروتوكولات الشذرة الآلي، وأجريت التجارب باستخدام مبلغ من الخلايا التي تراوحت بين 100،000 الى 200 خلية لكل IP. تم استخدام الأجسام المضادة لمكافحة H3K27me3 كما هو تعديل هيستون شائع جدا. استخدام أخرى هيستون أو عدم هيستون الأجسام المضادة قد تتطلب خلايا أكثر أو أقل، اعتمادا على وفرة حاتمة ونوعية الأجسام المضادة. تم التحقق من صحة التجارب التي كتبها الكمي PCR ولوحظ أن من خلال تقليل كميات من الخرز والخلفية الأجسام المضادة في التجارب يتم تخفيض السماح نتائج ناجحة الشذرة-QPCR مع اقل من 200 خلية الأجسام المضادة (الشكل 6). ديزيل / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 6. الآلي المقايسات رقاقة على 200 خلية. خلايا هيلا-S3 والأجسام المضادة الموجهة ضد H3K27me3. تم المنفصمة لونين من 1 مليون خلية والتخفيفات المسلسل من هذه الكروماتين (من 100،000 إلى 200 أي ما يعادل الخلية) استخدمت في رد الفعل الشذرة. واستخدمت 1 ميكروغرام من H3K27me3 و 10 ميكرولتر من البروتين المغلفة وحبات مغناطيسية على التجربة 100،000 الخلايا، 0.5 ميكروغرام من H3K27me3 و 10 ميكرولتر من الخرز على 10،000 و 1،000 خلايا، و 0.25 ميكروغرام من H3K27me3 و 5 ميكرولتر من الخرز مع 500 و 200 الخلايا. استخدمت 1 ميكروغرام و 0.5 ميكروغرام من أرنب مفتش كما سلبي تحكم الأجسام المضادة عند إجراء التجارب مع 100،000 الخلايا وخلايا 1،000 على التوالي. ويظهر 6A إشغال TSH2B وGAPDH الجينات في المائة خلال الإدخال. يظهر 6B الإشغال النسبي للTSH2B مقابل السيطرة GAPDH السلبية المنطقة الجينومية. تحليل المصب من النتائج الشذرة وما يليها على10،000 خلايا من أجل تقييم الجودة العالمية من التجارب الآلي رقاقة وما يليها مع أرقام انطلاق منخفضة من الخلايا، وأجريت فحوصات الآلي رقاقة وما يليها مع 0.25 ميكروغرام من الأجسام المضادة H3K4me3 على 10،000 خلايا هيلا والتجارب رقاقة على واستخدمت 100،000 خلايا هيلا-S3 كما السيطرة الإيجابية للتجربة. تم إعداد المكتبات الآلي باستخدام مكتبة MicroPlex الكواشف إعداد عدة تتكيف مع المكتبات مستعدة مع كميات DNA منخفضة. لاحظ أنه على الرغم من أنه من الممكن أن تؤدي ناجحة الآلي الشذرة-التجارب مع أقل من 10،000 الخلايا، فإن كميات من الحمض النووي انزلوا لا تكون كافية لإعداد المكتبات باستخدام الكواشف عدة. وأجريت الجيل العنقودية والتسلسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. يحلل المعلوماتية الحيوية بعد العرض التسلسل نتائج باهرة من العينات منخفضة الشذرة عدد الخلايا. مجموعة البيانات 30 خريج (الموافق 10،000 الخلايا من المواد ابتداء من<html> ) يحتوي على انخفاض الضوضاء في الخلفية وقمم تخصيب موثوق بها للغاية والتي أكدت من قبل كل من مجموعة البيانات 300 خريج (الموافق 100،000 الخلايا من المواد ابتداء) ومجموعة البيانات H3K4me3 الناتجة عن المعهد واسعة للمشروع ترميز والذي تم استخدامه بمثابة مرجع خارجي. ومن المهم أن نلاحظ أعلى 40 التداخل نسبة البيانات، والتي تشير إلى الطريقة القياسية المستخدمة في المشروع ENCODE 11 التي تعتبر رقاقة وما يليها استنساخه إذا بمقارنة مجموعتين من البيانات هناك ما لا يقل عن التداخل 80٪ من أفضل 40٪ من القمم التي كتبها درجة الأهمية في المرتبة. مجموعة البيانات 30 خريج يحقق هذه المعايير بالمقارنة مع كل من مجموعة البيانات 300 خريج (النظر في جميع مستويات الذروة التي بلغتها، وليس فقط أفضل 40٪) وبيانات معهد برود (الجدول 1). ويوضح بيانات 300 خريج قمم مماثلة تقريبا لبيانات معهد برود مع 98٪ أعلى 40 نسبة التداخل (الشكل 7). ighres.jpg &quot;/&gt; تم إنشاء الشكل 7. المقايسات رقاقة وتوليد المكتبة على 10،000 خلايا التجارب رقاقة وما يليها على 10،000 و 100،000 خلايا هيلا-S3 باستخدام H3K4me3 الأجسام المضادة (0.25 ميكروغرام / ميكرولتر). تم تعيين علامات غليان 35 إلى الجينوم البشري مع اليجنر إلاند. خلال ذروة اللاحقة يدعو SICER يمكن تحديد موثوق التخصيب من أعداد الخلايا منخفضة وكذلك من ملايين الخلايا. تم تحليل مجموعات البيانات ومقارنتها مع بعضها البعض، وإلى البيانات المرجعية التي تولدها معهد برود. عينات الخلايا منخفضة تتفق ولها تشابه عالية جدا. تلبي العينة 30 خريج معايير ترميز 11 (دقيقة. 80٪ من أعلى 40٪ من القمم يجب أن تتداخل). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" /> الجدول 1. </stroنانوغرام&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells at JoVE.com

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

أتمتة التجارب رقاقة وما يليها لتوليد الملامح جينية على خلايا هيلا 10،000

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

automating-chip-seq-experiments-to-generate-epigenetic-profiles-on

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  Diagenode S.A.. Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Video: Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

حقن آن. stephensi الجنين لتوليد الملاريا مقاومة البعوض

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

فحوصات السمية للاختبار تأثيرات جينية من المخدرات للتنمية، الخصوبة والوراثة من الملاريا البعوض

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

إجراء سيميومتوميد ChIP-Seq للدراسات اللاجينية على نطاق واسع

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

استراتيجية من خطوتين تجمع بين التعديل اللاجيني والإشارات الميكانيكية الحيوية لتوليد خلايا الثدييات متعددة القدرات

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

استخدام خزعات الجلد لتوليد خلايا بودوسيت مشتقة من المريض

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the glomerulus. Mutations in podocyte-specific genes can cause focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), and podocytes are also affected in many other primary and secondary nephropathies. Due to their differentiated nature, primary cell culture models are limited for podocytes.&#160;Therefore, commonly conditionally immortalized cells are used. However, these conditionally immortalized podocytes (ciPodocytes) have several limitations: the cells can dedifferentiate in culture, especially when they reach confluency, and several podocyte-specific markers are either only slightly or not expressed at all. This brings the use of ciPodocytes and their applicability for physiological, pathophysiological, and clinical reach into question. Here, we describe a protocol for the generation of human podocytes-including patient-specific podocytes-from a skin punch biopsy by episomal reprogramming of dermal fibroblasts into hiPSCs and subsequent differentiation into podocytes. These podocytes resemble in vivo podocytes much better in terms of morphological characteristics, like the development of foot processes and the expression of the podocyte-specific marker. Finally, yet importantly, these cells maintain patients&#39; mutations, resulting in an improved ex vivo model to study podocyte diseases and potential therapeutic substances in an individualized approach.

تسليط الضوء على المؤلف: جيل من الخلايا القلبية المشتقة من المريض من خزعات الجلد  

This manuscript describes a two-step protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts via episomal reprogramming into human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and subsequent differentiation into podocytes.

توليد الخلايا القرنية المشتقة من المريض من خزعات الجلد

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...