The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

הערה: כל נהלי איסוף דם מתוארים בשיטה זו נערכו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי המועצה לביקורת המוסדית UNT (IRB) לבני אדם. כל הנבדקים נתנו הסכמה בכתב לאיסוף דם, אשר היה בשימוש בשיטה הנוכחית כדי להבטיח שהם היו בריאים לכאורה, של משקל גוף תקין, וללא מחלה. 1. מגיב מקור והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש CD66b-APC (# G10F5 שיבוט; DF = 1: 50) וCD45-APCeFluor780 (שיבוט # 2D1; DF = 1: 50) עבור assay זה. הערה: לפני המחקר, נוגדני CD45 וCD66b היו titered כדי לקבוע את הדילול האופטימלי שגרנולוציטים בבירור נפתרו (+ CD45 + / 66b) מכדוריות דם לבנות אחרים (CD45 + / 66b-) 11. על התוספת של הנוגדן המדולל למכתימים את הדילול הסופי בצינור היה 875. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ולהפשיר מניית S. aureus bioparticles שכותרתו עם צבע אדום pHrodo. להשעות בריכוז של 1 מ &#39;גרם של bioparticles לכל מיליליטר ב PBS סטרילי. bioparticles לדלל aliquot וחנות קפוא ב -20 ° C עד בשימוש assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dihydroethidium (DHE), אשר מומר ברומיד ethidium ניאון בנוכחותם של רדיקלים חופשיים של חמצן (כלומר, פרץ חמצוני), בDMSO לריכוז סופי של 10 g / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים N-ethylmaleimide (המשמש למניעת phagocytosis נוסף הבא משך הדגירה assay צוין) עם PBS סטרילי בדילול 2 צעד של 200 מ&quot;ג / מיליליטר ו -17.5 מ&quot;ג / מיליליטר בהתאמה. בassay, להשתמש ריכוז סופי של 15 מ&quot;מ. כאשר מפשיר N-ethylmaleimide, להשתמש גוש חום 37 מעלות צלזיוס, כמו N-ethylmaleimide לא יישאר בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב הקיבוע הסופי, להשתמש 7AAD להכתים DNA הגרעיני. לפני בנוסף, לדלל 7AAD מניית 1:10 עם PBS סטרילי. </li></ol> אוסף דוגמאות 2. דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאל נושאים להגיע למעבדה הבאה O / N (&gt; 8hr) המהיר וabstentiמפעילות גופנית (&gt; 12 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניקוי העור עם כרית הכנת אלכוהול, להכניס מחט סטרילית איסוף דם לוריד זרוע היקפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם לתוך צינורות פונו כי הם מלאים באופן מסחרי עם הפרין סודיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף, להחיל תחבושת דבק לזרועו של הנושא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך צינורות דם לערבב 10 פעמים ולאחר מכן למקם על כיסא נדנדה עד לניתוח. </li></ol> טכניקת 3. phagocytosis Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> bioparticles ההפשרה S.aureus (RT), DHE (RT), ו- N-ethylmaleimide (37 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 L של bioparticles S.aureus 4 1.2 מיליליטר צינורות בודדים בעת שעבדה בשכונה סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 L של DHE לכל צינור המכיל את bioparticles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את הצינורות על משטח הספסל כדי לאסוף את חומרים כימיים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של כל דם מעורב 100 L על צינור אחד שכבר מלא בbioparticles וDHE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">נגב את הקצה הפנימי של הצינורות עם המוליך כותנה שקצהו כדי להסיר כל דם מזהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הדם וחומרים כימיים עם pipet אלקטרוני להגדיר לערבב את הדם וחומרים כימיים לשלושה מחזורים לאחר תוספת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות assay בדלי קרח ולכסות כדי להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות assay 10, 20, ו -40 דקות. התחל עם צינור 40-דקות כדי להבטיח את כל צינורות assay לסיים באותו הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה N-ethylmaleimide באמבטיה חרוז 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 15 L של N-ethylmaleimide (שתואר לעיל ב1.4) לתוך צינור אחד assay, דגירה במשך 30 דקות-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 10 L של CD66b-APC ו -10 L של CD45-APCeFluor780 נוגדנים מדוללים (שתוארו לעיל בסעיף 1.1), דגירה של 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 750 L של תיקון פתרון lyse / RBC WBC לתוך צינור אחד assay, דגירה של 60-דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (10 דקות ב 400 XG) צינורות assay כדי לאסוף את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לשאוב את פתרון lyse WBC / תיקון RBC, עוזב fl שיירנפח uid (100 ליטר) מעל התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 10 L של פתרון המדולל 7AAD (שתואר לעיל ב 1.5) ו -50 ליטר של PBS לתוך צינור אחד assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של חרוזים כיול (~ 25 L) על צינור אחד assay, כובעי מקום בצינורות assay, צינורות לעטוף בנייר כסף, ומכניס למקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צינור המדגם לתוך הזרם מבוסס תמונת cytometer ולאסוף מינימום של 3,000 אירועי granulocyte באמצעות פרמטרים שהוגדרו מראש: autosampler, הכחול (ננומטר 488; 60 mW), אדום (640 ננומטר; 100 NW), SSC (ננומטר 785; 8.5 לייזרי mW) (איור 1). </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> איור 1. רכישת שיטה ותבנית. דוגמאות נרכשו על זרימה מבוססת תמונה cytometer (). במהלך רכישה, מגרשי נקודה של יחס ממדים מואר שדה לעומת CD66b-APC נוצרו לגרנולוציטים הופרדו מחרוזי כיול ממוסמר using INSPIRE v. 100.2.292.0 תוכנה (B). מינימום של 5,000 גרנולוציטים נרכש עבור כל דגימות באמצעות autosampler, כחולה (488 ננומטר; 60 mW), אדום (640 ננומטר; 100 NW), SSC (785 ננומטר; 8.5 mW) לייזרים. אנא שים לב כי מספר היסטוגרמות נמצא במהלך הרכישה לפקח הגדרות לייזר והיבטים אחרים של נתונים לאסוף. כל היסטוגרמות אלה הם אופציונליים ונחוצים רק אם נהלי עבודה במעבדה מחייבים אותם כבקרת איכות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 4. לדוגמא רכישה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באשף פיצוי תוכנה האוטומטי של תוכנת הרעיונות ליישם מטריצת פיצויים לקבצי גלם תמונה (RIF) וליצור לפצות קבצי הדמיה (CIF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון קבצי CIF בודדים בתוכנת רעיונות וליצור החלקות הבאות כדי לזהות את תת granulocyte: </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת שערים ראשוניים לזהות תאים שנחשבו להיות בפוקוס באמצעות היסטוגרמה לRMS הבהיר שיפוע שדה (איור 2 א). לקבוע זאת עבור כל דגימת מטופל באמצעות שליטת unstimulated כסטנדרט התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במגרשים משניים לתאי גופייה נפרדים מפסולת וכפילויות באמצעות עלילת נקודה של יחס בהיר היבט שדה (יחס בין גובה תא לעומת רוחב) לעומת אזור שדה הבהיר (איור 2). לקבוע זאת עבור כל דגימת מטופל באמצעות שליטת unstimulated כסטנדרט התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאוכלוסייה נקייה של תאים שזוהתה, להקים עלילת נקודה של CD45 לעומת CD66b (איור 2 ג) כדי לזהות באופן חיובי גרנולוציטים (+ CD45 + / 66b). צור עלילת בת (איור 3) בעוצמה פירוט בהירה לS. aureus (ציר x) לעומת עוצמת פירוט בהירה לפרץ חמצוני (DHE, ציר y) לזהות תת קבוצות של גרנולוציטים הופעלו. לאסוף brתמונות שדה ight בערוץ 1 ו -9, bioparticles בערוץ 2, בערוץ 4 DHE, 7AAD בערוץ 5, CD66b בערוץ 11, וCD45 בערוץ 12. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> איור 2. ניתוח תבנית. נתון זה הסדרה של מגרשים שנוצרו כדי לזהות תאים שהיו בפוקוס (), תאים בודדים (B), גרנולוציטים (C). חלקות נוספות המשמשות לזיהוי שלוש תת קבוצות של גרנולוציטים הופעלו נגד גרנולוציטים לא פעילים. כל הניתוח של קבצי תמונה שנרכשו הושלם באמצעות תוכנת v.6 רעיונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes.">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li><li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response.">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li><li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li><li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li><li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-year+school-based+diet/exercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children.">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status.">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li><li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate-intensity,+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults.">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li><li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise:+implications+for+infection+risk.">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative.">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li><li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li><li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li><li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis:+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections.">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li><li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro.">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay.">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold/Flu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise.">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה הנוכחית מייצגת עידון של שיטות קיימות להערכת תפקוד granulocyte באמצעות זרימת cytometry 1,3,4,12-14. השלבים הקריטיים של assay זה נוטים להיות קשור לערבוב נכון של דגימת הדם עם bioparticles וDHE. ערבוב שלם יביא לתוצאות לא מדויקות. בעוד ערבוב מלא הוא קריטי, שיטת הערבוב צריכה להיות עדינה בטבע. הוא הציע כי הערבוב להתבצע באמצעות pipet אלקטרוני עם פונקצית ערבוב ולא מיקסר מערבולת. עוד צעד קריטי בassay הוא תמיד כדי להבטיח שאין דם מזהם את חיצו העליון של צינור assay. דם שיורית זו ניתן להסיר באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי. הסרה מלאה היא חשובה משום שכישלון לעשות זאת עלולה לזהם את הכנת assay הסופית עם תאי דם אדום-lysed un. לפני השימוש בשיטה זו בקרות פיצוי הולמות יש להוסיף לשלוט על spחפיפה בין ectral חומרים כימיים המשמשים לזיהוי ההיבטים השונים של תפקוד granulocyte. לשיטה זו, בקרות פיצוי כרוכות לאסוף דגימות דם שהוצעו הדגירה assay 40 דקות ולאחר מכן תיוג עם סמן יחיד (כלומר, E. coli, DHE, וכו &#39;). לאחר תיוג, אירועים חיוביים יחידים נאספים ומטריצת פיצוי מופקת באמצעות אשף אוטומטי בתוכנת ניתוח רעיונות. זה קריטי, כי אם נעשה שימוש assay זה, בקרות פיצוי הולמות הושלמו כדי להבטיח ביצועי assay נכונים. ניתוח מתבצע באמצעות אשפי מאתר התכונה ושיתוף לוקליזציה לזהות שעוצמת פירוט בהירה היא משתנה הטוב ביותר להפריד בין האוכלוסיות וגם לזהות כמה חפיפה קיימת בין פרץ חמצוני ואותות phagocytosis. באופן ספציפי, השימוש בcytometry מבוסס תמונה סיפק את היכולת להפריד גרנולוציטים הופעלו לשלוש תת קבוצות. Tפירוט משנו נקבע באמצעות עוצמת פירוט בהירה של phagocytosis לעומת פרץ חמצוני. בנוסף לבחינת פונקציות תא היחידה אלה, תאים שהציגו שני אירועים באותו הזמן באותו מיקום האנטומי (שיתוף לוקליזציה) זוהו. גרנולוציטים שנפלו לקבוצת המשנה &quot;גבוה-האקטיבי&quot; היו פנוטיפ היחיד שהפגין שיתוף לוקליזציה עקבית בין phagocytosis ופרץ חמצוני. זיהוי זה של תת granulocyte מופעל הוא האזור הגדול ביותר שבו יש צורך בפתרון בעיות. זה מאוד חשוב עבור משתמש חדש כדי לקחת את הזמן כדי להבין את זרימת העבודה תהליך הדגימה ברעיונות ולהבין את המכניקה של gating אוכלוסיות תאים באמצעות רכיב ההדמיה. שינויים אחרים שהמשתמש יכול לנסות ולהפוך כוללים מבחר של פעמים דגירה assay חלופיות או נוספות. השיטה הנוכחית מצביעה על השימוש בתקופות של 10-40 דקות; עם זאת, בהתאם לדגם הניסיוני שבה שיטה זו היאכדי לשמש, זה עשוי להיות נחוץ כדי לבחור משכי assay עוד. כגון שינוי היית צריך להיות מוערך על בסיס פרטני. עוד נקבע כי משך הדגירה assay יש השפעה משמעותית על המראה של שלוש תת קבוצות הופעלו. הגישה המתוארת בדוח זה מייצגת הארכת איזה מידע ניתן להשיג בעבר לגבי תפקוד granulocyte 3,4,13,15. מעבדות אחרות לא הוכיחו את החשיבות של הערכת שינויים בתפקוד granulocyte כחלק מהערכה מקיפה של חסינות ומחלות 15-17. למרות הפוטנציאל של assay זה זה לא בלי מגבלות. אחת המגבלות העיקריות הוא דרישת עלות וזמן הקשורים גבוה מדגם עיבוד תפוקה. כאשר עיצוב מחקר דורש מספר רב של דגימות ביום נתון, אלה יכולים להיות קשים לעיבוד. עיבוד הוא יעיל על ידי השימוש במכשירים אלקטרוני וpipets,אבל אלה נוטים להיות יקרים ולא בהכרח זמינים בכל מעבדה. האזור שלנו של מחקר מתמקד במחקר של כמה פעילות גופנית והרגלי תזונה משפיעים על בריאות מערכת חיסונית ולתפקד 6,8-10,18-20. יש יעדים כגון השלכות מעשיות משמעותיות עבור מגוון רחב של תחומי בריאות אדם. מעבר ללימוד השפעות הפעילות הגופנית ולתזונה בשיטת phagocytosis הפגינה בכתב יד זה יכול להיות שימושית בתחומים אחרים של אימונולוגיה קלינית בי הניטור של תפקוד phagocytosis הוא קריטי לתוצאות טיפול. Assay הנוכחי הוא הראשון מני רבים שמבחנים אימונולוגיים עם הפוטנציאל להיות מחדש שהומצאו על ידי לקיחת יתרונות של מידע ההדמיה הייחודי שיכול להיות יכול מזרימה מבוססת תמונה cytometer.

גרנולוציטים מייצגים רכיב אחד של המערכת החיסונית של הגוף המולדת, אשר מספקת את קו הגנה הראשון נגד אנטיגנים פולשים. שיטות קודמות להערכת תפקוד granulocyte התמקדו בקיבולת phagocytosis או פרץ חמצוני בשיטות נפרדות, ולכן קשה לקבוע באופן קולקטיבי איך גרנולוציטים השתנו 1-4. התקדמות בתחום הזרימה cytometry הביאו בייצור של מכשירים המעבדתיים מסוגלים ברזולוציה גבוהה, הדמיה צבע רב של תאים באופן תפוקה גבוהה 5. היכולת לשלב הדמיה עם זרימה מסורתית cytometry מייצגת התקדמות שמספקת את הפלטפורמה הטכנולוגית הדרושה כדי לחדש בתוך זרימה הקיימת cytometry שיטות ולחלץ מידע חדש על המערכת החיסונית. במהלך עשר השנים האחרונות, המעבדה שלנו, בין יתר, התמקדה בחריפות על ההשפעה של patte התזונתי וטיפולי מימוש השוניםRNS על תפקוד מערכת חיסון מולדים 6-9. יש השיטה הוכיחה בכתב היד הזה השלכות מעשיות בתחום האימונולוגיה קלינית. השיטה הנוכחית ממנפת את הכח של הזרימה cytometry מבוסס תמונה למדוד phagocytosis של חלקיקי חיידקים ופרץ חמצוני בו זמנית. שימוש בגישה זו, אחד הוא מסוגלת להפריד גרנולוציטים מופעלים באמצעות משתנים הניתנים על ידי החלק מבוסס דמותו של הניתוח. תת אלה היו רק זיהוי לאחר הערכת התמונות הסלולריות על גרנולוציטים הבודדים. זמן הדגירה assay נוסף השפיע על המעבר בין תת הפעלת שלוש 10. לכן, זה מתקבל על הדעת ששימוש במספר רבה של פעמים דגירה עשוי לאפשר שיטה לבחון את השינוי בתפקוד granulocyte הבא טיפול ניסיון ספציפי. המטרה של כתב היד הזה הייתה להדגים שיטה של ​​פונקצית granulocyte הערכה באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה למדוד phagocytosis עם oxidat בו זמניתive פרץ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacutainers</td>
			<td style="width:125px;">BD Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">WBC Fixative / RBC Lysis solution</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">00-5333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD66b-APC</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone G10F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45-APCeFluor780</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone 2D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">s.aureus bioparticles</td>
			<td style="width:125px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dihydroethidium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-ethylmalemide</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7AAD</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:125px;">Mindray</td>
			<td style="width:119px;">BC-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-channel pipet</td>
			<td style="width:125px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">ViaFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead Bath Incubator</td>
			<td style="width:125px;">LabArmour</td>
			<td style="width:119px;">BeadBath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis FlowSight</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis INSPIRE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IDEAS Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis IDEAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">X-Pierce Piercable Plate Sealer</td>
			<td style="width:125px;">Excel Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X-Pierce</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dell Precision Workstation</td>
			<td style="width:125px;">Dell Computers</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>Used for IDEAS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה אפשר לנו להפריד בין אוכלוסייה הומוגנית של גרנולוציטים הופעלו לשלוש תת קבוצות שונות הפעלה (איור 3). בשיטה זו, הדרך היעילה ביותר לפתור את שלוש תת קבוצות ההפעלה היא על ידי התוויית עוצמת פירוט בהיר לphagocytosis (S. aureus) לעומת פרץ חמצוני (DHE) (איור 3; איור 4). כמו כן, שימוש באשף שיתוף הלוקליזציה בתוכנת רעיונות יאפשר לכימות של הנוכחות של phagocytosis בו זמנית ופרץ חמצוני, וזה סימן היכר של גרנולוציטים הופעלו מאוד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> זיהוי איור 3. של תת granulocyte הופעל. לאחר זיהוי של גרנולוציטים באמצעות סמנים על פני קרום תא (+ CD45 + / 66b), עלילת בת נוצרה עם inten פירוט הבהירsity לphagocytosis לעומת עוצמת פירוט בהירה לפרץ חמצוני. שימוש בגישה זו, אחוז לא פעיל (סגול), נמוך-אקטיבי (אדום,), מתון-אקטיבי (כחולה, B), וגרנולוציטים גבוהים פעילים (צהובים, C) נקבעו. טכניקת gating זה היה בשימוש גם על מנת להעריך את ההשפעה של זמן הדגירה assay בשפע היחסי של תת granulocyte הופעל השונים. האחוז הגבוה ביותר של גרנולוציטים &quot;גבוהים-אקטיביים&quot; היה נוכח הבא הדגירה 40 דקות. כל הניתוח של קבצי תמונה שנרכשו הושלם באמצעות תוכנת v.6 רעיונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בנוסף הוכחת הנוכחות של שלוש תת קבוצות שונות של גרנולוציטים הופעלו, זה היה הראה כי זמן הדגירה assay השפיע השפע היחסי של כל תת-קבוצה גרנולוציטים הופעלה. באופן ספציפי, inc 40 דקותubation הביא את האחוז הגדול ביותר של גרנולוציטים &quot;גבוהים-אקטיביים&quot;. על ידי ובם לפחות שלושה משכי דגירה assay זה עשוי להיות אפשרי כדי לקבוע כיצד טיפול קליני ניתנו משנה את מצב ההפעלה הזמני של גרנולוציטים. זוהי השיטה הראשונה שפורסמה באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה לזהות תת granulocyte הופעל שונים כפונקציה של מדידות בו זמנית של phagocytosis ופרץ חמצוני. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> איור 4. נציגי תמונות של סמנים תאיים. גלריית תמונות של תאים שסווגו כגבוה פעיל (), מתון-אקטיבי (B), ונמוך-אקטיבי (C) מוצגות בנתון זה. Bioparticles S.aureus נמצאות בCh03 , פרץ חמצוני הוא בCh04, 7AAD לגרעין הוא בCh05, פיזור הצד הוא בCh06, CD66b הוא בCh11, וCD45 הוא בCh12. כמו כן, תמונת מיזוג-מקומי שיתוף של phagocytosis (Ch03) לעומת פרץ חמצוני (Ch04) מוצגת. תחומי צהובים בתמונה המיזוג לציין כי פרץ phagocytosis והחמצונים מתרחשים באותו המקום האנטומי באותו הזמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro at JoVE.com

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte<em&gt; במבחנה</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

image-based-flow-cytometry-technique-to-evaluate-changes-granulocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.3K Views.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Video: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...