אנו מודים לחברי המעבדה של ויג'יאאנאנד על העזרה הטכנית והדיונים הבונים ועל ד"ר שרון סקוואזו ומר ג'פרי ברגוט מדיאגנודה על הסיוע הטכני עם מכונת הניקול והפרוטוקולים של Sonicator ו- ChIP. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) ו- S10OD016262 (אילומינה HiSeq 2500).

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Mapping+of+in+Vivo+Protein-DNA+Interactions.">Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Mikkelsen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+maps+of+chromatin+state+in+pluripotent+and+lineage-committed+cells.">Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells.</a> Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Seumois, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+of+primary+human+T+cells+reveals+enhancers+associated+with+TH2+memory+cell+differentiation+and+asthma+susceptibility.">Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility.</a> Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17q21+asthma-risk+variants+switch+CTCF+binding+and+regulate+IL-2+production+by+T+cells.">17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells.</a> Nature Communication. 7, 13426 (2016).</li><li>Ai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+chromatin+states+using+single-cell+itChIP-seq.">Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communication. 6, 6033 (2015).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).</li><li>Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+and+Semiautomated+Microscaled+Approach+to+Profile+Cis-Regulatory+Elements+by+Histone+Modification+ChIP-Seq+for+Large-Scale+Epigenetic+Studies.">An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies.</a> Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> Elife. 6, 21856 (2017).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Genetic+Polymorphisms+on+Human+Immune+Cell+Gene+Expression.">Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression.</a> Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drivers+of+Epigenetic+and+Transcriptional+Variation+in+Human+Immune+Cells.">Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells.</a> Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).</li><li>Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEDIPS:+genome-wide+differential+coverage+analysis+of+sequencing+data+derived+from+DNA+enrichment+experiments.">MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments.</a> Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).</li><li>Engel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate-like+functions+of+natural+killer+T+cell+subsets+result+from+highly+divergent+gene+programs.">Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoBATCH+for+High-Throughput+Single-Cell+Epigenomic+Profiling.">CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li><li>Diagenode. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+Guide+for+Chromatin+Shearing+Optimization+with+Bioruptor+Standard+and+Plus.">The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus.</a> Diagenode. , (2012).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המתוארת כאן מרחיבה על הליך ChIPmentation11, המיישם פרוטוקול הכנת ספריית תגים לפני טיהור ה- DNA, על ידי אוטומציה ומיקרו-חישוב של הפרוטוקול. מאז תחילת ChIP-Seq, מספרי התאים הנדרשים צומצמו באופן דרסטי, החל בכ -20 מיליון תאים עבור היסטונים עד למאות ואפילו תאים בודדים1,7,10,12,18,19,20,21. שיטות אלה שפותחו לאחרונה אפשרו הבנה עמוקה יותר של האופן שבו מנגנוני cis-רגולטוריים פועלים בתאים על ידי הגברת הרגישות ומאפשרים לאוכלוסיות תאים קליניים נדירים להיבדק5,6,12,17. לדוגמה, אחד ההליךים האחרונים והפופולריים יותר, הנקרא CUT&TAG, כחלופה חזקה ורגישה של ChIP-Seq9. הוא מייצר יחס אות לרעש מצוין מכיוון שהאנזים Tn5 קשור באופן קוולנטי לחלבון A ומזהה את שרשרת ה- Fc של נוגדן ChIP עם ספציפיות גבוהה9. פעילות הרקע של Tn5-אנזים מופחתת כמו האנזים אינו פונקציונלי לפני קשירה נוגדן היעד9. עם זאת, היישום של שיטה זו בהקשר קליני מוגבל שכן הוא דורש תאים חיים לא קבועים. כמו כן, הסרת שברי DNA מהגרעין ההיפוטוני יכולה להיות השפעות שליליות על הכרומטין כפי שהוא מוסר במהלך בדיקה. הדרישה הדרושה לעבוד עם תאים טריים וחיים היא מקור לבעיות עבור דגימות קליניות נדירות עבור קבוצות גדולות של דגימות, שכן קבוצות גדולות יכול לקחת שנים רבות כדי לאסוף5. סוג אחר של שיטה, drop-ChIP, משתמש באלגנטיות התקן microfluidics כדי ליצור tagmention מבוסס טיפה לפני עיבוד ChIP19. עם זאת, הוא משתמש במכשיר microfluidic מיוחד מאוד, בעוד שניתן להשלים ChIP-Seq תא יחיד, הוא מוגבל גם לשימוש בתאים חיים7,8,9,18,19. שיטות חדשות יותר המסתמכות על ChIP-Seq כגון PLAC-Seq או HiChIP, מנסות להבין אינטראקציות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) בין פסגות ChIP-Seq22,23. שיטות תלת-ממד אלה מרגשות כאשר הן מזהות אינטראקציות רגולטוריותאו TF מתווכות ברחבי הגנום ומשפרות את ההבנה של הרגולציה של ביטוי גנים בסוגי תאים של עניין, ברקמות בריאות ובהקשר של מחלות.
ישנם כמה צעדים קריטיים לשקול עבור הפרוטוקול להיות מוצלח כגון איכות הכרומטין sonicated ואיכות הנוגדן. יעילות הגיהה היא קריטית, אם הכרומטין אינו sonicated היטב, היעילות של בדיקה פוחתת באופן דרסטי24. Sonication הוא היבט מאתגר של ChIP-Seq בשל מספרי התאים הנדרשים. על sonicator בשימוש בפרוטוקול, היעילות צומצמה באופן דרסטי תחת 300,000 תאים. זהו היבט מאתגר ב ChIP-Seq כמו sonicate תחת רמה זו לעתים קרובות ידרוש פיצול אנזימטי, וזה פחות משוא פנים. כתוצאה מכך, sonication הוא גורם מוגבל עיקרי עבור ChIP-Seq מיקרו-קנה מידה אמיתי. פלטפורמות sonication אחרות וערכות זמינות מסחרית נבדקו עבור sonicating כרומטין, אבל sonicator בשימוש כאן היו התוצאות החזקות ביותר לשחזור. יתרון נוסף של sonicator הוא לא צריך לרכוש צינורות מיוחדים כדי להפעיל את sonication, אשר מפחית עלויות בעת התמודדות עם מספר רב של דגימות. עבור sonication אופטימלי, ראשית, חשוב לחמם מראש את sonicator כמתואר לעיל. שנית, כדי ללזר את הכדור, מומלץ לקבל את קצה pipette נוגע בתחתית הצינור תוך ליסינג לשבור את התאים עם מגבלות פיזיות יותר. שלישית, כל היווצרות בועה לפני sonication מעכב את היכולת של המדגם להיות sonicated באופן שווה. אם יש בועות שנוצרו במהלך תמהה, חשוב להסיר אותם עם pipette. זה יכול להיות מאתגר מבלי להסיר הרבה מדגם, אבל אם הקצה הוא לחוץ קלות נגד הבועה זה יכול להיות נמשך לאט ללא אובדן של מדגם רב. לבסוף, בעת קביעת מספר המחזורים, להשלים קורס זמן שבו כל שלושה מחזורים, מדגם מוסר, מטוהר, רץ על ג'ל אגרוז. הימנע over/under sonication של דגימות כמו זה מקטין את יעילות ChIP. אם המדגם הוא תחת sonicated, שברים גדולים יכולים להיות השפעה שלילית על איכות ChIP-Seq24. מצד שני, אם המדגם הוא over sonicated, קיים סיכון של אפיטופ היעד ללכת לאיבוד בתהליך.
חלק חיוני נוסף של ChIP-Seq הוא איכות הנוגדן. לפני הפעלת כל מחקר בקנה מידה גדול, יש צורך לייעל את הנוגדן אשר ישמש. המטרה היא להשיג יחס אות לרעש גבוה באופן משמעותי של אזורים ידועים של הגנום ועוד אחד הוא הרבייה. אם הנוגדן מושך הרבה אות רקע, מומלץ להשתמש בקלט גדול יותר או לנסות הרבה / ספק אחר. זה יוסיף זמן לפני תחילת ניסוי בקנה מידה גדול, אבל זה צעד חיוני. כדי לבדוק אם יש אות לרעש מומלץ להשתמש ב-qPCR עם אזורים הידועים כיעד לנוגדן שלך ואזור אחר שידוע שהוא נעדר. זה כבר הבחין שינויים histone הם חזקים יותר וקל יותר לייעל מאשר TFs.
הפרוטוקול המתואר לעיל מספק שיטה חזקה לשינוי Histone-Seq בעל תפוקה גבוהה באופן חצי-אוטונומי, מיקרו-קנה מידה. השיטה מגבילה את כמות הזמן מעשי ומגדילה את יכולת הרבייה על פני ChIP-Seq ידני. מחקרים קודמים שהושלמו במעבדה השתמשו ב- ChIP ידני על שכפולים טכניים והשיג ממוצע מתאם ספירמן של 0.505, עם זאת, עם המערכת חציautomated, מתאם ספירמן בין תורמים שונים עם ממוצע תאי NK של 0.66 (טבלה משלימה 2). זה גם הושלם עם כ -40% פחות זמן מעשי. השיטה המתוארת כאן עברה אופטימיזציה לשינויי histone (H3K27ac המוצג כאן, אך הפרוטוקול לא צריך שום שינוי עבור אחרים) וידרוש רק שינויים קלים ליישום עבור TF ChIP-Seq. למרות איכות הנוגדן, השינוי העיקרי יהיה עבור זמן sonication ואולי את המאגרים המשמשים במהלך ה- IP. בדרך כלל, עבור בדיקות TF ChIP, השיטה עשויה לעבוד טוב יותר עם שברים מעט ארוכים יותר של כרומטין (עם טווח של סביב 350-800 bp) כמו TF: מתחמי DNA נוטים פחות להישמר באמצעות sonication קפדני6. ייתכן שהמאגרים יצטרכו גם לעבור לתערובת מותאמת אישית או לערכות זמינות אחרות בתעשייה, מכיוון ש- TFs יכול להתנהג באופן שונה משינויי histone.
למרות המטפל הנוזלי האוטומטי ChIP נבדק עבור כמה שפחות עד 10,000 תאים, חלה ירידה ניכרת בשחזור בריכוזים כרומטין נמוכים יותר. בשל כך, הפרוטוקול לא הומלץ על פחות מ -10,000 תאים, עם 100,000 תאים להיות התנאים האופטימליים. הפרוטוקול הושלם גם באמצעות מאגרי ChIP בתעשייה, אשר היה הוצאה נוספת אך סיפק נתונים באיכות גבוהה יותר. הפרוטוקול יכול להיות שונה לגבי תנאי sonication (כל עוד הכרומטין הגועה נשמר באותו טווח), מאגרים ניתן להתאים אישית עבור immunoprecipitation (IP; אופטימיזציה עשויה להידרש), או המטפל בנוזל ChIP לא ניתן להשתמש. מגבלה של הפרוטוקול היא השימוש של המטפל בנוזל ChIP, אשר יכול להיות השקעה יקרה יכול רק להפעיל 16 דגימות בבת אחת. המטפל בנוזל ChIP מוגבל לתגובות בקנה מידה קטן ומספרי תאים הגדולים ממיליון אינם מומלצים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להסתיים בלעדיו, על ידי השלמת שלבי ה- IP והשטיפה באופן ידני. אם ה- IP והכבסות הושלמו ביד, הזמן להשלים את בדיקת ה- Assay יגדל והשחזור עשוי לרדת, אך מדריך זה עדיין יהיה שימושי בהפעלת ניסוי ChIP-Seq באיכות גבוהה. ראוי לציין, מפעילים נוזליים אחרים יכולים להיות מותאמים להפעלת תגובות ChIP חציautomated.
לסיכום, היתרונות העיקריים של מערכת זו הם אופי התפוקה הגבוהה, שכן שלבי הקניין הרוחני והשטיפה הושלמו באופן אוטונומי. ככזה, ניתן להשלים סבבים רציפים של ניסויי ChIP, המאפשרים עד 48 דגימות להיות מעובדות במלואן ומוכנות לרצף תוך 5 ימים, עם זמן מעשי מוגבל בהשוואה לניסויים ידניים של ChIP-Seq. יתרון נוסף הוא רבייה מוגברת מאז ChIP-Seq יכול להיות קשה להשיג תוצאות רבייה מאוד. שיטות אחרות דורשות תאים חיים, מערכות מיקרו-צנרת מורכבות, או שהעבודה תושלם במלואה ביד. מערכת זו תצטרך להיות ממוטבת עבור דגימות קלט נמוך (<10,000 תאים), ובסופו של דבר מאפשר תגובות ChIP של תא יחיד. המערכת מסוגלת גם להיות מותאמת לשיטות ChIP החדשות יותר, כגון PLAC-Seq ו- HiChIP22,23.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Pandurangan Vijayanad
to:
Pandurangan Vijayanand

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.

Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Sara Herrera-da&#160;la Mata
to:
Sara Herrera-de la Mata

השימוש הנרחב של ChIP-Seq assays לקביעת שברי DNA הקשורים לשינויים ספציפיים histone הוא בין היתר בשל יכולתו לזהות אלמנטים DNA cis-רגולטורי, כולל משפרים פעילים, מקדמים, משתיקי קול, heterochromatin, ואחרים1,2,3,4. זיהוי של אזורים רגולטוריים שאינם קידוד ברחבי הגנום הראה תובנה חשובה כדי להבין טוב יותר את ויסות הגנים בבריאות ובמחלות4. עבודה קודמת מהמעבדה השתמשה ב- ChIP-Seq כדי להראות כי cis-אלמנטים רגולטוריים יכולים לשחק תפקידים חשובים בסוגי תאים שונים5. בדיקת גורם שעתוק (TF) ChIP נוצלה כדי להראות מחלה הקשורה לפולימורפיזם נוקלאוטידיחיד 6.
השימוש ב- ChIP-Seq עם דגימות קליניות אנושיות הוא מאתגר, בעיקר בשל הגבלת מספרי התאים או דגימת הרקמה הרצויה. כתוצאה מכך, היה מאמץ מרוכז בתחום לשפר ולצמצם את הטכניקות האלה וכתוצאה מכך, כמה בדיקות הופיעו, כגון CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12. בדיקות אלה משתמשות בתחומים כדי לתייג ולבודד אזורים גנומיים הקשורים לנוגדן מסוים9. טכניקה זו הצליחה להפחית את מספרי התאים עד 1,000s ובמקרים מסוימים לתא אחד, עם זאת, השימוש בטכניקה זו במחקר תרגומי וגדיר קליני הראה מגבלות בשל הדרישות של שימוש בתאים חיים לשיטה זו9,12. דרישת התא החי מקשה לוגיסטית על דגימות קליניות ויכולה להציג אפקטי אצווה אם הדגימות אינן מעובדות בו זמנית. אחרים יש טכניקות microscaled ממוטב עבור תאים קבועים פורמלדהיד, כולל הפיתוח של ChIPmentation11, אשר מותאם כאן באופן תפוקה גבוהה. השימוש בתאים קבועים מאפשר לאחסן דגימות עד איסוף ועיבוד לאחר מכן של כל הדגימות יחד כדי למזער את אפקטי האצווה.
כאן, מתוארת צ'י-אי-סייק מיקרו-קנה-קנה מיקרו-קנה למחצה, המקצרת את זמן הניסויים לפרופיל של שינויים בהיסטון10. השיטה חצי-אטומית מאפשרת תפוקה גבוהה של ChIP-Seq, ומאפשרת עיבוד מלא של עד 48 דגימות ומוכנות לרצף תוך 5 ימים בלבד, עבור עד 10,000 תאים לכל דגימה באמצעות מטפל בנוזל ChIP. המטפל משלים את האימונופרציפיטציה (IP) ולאחר מכן שוטף באופן אוטונומי, אשר מסייע להפחית את השונות בין דגימות. השיטה החצי-אטומית מורידה הן את הזמן הידיים על ידי מעל 15 שעות עבור 48 דגימות ואת השונות הטכנית, ומאפשר מחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול להתבצע באופן רב לשחזור ומהיר עבור תאים ראשוניים או תרבית. הפרוטוקול מסביר את התהליך מתחילתו ועד סופו עבור ChIP-Seq באיכות גבוהה. אם המחשבים הספציפיים אינם זמינים, הפרוטוקול עדיין יהיה משאב שימושי כדי להגדיר ולירות בעיות ChIP-Seq ניסויים באופן ידני.
ההסתה בוצעה עם שלושה סוגי תאי חיסון אנושיים עיקריים שונים וקו תאים בתרבית אחד (HUT78 – ATCC: TIB-161). לבהירות, הפרוטוקול חולק לשבעה חלקים: קיבוע תאים, גיזום כרומטין באמצעות sonication, אימונופרציפיטציה אוטומטית של כרומטין, הכנת ספריה על ידי תגית שבר DNA, הגברה בספרייה, טיהור הספרייה, ואחריו כימות DNA. למתכוני חוצץ אנא עיינו בטבלה משלימה 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="950">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">200 &#181;l tube strips (8 tubes/strip) + cap strips</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020002</td>
			<td style="width:288px;">Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">AMPure XP for PCR Purification</td>
			<td style="width:127px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>SPRI beads</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td>0.65 mL low binding tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Bioruptor Pico Sonicator</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B01060010</td>
			<td>Sonicator used in the lab but others can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ChIP DNA Clean &#38; Concentrator (Capped Columns)</td>
			<td style="width:127px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D5205</td>
			<td>DNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA pH 8.0</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Glycine</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">50046-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">H3K27ac polyclonal antibody - Premium</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15410196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES (1 M) pH 7.5</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20027213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20034197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IP-Star Compact Automated System</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B03000002</td>
			<td>Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">KK2601</td>
			<td>PCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">R0971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4551-250ML</td>
			<td>CAUTION - low flash point</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (5 M), RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-4700</td>
			<td style="width:288px;">8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PureLink RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td>Used in the flourescence quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">4485699</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ROX Reference Dye</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12223012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">303410-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td>nucleic acid dye</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Tips (bulk)</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30040020</td>
			<td>Tips for the IP Star</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">True MicroChIP Kit</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C01010130</td>
			<td>Contains all the buffers for the IP; ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies

אימונופרציפיטציה של כרומטין ואחריה רצף (ChIP-Seq) היא גישה רבת עוצמה ונפוצה לפרופיל כרומטין DNA הקשור לשינויים ספציפיים histone, כגון H3K27ac, כדי לסייע בזיהוי יסודות DNA cis-רגולטורי. התהליך הידני להשלמת ChIP-Seq הוא עבודה אינטנסיבית, מאתגר מבחינה טכנית, ולעתים קרובות דורש מספרים גדולים של תאים (>100,000 תאים). השיטה המתוארת כאן מסייעת להתגבר על אתגרים אלה. הליך H3K27ac ChIP-Seq מלא, בעל קנה מידה זעיר, כולל קיבוע תאים, גיזת כרומטין, אימונופרציפיטציה והכנת ספריית רצף, עבור אצווה של 48 דגימות עבור כניסות מספר תא פחות מ-100,000 תאים מתואר בפירוט. הפלטפורמה החצי-אוטונומית מפחיתה את השונות הטכנית, משפרת את יחסי האות לרעש ומפחיתה באופן דרסטי את העבודה. המערכת יכולה ובכך להפחית עלויות על ידי מתן אפשרות לנפחי תגובה מופחתים, הגבלת מספר ריאגנטים יקרים כגון אנזימים, חרוזים מגנטיים, נוגדנים וזמן מעשי נדרש. שיפורים אלה בשיטת ChIP-Seq מתאימים באופן מושלם למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול של דגימות קליניות עם מספרי תאים מוגבלים באופן רב לשחזור.

כהוכחה לרעיון, ChIP-Seq הושלם עבור שישה תורמים אנושיים עם שלושה סטים של סוגי תאי חיסון: תאי CD4 T נאיביים (CD4), מונוציטים קלאסיים (MO) ותאי הרג טבעיים (NK), מועשרים על ידי מיון FACS כמתואר לפני13. הנוהל בקו תחתון מורכב מתשעה הליכים נפרדים כפי שהם מיוצגים באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig1.jpg"> איור 1: תרשים זרימה כללי להליך. (A) קריקטורה של ההליך הכולל (שנוצר ב- BioRender). (B)תרשים זרימה עבור כל השלבים העיקריים עבור הפרוטוקול והזמן המוערך של הידיות והזמן הכולל המשויך לכל יום. הרצף יכול לקרות בסוף היום החמישי או מאוחר יותר עם סיבובים מרובים. ציר הזמן יכול גם להיות מתנדנד לאורך כל השבוע, שבו יום רציף 3-4 ניתן להשלים מספר פעמים בשבוע כדי ליצור 48 דגימות ChIP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לאחר בידוד תאים על ידי ציטומטריהזרימה 13, תאים ממוינים היו צנטריפוגות ותאים קבועים ומאוחסנים כמתואר לעיל. לאחר שכל הדגימות נאספו, הדגימות היו lysed והוכנו לגיזה כרומטית בקבוצות של 12 כמתואר לעיל. עבור כל מדגם, מספר המחזורים להגיע sonication אופטימלי הושלם10. מדידה כמותית, כמו גם מדידות גודל שבר כרומטין גועתי הראו שחזור נהדר של השיטה שלנו בשלושת הסטים של תאי מערכת החיסון (איור 2A). תאי החיסון האנושיים השונים היו sonicated בקבוצות נפרדות והניבו בעקביות רבה עם > 70% של המדגם בין 100 - 500 bp עבור 14 מחזורים (16 s ON, 32 s OFF למחזור). בשלב זה, דגימות עם שברים גדולים לאחר sonication (< 70% של המדגם בין 100 - 500 bp) נחשבו ככושל. דגימות אלה יכול גם sonicated עבור 1-2 מחזורים נוספים או הושלכו והוחלפו מאוחר יותר עם תאים מכדור אחר. השיטה שלנו הראתה שאף אחת מהדגימות לא דרשה יותר sonication או בוטלו, מה שמרמז על חוסן מוחלט של ההליך.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig2.jpg"> איור 2: דוגמאות QC טרום רצף. (A) 1.2% ג'לים אגרוז להראות רבייה של sonication. דגימות Sonication עבור 6 תורמים בשלושה סוגי תאים: תאי CD4 T נאיביים (CD4), מונוציטים קלאסיים (MO) ותאי רוצח טבעיים (NK). הדגימות היו sonicated במשך 14 מחזורים (16 s ON, 32 s OFF למחזור). עבור כל מדגם כ 200 ננוגרם של כרומטין decrosslinked נטענו על ג'ל אגרוז 1%. דגימות נחשבו טובות אם יותר מ - 70 % מהשברים נמצאים בתוך 100-500 bp. (B) עקומות הגברה למעלה - ניתוח qPCR כדי לקבוע את המספר האופטימלי של מחזורים להגברה (Ct שבו יש 1/2 את העוצמה המרבית). הדגימות האידיאליות יש Ct של כ 15 וגברת ניתן להשלים עד 2 מחזור יותר של Ct נמדד. החץ הוא דוגמה של דוגמה רעה שבו Ct הוא גדול מ 18. למטה - דוגמה של קבוצה גרועה של דגימות מוצגת אשר יש Ct גדול מ 18. דגימות אלה הראו גם עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה יותר. (C)עקבות אלקטרופורזה של מנתח שברים הראו את התפלגות הספריות הסופיות לאחר ההגברה ובחירת הגודל. דגימות עם יותר מ -85% מספריית הקטעים נמצאות בתוך 200-1,000 bp נחשבו כדוגמאות טובות. מדידת עוצמת שיא של פלואורסצנטיות נחשבת גם לפרמטר QC חשוב, אכן אם האות נמוך, המדגם לא סביר לרצף היטב. מימין - מוצגות דוגמאות לדגימות חיוביות ב- CD4, MO ו- NK. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לאחר הכימות, הדגימות היו לרוץ על מטפל נוזלי ChIP עם נוגדנים H3K27ac, ואחריו tagmentation עם אנזים טרנספוסאז Tn5. כדי לקבוע את המספר המתאים של מחזורי הגברה על-ידי qPCR, נעשה שימוש ב-10% מהדגימות המתויגות. לקביעת מספר המחזורים להגברת הדגימות, אנו מוצאים את המחזור שבו עוצמת המדגם היא חצי מהממוצע המרבי לקביעת מחזור (איור 2B). דוגמאות עם ערכי Ct של יותר מ- 18 לא ביצעו רצף טוב לאחר הרצף וערך ה- Ct שלהם הצביע על כך מדגם ChIP שנכשל. דגימות אלה בדרך כלל גם הניבו כמות נמוכה יותר של DNA לאחר הגברה. דגימות (100,000 תאים קלט) עם ערך Ct שווה או פחות מ 15 היו אידיאליים ודגימות בין 15 ל 18 היו מקובל אבל פחות עקבי לאחר רצף. עבור דגימות עם פחות מ -100,000 תאי קלט, ערכי ה- Ct נמצאו בדרך כלל בין 15 ל - 18 אך לא היו זקוקים ליותר מ - 18 מחזורים כדי להניב מספיק מוצר לרצף.
לאחר הגברה עם תיוג DNA, ספריות טוהרו ונבחרו בגודל כדי לקבל התפלגות גודל אידיאלית, החל מ-200 עד 1,000 bp, לרצף NextGen. הערכת התפלגות הגודל בכל אחת מהספריות הושלמה מכיוון שנתוני הריצוף הטובים ביותר הושגו כאשר יותר מ-85% מרסיסי הדנ"א נעו בין 200 ל-1,000 bp (איור 2C). ראוי לציין, כמו אותה כמות של DNA (נמדד על ידי כימות פלואורסצנטיות) היה טעון, זה הבחין הדגימות עם עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה בדרך כלל רצף גרוע (איור 2C).
לאחר רצף, פקדי איכות סטנדרטיים המבוססים על הנחיות ENCODE ChIP-Seq הוחלו5,14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig3.jpg"> איור 3: שחזור של דגימות תאי החיסון. (A)רצועות H3K27ac (דפדפן הגנום של UCSC, עוצמה מרבית, פונקציית החלקה של 4, כולן עם ציר Y בקנה מידה שווה) עבור 6 תורמים (100,000 תאים לשכפול) בכל סוג תא (CD4, MO ו- NK). ארבעה loci למופת מוצגים, שניים עם (איל 2RA לוקוס ו PTPRC) ושניים ללא העשרה עבור H3K27ac (CCR4 ו- MS4A1). (B)מתאם פירסון בין התורמים לבין חלקות מתאם תואמות שנוצרו באמצעות הרחבה של 300 bp וחלון 500 bp בתוך חבילת MEDIPS עבור כל אחד מסוג התא משכפל16. (C)קבצי תורמים ממוזגים עבור כל סוג תא המציגים רצועות H3K27ac (דפדפן הגנום של UCSC בעוצמה מרבית, פונקציית החלקה של 4) באזורים ספציפיים לסוג התא (IL17R עבור CD4, CCR2 עבור MO ו- KLRC1 עבור NK) ובגן שמירת הבית B2M, הנמצא בכל סוגי התאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לבקרת איכות חזותית, הוכנו מסלולי העשרה H3K27ac לתצוגה בדפדפן הגנום של UCSC. עבור ארבעה לוקים גנטיים, מסלולים בודדים עבור כל מדגם הראו איכות מיפוי גבוהה ויחס אות לרעש המשקף את העקביות הגבוהה והחוסן של בדיקת ה- assay שלנו (איור 3A). שני הלוקי משמאל מתבטאים היטב בגנים בסוגי תאים אלה, בעוד שהגנים בשני הלוקי מימין אינם באים לידי ביטוי ומזוהים כבקרות רקע13 (איור 3A). יתר על כן, חבילת הניתוח MEDIPS שימשה כמשתנה לאחר הרצף להערכת מדד המתאם בין שכפולים טכניים (איור 3B)5,16,17, קביעת מידת המתאם עבור רמת העשרת קריאות עבור 500 bp פחים16. ברוב ההשוואות הזוגיות, מדדי המתאם של פירסון הראו יותר מ-90% מתאם המצביע על רמת עקביות גבוהה בין המשכפלים הביולוגיים (איור 3B). שכפולים עם מתאם מקובל מוזגו כדי להגדיל את יחס האות לרעש. בעוד שלוצי ספציפי לסוג התא הראה העשרה גבוהה בתאים המתאימים, גן לשמירת הבית (B2M) הראה שינוי היסטון עקבי מאוד(איור 3C). לצורך הניתוח, מיזוג מסלולים משכפולים יגביר את ההעשרה, יחזק את האות הספציפי, כולל עבור משפרים חשובים ספציפיים לסוג התא, ויפחית את השונות הבין-אישית הטמונה בדגימות אנושיות5.
למרות 100,000 תאים שימשו למחקר זה, הייתה רבייה גבוהה עבור מעטים ככל 10,000 תאים בקו תא T בתרבית אנושית (HUT78). ניתוח מתאם בין ערכת הנתונים ChIP-Seq שבוצעה מדגימות עם פחות מ-100,000 תאים הראה יכולת רבייה ומתאם גבוהים עד 10,000 תאים (איור 4A).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig4.jpg"> איור 4: יכולת רבייה של דגימות קלט נמוכות. (A) דוגמאות לעקביות של H3K27ac ChIP-Seq עבור תאים 100,000 עד 10,000 בתאי HUT-78 (קו תאי לימפומה של תאי T). הרצועות (דפדפן הגנום של UCSC, עוצמה מרבית, פונקציית החלקה של 4, כולן עם ציר Y בקנה מידה שווה) מציגות את לוקוס IL4. (B)מתאמי פירסון של המשכפלים באמצעות הרחבה של 300 bp וחלון 500 bp בתוך חבילת MEDIPS16.  (C)מתאם פירסון בין קבוצות מספר התאים השונות (100,000, 50,000 ו- 10,000 תאים) באמצעות אותם פרמטרים של MEDIPS כמו ב- (B)16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ניתוח מתאם פירסון הראה מדד מתאם גבוה (83% עד 92%), מה שמרמז על תחזוקת האות בדגימות מספר תאים נמוך. עם זאת, היה רקע מוגבר ככל שמספר התאים צומצם, כמו גם ירידה של מקדמי המתאם (איור 4B). כדי לשמור על אותות רקע נמוכים, מוזגו כפילויות טכניות והמתאם נבדק בין קבוצות (איור 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>מאגר קיבוע תאים 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תרכובת</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון פורמלדהיד</td>
			<td>11%</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>100 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>1 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA, pH 8.0</td>
			<td>0.5 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES, pH 7.5</td>
			<td>50 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאגר תמיסת מלא</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תרכובת</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריס-HCI, pH 8.0</td>
			<td>50 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>10 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>נתרן בות'ראט</td>
			<td>20 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td>
			<td>פי 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאגר תמיס לטווח קצר</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תרכובת</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריס-HCI, pH 8.0</td>
			<td>50 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>10 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>תערובת תגיות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תרכובת</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריס-HCI, pH 8.0</td>
			<td>10 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td>N,N-דימתילפורמיד</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>אנזים תיוג אילומינה</td>
			<td>1:24 וולט:vol</td>
		</tr>
<tr>
<td>תערובת CtD</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תרכובת</td>
			<td>לכל דגימה (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Index פריימר A (25 מיקרומטר)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Index פריימר B (25 מיקרומטר)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>2X KAPA HiFi חם סטארט-אפ מוכן לערבב</td>
			<td>2.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:1000 צבע ירוק SYBR</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>ROX צבע פסיבי</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים</td>
			<td>מלא ל- 4 מיקרו-אל</td>
		</tr>
<tr>
<td>תערובת AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תרכובת</td>
			<td>לכל דגימה (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2X KAPA HiFi חם סטארט-אפ מוכן לערבב</td>
			<td>27.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים</td>
			<td>מלא ל- 31 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה משלימה 1: מתכוני חוצץ. 
טבלה משלימה 2: ספירמן ופירסון מדגימים מתאמים עבור 6 התורמים וכל סוג תא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/Supplementary_Table_2.xlsx">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

מאמר זה מתאר פרוטוקול ChIP-Seq בעל קנה מידה זעיר של אזורי DNA הקשורים לשינוי histone ספציפי (H3K27ac) באמצעות פלטפורמת מטפל בנוזל ChIP, ואחריו הכנת ספריה באמצעות tagmentation. ההליך כולל הערכת בקרה למטרות איכות וכמות וניתן לאמץ אותו לשינויי histone אחרים או גורמי תמלול.

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies

Research

JoVE Journal

Biology

3.2K Views.  La Jolla Institute for Immunology. מאמר זה מתאר פרוטוקול ChIP-Seq בעל קנה מידה זעיר של אזורי DNA הקשורים לשינוי histone ספציפי (H3K27ac) באמצעות פלטפורמת מטפל בנוזל ChIP, ואחריו הכנת ספריה באמצעות tagmentation. ההליך כולל הערכת בקרה למטרות איכות וכמות וניתן לאמץ אותו לשינויי histone אחרים או גורמי תמלול.

Video: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

אוטומציה של ניסויי שבב seq כדי ליצור פרופילים אפיגנטיים על 10,000 תאים הלה

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...