This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT &#8211; A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.

<ol>
	<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).</li><li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biology. 14, 124 (2013).</li><li>Farias-Hesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+library+preparation+for+high-throughput+DNA+sequencing+platforms.">Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms.</a> Journal of Biomedicin., &amp; Biotechnology. 2010, (2010).</li><li>Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AG-NGS:+a+powerful+and+user-friendly+computing+application+for+the+semi-automated+preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+open+liquid+handling+platforms.">AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms.</a> BioTechniques. 56, 28-35 (2014).</li><li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data.">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25, 1952-1958 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li></ol>

The authors of this article, at the time of its writing, are employed by Diagenode S.A. and Diagenode, Inc., the manufacturer of the automated system described.

immunoprecipitation הכרומטין ואחריו רצף הוא כעת הליך סטנדרטי. הנה פרוטוקול שבב seq אוטומטי שיכול ליצור פרופילים אפיגנטיים הכרומטין עם כמה כמו 10,000 תאים של חומר מוצא מוצג. אוטומציה של מבחני שבב והכנת הספרייה מאפשרת תקנון הליך שבב הייעול והפחתת שונות ניסיוני. מערכת הטיפול הנוזלית המוצגת כאן מבטלת רב של התהליכים ידניים הקשורים לשבב הפחתת הידיים בזמן לדקות רק 30, ממזערת אובדן מדגם, ומאפשרת שבב seq מדויק עם רק כמה picograms של קלט ספרייה. על מנת להשיג ניסויי שבב seq אוטומטיים מוצלחים, הוא גם חיוני לשימוש הכנות באיכות גבוהה טעון הכרומטין ונוגדני כיתה שבב seq בכל ניסוי המערכת משתמשת בטכנולוגיה מבוססת חרוז מגנטית ומציע גמישות לשנות פרמטרים ניסיוניים כגון דגירה זמן למעייל הנוגדןing וצעדי immunoprecipitation או שינוי של תנאי הכביסה מאפשרים לחוקר לנהל את כל הניסויים הנחוצים לאופטימיזציה שבב seq. המערכת האוטומטית היא פלטפורמה &quot;פתוחה&quot; שמאפשרת גם השוואה של חומרים כימיים מרובים במקביל לאופטימיזציה של תנאי ניסוי עבור כל קו תא בודד ונוגדנים ומאפשרת השוואה ישירה מסוגים שונים וריכוזים של הכרומטין, נוגדנים שונים וסוגים שונים של אפילו מגנטי חרוזים. אחת המגבלות של המערכת האוטומטית הוא הצורך של הפיכה כל הפרוטוקולים בכמויות שנעות בין 5 μl 200 μl. עם זאת, המזעור של הניסויים בפלטפורמה אוטומטי זה גם מאפשר חיסכון בעלויות בחומרים כימיים. בנוסף לפרוטוקולים שתוארו במחקר זה, המערכת ניתנת להתאמה וגם לאוטומטי מגוון רחב של יישומי חרוז מגנטי אחרים המבוססים כגון immunoprecipitationnd לכידתו של DNA מפוגל (טכנולוגיות MeDIP וMethylCap), immunoprecipitation של DNA hydroxylmethylated (hMEDIP), immunoprecipitation רציפה הכרומטין (ReChIP), immunoprecipitation RNA (RNA-IP), המרת bisulfite, ומבחני טיהור DNA.

ככל שטכנולוגיות של הדור הבא הרצף (NGS) הפכו נפוצות ונגישה יותר, השיטה העיקרית למיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA כעת הכרומטין immunoprecipitation אחרי גילוי NGS (שבב seq), המאפשר הגילוי של גורם שעתוק אתרי קישור או דפוסים של שינויי היסטון. שבב seq יש יתרון במתן נתונים תפוקה גבוהה של הגנום כולו שיכול לשמש לניתוח כמותי ואיכותי של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי המדידה של שברי DNA המועשר. עם זאת, יש כמה חסרונות בניסויי שבב seq סטנדרטיים כגון הקושי בהשגת מספיק חומר כדי ליצור ספריית רצף. ניסויי שבב מחולקים לשישה שלבים בסיסיים כוללים אזורים מחייבים 1) החלבון-DNA crosslinking 2 הכנת מדגם) הכוללת תמוגה תא וגז הכרומטין ידי sonication, 3) היווצרות immunocomplexes,4) משקעים של immunocomplexes, 5) שטיפת immunocomplexes, ו -6) elution של חומר המועשר וניתוח על ידי qPCR וNGS. ההצלחה של assay שבב תלויה בשלושה גורמים עיקריים: הכנה טובה הכרומטין, כמות האנטיגן במדגם המקורי, ואת הספציפיות וזיקה של הנוגדן לאנטיגן המקור שלה. מגבלה העיקרית היא הדרישה לכמויות גבוהות של החל מספרים סלולריים על מנת לקבל DNA מספיק מועשר כדי ליצור ספריית רצף. למדענים שעובדים עם כמויות מדגם מוגבלות, כגון דגימות ביופסיה או תת-אוכלוסיות תאים, ניסויי שבב seq מאוד מאתגרים. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי ניתן לבצע מבחני שבב seq כאשר עובדים עם כמות נמוכה של תאי 1, 2. Diagenode פיתח מערכת טיפול נוזל רובוטית שיכולה להפוך באופן מלא ניסויי שבב seq כאשר מתחילים עם מספר מצומצם של תאים. אוטומציה מספקתיתרונות רבים על פני הכנה ידנית של דגימות שבב seq כפי שמפחית טעויות אנוש, מפחיתים שונות, ומצמצם את עלות ניסוי. פרוטוקולים חצי אוטומטי לimmunoprecipitation הכרומטין והכנת ספרייה כבר דיווחו אבל אף אחד ממחקרים אלה הראה נתונים בעת שימוש במספרים נמוכים תא 3, 4, 5, 6. במאמר זה זרימת עבודה אוטומטית מלאה מתוארת בשני מבחני immunoprecipitation והכנת ספריית הכרומטין במערכת טיפול נוזל רובוטית שמשתמשת בטכנולוגיה מבוססת חרוז מגנטי ושיכולים לתת מענה למספר רב של פרמטרים באופטימיזציה הפרוטוקול. כאן, ניסויי שבב seq אוטומטיים בוצעו בהצלחה במספר מצומצם של תאים במטרה לפשט, תקנון, ומתן פתרון אמין ללמוד פרופילים אפיגנטיים באוכלוסיות תאים קטנות. פרוטוקול השבב האוטומטי המתואר במאמר זה כבר מותאם בתאי הלה באמצעות נוגדני היסטון ספציפיים וחומרים כימיים בut זרימת העבודה יכולה להיות מותאם לקווים אחרים תא ונוגדנים עם מקביל ניסיונית אופטימיזציה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:333px;">Product Description</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:367px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Formaldehyde 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">1,25M Glycine Solution</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Shearing Buffer iS1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protease Inhibitors Mix (200x)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer tL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP Buffer tC1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ideal ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagneode</td>
			<td>C01010051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP-Buffer H</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td>Component of the Auto Histone ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto Histone ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto True Micro ChIP kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K79me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15310068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K27me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me2 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K36me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Rabbit IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protein-A coated paramagnetic beads</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto IPure</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroChIP DiaPure columns</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>DMMLD2D100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quant-IT dsDNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroPlex Library Preparation Kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C05010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Library prep Quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">IP-Star Compact&#160; Automated System</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B03000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Qubit system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Hiseq systems</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating chip-seq experiments to generate epigenetic profiles on 10,000 hela cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

אופטימיזציה של ניסויי שבב seq אוטומטיים לשמונה סמני היסטון שונים על מנת לפתח בהצלחה ולאמת את הפרוטוקולים האוטומטיים שבב, נוגדני כיתה שבב seq שאומתו בעבר בניסויי שבב Seq ידניים (מידע לא מוצג) נבחרו. נוגדני הכיתה שבב seq הבאים נבחרו למחקר זה: אנטי-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 ו-H3K9me3. הסגוליות של כל נוגדני הכיתה שבב seq אושר בעבר על ידי כתם נקודה, מערכי פפטיד וניסויים המערביים כתם (מידע לא מוצג). ניסויי פיילוט שבב qPCR עם כמויות נוגדני הגדלת בוצעו כדי לקבוע את הרגישות של הנוגדנים (איור 3). qPCR עם לפחות שתי חיוביים ושני יעדי בקרה שליליים נותחו ופרופילים עם מוספים של חיובי על היעד שלילי גבוהים מפי חמישה מוסמכים לexper רצף<html> iments. חשוב לבצע ניסויי שבב והשבב seq עם איכות גבוהה של הכרומטין טעון. כל ניסויי השבב מוצגים בפרסום זה בוצעו באמצעות הכרומטין הטרי. אפשר גם להקפיא את התאים הקבועים ב -80 ° C ולהמשיך בהכנת הכרומטין וגז ביום אחר. עם זאת, הכרומטין הוכן מהתאים קבועים קפוא עשויים להתנהג באופן שונה מהכרומטין מוכן טרי ולכן תנאי sonication ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים עבור כל הכנת הכרומטין. כאשר עובדים עם סוגי תאים שונים, ניתן להשתמש במאגרי גז בהרכבים שונים של חומרי ניקוי (SDS). סוגי תאים כגון קווים עיקריים תא או תא גדלו בהשעיה הם תאים קשים לגזירה וידרשו מריכוזים גבוהים SDS (1%) ואילו שורות תאים כי הם קלים לגזירה כגון הלה ידרוש ריכוזים נמוכים SDS (0.1%) ב מאגרי גז. res.jpg &quot;/&gt; איור 3. אישור של נוגדני כיתה שבב באמצעות מערכת האוטומציה. השבב בוצע עם אנטי-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, נוגדני polyclonal ארנב -H3K36me3 ו-H3K9me3 על הכרומטין טעון מ 1 מיליון תאי הלה-S3 בהתאם לשינויי היסטון. פרוטוקולי שבב אוטומטיים עם כרכים עובדים 200 μl שמשו במכשיר האוטומציה לניסויי טיטרציה הנוגדן. כמויות נוגדנים של 1, 2, 5 ו -10 מיקרוגרם נבדקו לכל ניסוי שבב ו -2 מיקרוגרם IgG שימש כביקורת שלילית בכל ניסוי. מוספים להוערכו על ידי qPCR. תוצאות מוצגות כ% מקלט (הכמות היחסית של DNA immunoprecipitated לעומת הקלט DNA לאחר ניתוח qPCR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לאחר אימות וקביעת אופטימה<html> כמויות l נוגדני כיתה שבב לשימוש במערכת האוטומציה, ניסויי שבב seq אוטומטיים בוצעו על מנת ליצור פרופילי רצף עבור כל שינוי היסטון (איור 4). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" /> פרופילי שבב seq 4. היסטון איור נוצרו על ידי ניסויי שבב seq אוטומטיים. איור מציג את פרופילי שבב seq באזורים הגנומי שונים עבור H3K4me3, H3K9ac וH3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3, וH3K36me3. 4A מציג את התפלגות השיא לאורך X המלא -chromosome ו4B ההפצה באזור 75 kb המקיף את גן GAPDH. 4C מראה את הפרופילים של H3K27me3, H3K36me3 וH3K4me3 באזור 500 kb המקיף את גן MYT1 ו4D מציג את התפלגות H3K9me3 בZNF12 סביב 200 kb אזור.&quot;Target =&quot; large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. פרופילים אפיגנטיים היסטון לשישה שינויי היסטון שונים הקשורים לביטוי גנים נוצרו (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 וH3K36me3). איור 4 א מציג פרופילי שבב seq לאורך X כרומוזום לסמני היסטון השונים. מתאם השיא מאוד נצפה בין 6 פרופילי היסטון השונים מציין את היכולות של מערכת אוטומטית להפיק נתונים מדויקים ואמינים. איור 4, 4C ו4D להראות ההפצה של פסגות לשינויים היסטון שונים באזורים הגנומי ספציפיים. ניסויי immunoprecipitation הכרומטין אוטומטיים עד 200 תאים הסכום המינימאלי של תאים שיכולים לשמש בניסויי שבב תלוי באיכות של הכרומטין, specificity ורגישות של הנוגדן והשפע של שינוי היסטון או החלבון למד. בחירת נוגדני כיתה שבב seq טובים היא חשובה בעת עבודה עם כמויות מוגבלות של מדגם והבחירה של חומרים כימיים אופטימליים וספקים שונים משפר את היעילות של התאוששות DNA ולתרום להצלחתו של ניסוי השבב. כדי לקבוע את הסכום המינימאלי של תאים שפרוטוקול השבב האוטומטי יכול לעבד, כמויות שונות של הכרומטין, נוגדן, וחרוזים מגנטיים נבדקו במערכת האוטומטית IP-Star באמצעות ריאגנטים שבב מותאמים במיוחד לעבודה עם כמויות נמוכות של הכרומטין. ראשית, הכרומטין מ10,000 תאים היה sonicated כפי שתואר בפרוטוקול. תוצאות השבב אושרו על ידי qPCR (איור 5 א) שמראה העשרה משמעותית עם נוגדן H3K4me3 באזורי שליטה חיוביים ואות זניחה באזורי שליטה שליליים. לשם השוואה והוכחה של עקביות, additionaנתונים l הושגו עם H3K27ac, H3K9me3, ונוגדני H3K27me3, באמצעות 10,000 תאים מסופקים. ניסויי שבב אוטומטיים בוצעו לאחר מכן כדי להדגים את היכולות של המערכת האוטומטית לעבודה עם כמויות נמוכות של תאים תוך שימוש באותו הנוגדן H3K4me3. השבב האוטומטי מבוצע היטב, הפגין על ידי סדרה של עשר תגובות IP שהיו לשחזור ולהשוות מאוד עם תוצאות מדריך לשבב (איור 5). ניסויים ידניים ואוטומטיים בוצעו ויתרונות של הפרוטוקולים האוטומטיים נראו בהפחתת ניסוי לניסוי שונות (איור 5 ג). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" /> איור 5. אופטימיזציה של ניסויי שבב והשבב אוטומטי על 10,000 תאי ניסויי שבב ידניים בוצעו על 10,000 תאים ובאמצעות 0.25 מיקרוגרם של H3K4me3, 0.1 מיקרוגרם של H3K27ac, 0.5 מיקרוגרם של H3K9me3 ו -0.25 מיקרוגרם של נוגדני H3K27me3. כמויות זהות של IgG הארנב שמשו כביקורת. QPCR בוצע עם פריימרים לשני לוקוסים חיוביים ושני לוקוסים שליליים עבור כל assay שבב. איור 5 א &#39;מציג את ההתאוששות, מבוטאת באחוזים של קלט (הכמות היחסית של DNA immunoprecipitated לעומת הקלט DNA לאחר ניתוח qPCR). איור 5 מופעים 10 תגובות שבב לרוץ על IP-הכוכבים קומפקטיים באמצעות 0.25 מיקרוגרם נוגדן polyclonal H3K4me3 ו 0.25 מיקרוגרם של IgG ארנב נוגדני שליטה שליליים. לאחר מכן ניתוח qPCR בוצע עם פריימרים לאמרגן החיובי EIF4A2 הלוקוסים וGAPDH TSS וexon2 מיוגלובין לוקוסים השלילי וSat2. איור מציג את ההתאוששות, כאחוז מהקלט (כמות היחסית של DNA immunoprecipitated לעומת הקלט DNA לאחר ניתוח qPCR). איור 5 ג מציג נתונים H3K4me3 שבב של 10 ניסויי שבב ידניים בהשוואה ל -10 ניסויי שבב אוטומטיים. ברים שגיאה מייצגים s<html> סטיות tandard של כל אחד מעשר חזרות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> על מנת להבין את הרגישות של פרוטוקולי שבב האוטומטיים, ניסויים בוצעו באמצעות כמות התאים שנעו בין 100,000 עד 200 תאים לכל IP. הנוגדן אנטי H3K27me3 שימש כזה הוא שינוי היסטון נפוץ מאוד. השימוש בנוגדני היסטון או אי-היסטון אחרים עשויים לדרוש יותר או פחות תאים, בהתאם לשפע של epitope והאיכות של הנוגדן. הניסויים אומתו על ידי PCR כמותי וזה היה ציין כי על ידי הפחתת כמויות של חרוזים ורקע נוגדנים בניסויים מצטמצם ומאפשרים תוצאות שבב qPCR מוצלחות עם קטן כמו 200 תאי נוגדנים (איור 6). Iles / ftp_upload / 52,150 / 52150fig6highres.jpg &quot;/&gt; איור 6. אוטומטי מבחני שבב על 200 תאים. תאי הלה-S3 ונוגדן מכוון נגד H3K27me3. הכרומטין היה טעון בין 1 מיליון תאים ודילולי סדרתי של הכרומטין זה (100,000 עד 200 שווה ערך תא) שמשו לכל תגובת שבב. 1 מיקרוגרם של H3K27me3 ו -10 μl של מצופה חרוזים מגנטיים חלבון שימש בניסוי 100,000 תאים, 0.5 מיקרוגרם של H3K27me3 ו -10 μl של חרוזים על 10,000 ו1,000 תאים, ו0.25 מיקרוגרם של H3K27me3 ו -5 μl של חרוזים עם 500 ו -200 תאים. 1 מיקרוגרם ו -0.5 מיקרוגרם של IgG של הארנב שמשו כנוגדן שליטה שלילי בעת ביצוע ניסויים עם 100,000 תאים ו1,000 תאי בהתאמה. 6A מציג את התפוסה של גני TSH2B וGAPDH ב% מעל הקלט. 6B תערוכות התפוסה היחסית של TSH2B לעומת שליטת GAPDH שלילית אזור גנומי. ניתוח במורד הזרם של תוצאות שבב seq על10,000 תאים על מנת להעריך את האיכות הגלובלית של ניסויי שבב seq האוטומטי עם מספרי המוצא נמוכים של תאים, אוטומטי מבחני שבב seq בוצעו עם 0.25 מיקרוגרם של נוגדן H3K4me3 על 10,000 תאי הלה וניסויים שבב על 100,000 תאי הלה-S3 שמשו כביקורת חיובית לניסוי. הספריות האוטומטיות הוכנו באמצעות ריאגנטים ערכת הכנת ספריית MicroPlex מותאמים לספריות מוכנות עם כמויות DNA נמוכות. שימו לב שלמרות שניתן לבצע שבב ניסויים אוטומטיים מוצלחים עם פחות מ -10,000 תאים, הכמויות של DNA הוריד לא תהיינה מספיק כדי להכין את הספריות באמצעות ריאגנטים הערכה. דור ורצף אשכול בוצעו על פי הוראות היצרן. ביואינפורמטיקה ניתוחים לאחר התוצאות יוצאות דופן תכנית רצף מדגימות שבב מספר התא הנמוכה. בסיס נתוני 30 pg (המקביל ל -10,000 תאים של חומר מוצא<html> ) מכיל רעשי רקע נמוכים ופסגות העשרה אמינות ביותר אשר אושר על ידי שניהם במערך 300 pg (המקביל ל 100,000 תאים של חומר מוצא) ובסיס נתוני H3K4me3 שנוצרו על ידי המכון ברוד לפרויקט ENCODE ששימש כהתייחסות חיצונית. חשוב לציין את נתוני Top 40 חפיפה היחס, שמתייחס לשיטה סטנדרטית המשמשת בפרויקט ENCODE 11 שבשבב seq נחשב לשחזור אם השוואה בין שני מערכי נתונים יש לפחות 80% חפיפה של 40% הטובים ביותר של הפסגות דורגו על ידי ציון משמעות. בסיס נתוני 30 pg ממלא קריטריונים אלה בהשוואה לשתי בסיס נתוני 300 pg (שוקל את כל הפסגות שלה, ולא רק 40% הטובים ביותר) והנתונים רחבים המכון (טבלת 1). בסיס הנתונים של 300 pg מראה פסגות כמעט זהות לנתונים רחבים מכון עם יחס 98% Top 40 חפיפה (איור 7). ighres.jpg &quot;/&gt; איור 7. מבחני שבב ודור ספרייה על 10,000 תאי ניסויי שבב seq נוצרו על 10,000 ו100,000 תאי הלה-S3 באמצעות נוגדן H3K4me3 (0.25 מיקרוגרם / μl). התגים נ&quot;ב 35 מופו להגנום האנושי עם aligner Eland. בתקופת השיא שלאחר מכן קורא SICER יכול לזהות באופן אמין מוספים ממספרים סלולריים נמוכים, כמו גם ממיליוני תאים. מערכי נתונים נותחו ולעומת אחד עם השני ולנתוני ההתייחסות שנוצרו על ידי המכון ברוד. דגימות התאים נמוכות עולות בקנה אחד ויש לי גבוה מאוד דמיון. מדגם 30 pg ממלא את 11 קריטריונים (קידוד דקות. 80% של 40% העליונים של הפסגות צריכים חפיפה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" /> טבלת 1. </strong&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells at JoVE.com

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

אוטומציה של ניסויי שבב seq כדי ליצור פרופילים אפיגנטיים על 10,000 תאים הלה

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

automating-chip-seq-experiments-to-generate-epigenetic-profiles-on

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  Diagenode S.A.. Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Video: Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...