Name: 3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

אנו מודים למעבדת הקושי הזה כולו לדיונים מועילים. אנו מודים לפטי Jansma ואוניברסיטת אריזונה Neuroscience המחלקה לייעוץ ועזרתי בהדמיה. אנו מודים גם למעבדה Porreca לשימוש Vibratome. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (NIH NS065116, AAK).

הערה: עכברים גדלו ומתוחזק במבוקר חדר טמפרטורה ולחות עם 12 שעות התהפכו מחזורי אור / חושך עם אוכל וכרצונך מודעה זמין מים באוניברסיטת אריזונה. ניסויים נערכו בהתאם להנחיות ואישור ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת אריזונה. כל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. עכברי Cre-הכתב הם על C57BL / 6 רקע 11 והם זמינים באופן מסחרי. 1. זיהום עכבר הערה: השיטה של זיהום עכבר עם gondii Toxoplasma המתואר להלן נעשתה שימוש במחקרים שפורסמו בעבר 10 - 12. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זני Toxoplasma בבני עורלת fibroblasts (HFFs) בתרבית הגבוה גלוקוז השתנה Dulbecco נשרים בינוניים (DMEM) בתוספת 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר streptomycin, ו- L-גלוטמין 2 מ&quot;מ (cDMEM) בבקבוק T-25 בתוך 5% CO 2 באינקובטור עד טפילים יצרו vacuoles parasitophorous הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפילי מזרק-שחרור על ידי גירוד תאים מהחלק התחתון של הבקבוק ועובר פתרון שהתקבל באמצעות מחט 25 מד מחוברת למזרק 3 מיליליטר 2 פעמים בתוך הבקבוק ולאחר מכן להעביר את כל הפתרון למקרה מזרק 5 מ&quot;ל מחובר למחט 27 מד ש הושם במהופך בתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. חבר את בוכנת המזרק ולהעביר את הפתרון הטפיל לתוך צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור במשך 10 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant אז resuspend גלולה בpH 4-6 הכיתה USP מיליליטר סטרילי 1x בופר פוספט (PBS) 7.4 (פתרון במלאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון hemocytometer עם 10 μl של פתרון מניות, לחכות 5-10 דקות לטפילים להתיישב אז לספור את מספר הטפילים בארבעת ריבועי פינה ומרכז הכיכר הגדולה באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל paraאתרים לגודל הבידוד מתאים של 100K / 200 μl 1X PBS אז להזריק עכברי intraperitoneally (IP) בהיקף כולל של 200 μl. הערה: להליך זה, עכברים מחוסן עם 100K סוג III (CEP) 13 tachyzoites ב200 μl 1x PBS. כאשר מדביקים עכברים עם זנים אחרים של Toxoplasma, ריכוז של הבידוד ייתכן שיצטרך להיות מותאם לדין וחשבון על רמת האלימות. </li></ol> 2. זלוף וקציר המוח הערה: פרוטוקול זה נערך על 21 ימים לאחר פגיעה (dpi) כמו זה מייצג את נקודת הזמן שבו מספרי שיא של ציסטות נמצאים במוח העכבר, אך ניתן להשתמש בי נקודות זמן אחרות. גודל, מספר, מיקום, ונוכחות או עדר של ציסטות תלויות בגורמים רבים, כולל זן עכבר, סוג זן טפיל, כמו גם גודל הבידוד 7,14 - 17. חוקרים יצטרכו לקבוע את הבידוד המתאים לעכבר וToxoplas בנפרדמתח ma הוא / היא משתמשת. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הכלים ההתקנה הניתוחיים קצירה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל עכבר, להכין ולשמור על קרח: מזרק 20ml מלא בשיעור של 0.9% נתרן כלוריד (NaCl) + 10 U / ml הפרין בכיתה USP סטרילי 1X PBS (הפרין / מלוח); מזרק 20 מיליליטר מלא עם 4% Paraformaldehyde (PFA); בקבוקון נצנץ עם 15 מיליליטר PFA 4%. לעכברים מרובים, להכין כוס מלאה את כל הסכום של כל פתרון נחוץ לכל העכברים אז לצייר את מזרק טרי מלא של פתרון לכל זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את ip העכבר עם 200 μl / 25 גרם ממשקל הגוף של קוקטייל / Xylazine קטמין (24 מ&quot;ג / מיליליטר &amp; 4.8 מ&quot;ג / בהתאמה מ&quot;ל) ביום של עניין. לפקח על העכבר לרמה של הרדמה על ידי בדיקת רפלקס קמצוץ הבוהן. תמשיך עם פרוטוקול רק פעם אחת על העכבר לא מראה תגובה לקמצוץ הבוהן חברה. הערה: שיטות אחרות של הרדמה עשויה לשמש עוד כרמה המתאימה של הרדמה הוא הגיעה לפנישתמשיך עם הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמת הקצף המכוסה. הצמד את כל ארבעת הגפיים החוצה בכפות הרגליים ולאחר מכן לרסס את החזה והבטן עם אתנול 70% (EtOH) (איור 2 א). תוספת של כמה מגבות נייר סטרילי שמתחת לעכבר יכולה לשמש כדי לסייע בספיגת עודפי נוזלי זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור מעלית ממש מתחת לעצם החזה עם מלקחיים ולאחר מכן להשתמש במספריים לעשות חתך. משוך עור לאחור כדי לחשוף את החזה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם xiphoid תהליך ולהפוך את חתך בבטן ממש מתחת לסרעפת, חושף את הכבד שגזור בצורה בוטה מהסרעפת. לעשות שני חתכים, אחד בצד שמאל ואחד בצד ימין דרך הסרעפת והחלק התחתון של הצלעות. להאריך את החתכים מהשמאל ומימין דרך 1 / 2-2 / 3 כ עד בית החזה, אשר לאחר מכן בא לידי הביטוי בחזרה כדי לפתוח את בית החזה (איור 2 ג). הערה: טיפול קח לא לחתוך כל איברים או כלי דם גדולים duלצלצל בהליך זה ככך יתפשר על איכות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse transcardially עם 10-20 מיליליטר הפרין / מלוח ואחרי 10-20 מיליליטר PFA 4%. הערה: אם זלוף נעשה כראוי, הכבד יהפוך מאדום להשתזף (איור 2 ד). אם לא נעשה כראוי, כלי דם יהיו (2E איור) הגלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפכתי את העכבר על הבטן שלה, רגליים מחדש פינים לאחר מכן לרסס ראש וצוואר עם 70% EtOH. הרם את העור מבסיס הצוואר ולעשות חתך. להסיר עור לחשוף את הגולגולת (איור 2F). לערוף את הראש ברמה של הכתפיים. הסר את הגולגולת, להסיר בעדינות את המוח, ולמקם אותו לתוך בקבוקון נצנץ מלא PFA 4% (איור 2G-H). הערה: אם perfused היטב, המוח יופיע לבן ללא כלי דם גלויים (איור ט 2). אם המוח אינו perfused היטב, כלי דם יהיו (י 2 איור) הגלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השביבבקבוקון tion עם מוח PFA 4% על 4 מעלות צלזיוס לילה, מכוסה מן האור. יש לשטוף את המוח שבאינו USP הכיתה 1x PBS והעברה לבקבוקון נצנץ חדש מלאים במצונן 1x PBS. אחסן את המוח ב1x PBS על 4 מעלות צלזיוס, מכוסה מהאור. הערה: ניקוי והדמיה מוצלחים הושגה עם קטעים מאוחסנים ב1x PBS לעד חודש אבל עדיף סעיף המוח תוך כמה ימים כאחסון ממושך בPBS יהיה להפוך את קיבעון PFA ועלול להוביל לפחות מאופטימליות תמונות . Autofluorescence ולטשטש עלה כבר ציינו בכמה סעיפים צילמו לאחר האחסון ב1x PBS במשך חודש אחד או יותר. </li></ol> 3. מוח חתך <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח מ1x PBS ולמקם אותו לתוך מטריצת מוח (איור 3 א), כדי לאפשר למדויק יותר ואף חוצה את המוח. חתוך את נורות המוח הקטן וחוש ריח, אם קיימים, ולאחר מכן לחתוך את המוח coronally לתוך 2 או 3 חלקים. <br /&gt; הערה: זמירה וחיתוך של המוח ניתן לעשות זאת ללא סיוע של מטריצת מוח. בשימוש מספר החלקים לחתוך coronally יהיה תלוי במרחק החיתוך של Vibratome. המוח יכול להיות מחולק בכל אורינטציה, אם כי חלקי sagittal ו העטרה הם נפוצים ביותר לזיהוי neuroanatomical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק כל חלק במוח על בלוק דגימת הרכבה עם cyanoacrylate. להדביק בלוק קטן של 5% ג&#39;ל agarose מאחורי סעיף המוח לתמיכה (איור 3). הערה: ניתן להשתמש במנגנוני תמיכה אחרים, אבל ללא תמיכה, Vibratome עשויה לדחוף במוח גורם לחתך לא אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך רקמה לתוך 160 מיקרומטר (מרחק עבודה של המטרה המשמשת להדמיה) חלקים עבים עם Vibratome להגדיר למהירות של 4 והמשרעת של 9. הערה: ההגדרות למהירות ומשרעת עשויות להיות מותאמות בהתאם למכונה המסוימת בשימוש על מנת להשיג אפילו, חלקים חלקים. אם ההגדרותלא נכון, התוצאה יכולה להיות חלקים לא אחידים, קריעה של רקמה או סימני פטפוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חלקי רקמות לתוך בקבוקון נצנץ מלא טרי, המצונן 1x PBS אם הם הולכים להיות מסומנות בתוך שבוע אחד. אם חלקים לא הולכים להיות מסומנות בתוך שבוע אחד, סעיפי מקום לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge מלא פתרון cryopreservative ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol> 4. סליקה אופטית של סעיפים רקמת מוח הערה: פרוטוקול זה שונה משיטה שפורסמה בעבר 8. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 25%, 50%, 75% ו 90% גליצרול כרך / כרך ב 1x PBS Tween-20 + 2% (Gl / PBST). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר חלקים מ1x PBS או, אם בcryopreservative, לשטוף ב1x PBS ולהעביר לבקבוקון נצנץ המכיל 10 מיליליטר של 25% Gl / PBST. בקבוקון מקום על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס, מכוסה מחשיפה לאור, לשעה 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכל החלקים שקעו לbottom של הבקבוקון. לשאוב 25% Gl / PBST, והשאיר רק מספיק כדי לכסות את החלקים ולאחר מכן למלא את הבקבוקון עם 10 מיליליטר 50% Gl / PBST ומקום על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס, מכוסים מחשיפה לאור, לשעה 12. חזור על תהליך זה עבור 75% Gl / PBST אז 90% Gl / PBST. השאר חלקים ב -90% Gl / PBST למשך 24 שעות כדי להגיע לסליקה מקסימלי. במהלך תהליך הסליקה, להתבונן סליקה הדרגתית אופטית (איור 4). הערה: תהליך זה עשוי להיות מזורז אם פתרונות משתנים מייד לאחר הסעיפים שקעו לתחתית של הבקבוקון. בפתרונות של 75% ו- 90%, סעיפים לא ישקעו כל הדרך עד לתחתית של הבקבוקון אבל יצופו באמצע. </li></ol> 5. סעיפים רקמות הרכבה מוח <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך coverslip 1.5 מס &#39;ל -5 חלקים כדי ליצור spacer. השתמש בעיפרון שליט ושקצו יהלום להבקיע ולשבור את coverslip לאורך הקווים מקווקווים שמוצגים באיור 5 א. בטל tהוא מרכז חתיכה, לסדר את 4 חתיכות חיצוניות בשקופית זכוכית רגיל כדי ליצור חלון, ולאחר מכן לצחצח ברור לק על התפרים לדבוק החתיכות של spacer לשקופית בתצורה הנכונה (איור 5). הערה: spacer ישמש ליצור את המרחב הדרוש בין השקופיות וcoverslip להרכבת החלקים פינו. Coverslip ניתן לחתוך בדרכים שונות כדי ליצור כל גודל חלון הכרחי. מפרידי קצף חתוכים מראש זמינים גם מבחינה מסחרית. כדי לאפשר ללק להתייבש לחלוטין, דרך טובה ביותר הוא לעשות שקופיות עם מפרידי לפחות יום אחד לפני סעיפי הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לשקופית באמצעות pipet העברת פלסטיק עם הקצה מנותקים. הקפד למלא בסביבה עם 90% Gl / PBST. בזהירות להוריד coverslip על החלקים כדי לוודא שלא להציג את כל בועות. עודף Gl / PBST עלול להיות רשע משם עם לנגב ונטול מוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GFP תמונה + נוירונים המכילים RFP + <em&gt; ציסטות Toxoplasma gondii עם מיקרוסקופ confocal מייד (7 א-B איור) ולאחר מכן שקופיות חנות שטוחה ומכוסות מהאור ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: לחלופין, חותם מחליק לחלוטין סביב כל הקצוות כדי לאחסן וצלמו במועד מאוחר יותר. שימוש בלק ברור לאטום שקופיות הוא אופציונאלי ועשוי להפוך אותו קשה יותר להסיר coverslip אם אחד היה כדי להסיר חלקים מהשקופית במועד מאוחר יותר לעיבוד נוסף. </li></ol> 6. הדמיה הערה: כל מיקרוסקופ ניתן להשתמש שביש את יכולת קבלת Z- ערימות ברזולוציה גבוהה. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בתחילה למצוא את מישור המוקד ב10X, לשנות למטרת 20X ולסרוק באמצעות הסעיף לזהות ציסטה ממוקמת בתוך GFP + תא. מרכז את האזור של העניין (ROI) בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות למטרת 40X. פוקוס למעלה ולמטה דרך כל ROI לוודא שכל התא וCYרח &#39;גלוי. הערה: תמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת הנפט דסק&quot;ש M27 40X / 1.30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת ההדמיה המותקנת, להשיג Z- מחסנית הכוללת את כל התא עם ציסטה. הגדרות ממוצעת בשימוש כדי להשיג תמונות מוצגות באיור 6. הערה: הגדרות ייתכן שתצטרכנה להיות מותאמות בהתאם לכל סעיפי רקמות חוקרים ויכולות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבל תמונת הקרנה המרבית של Z- המחסנית על ידי קביעת מספר התחזיות ל1. השג מבט סיבוב מלא על ידי קביעת מספר התחזיות ל -64. הערה: חבילות תוכנה אחרות זמינות וניתן להשתמש כדי להשיג הקרנה המרבית, סיבוב, כמו גם דעות אחרות של Z- מחסנית תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התמונה עם תוכנת ניתוח הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats.">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice.">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li><li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii:+a+histological,+immunocytochemical+and+ultrastructural+study.">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li><li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain:+A+Confocal+Study.">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li><li>Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices.">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions.">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li><li>Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites.">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li><li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host.">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li><li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice.">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

בהתחשב בכך ששינויים תאיים בתאי מארח נגועים נקשרו לתוצאות מחלה בזיהומים עם אורגניזמים תאיים אחרים כגון HIV, כלבת, וכלמידיה 18,19, שפיתחנו טכניקה שתאפשר לנו ללמוד את יחסי הגומלין האינטימיים המתרחשים בין מערכת העצבים המרכזית לארח תא וToxoplasma. השיטה המתוארת כאן מש?...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג ברזולוציה גבוהה, תמונות תלת ממדיות של נוירונים בודדים שנדבקו בטפיל תאיים לחייב Toxoplasma gondii. Toxoplasma נחשב לאחד מהטפילים המצליחים ביותר לעתים קרובות בגלל מגוון הגדול שלה ביניים מארח, הכולל בני אדם ומכרסמים. בשני בני אדם ומכרסמים, לאחר זיהום חריף בבליעה של מזון או מים מזוהמים, Toxoplasma הוא מסוגל לגרום לזיהום מתמשך של מערכת העצבים המרכזית על ידי המרה מצורתו מהירה משכפלת (tachyzoite) לאיטי המשכפל וencysting טופס (bradyzoite ). אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים, הוא חשב זיהום במערכת העצבים המרכזית סמוי זה להיות יחסית ללא תסמינים, אבל אצל אנשים מדוכאי חיסון כגון חולי איידס או מושתלים, התפרצות מחודשת של הטפיל עלולה לגרום לדלקת קרום מוח toxoplasmic הקטלנית 1,2. בנוסף, מחקרים שנעשה לאחרונה חההוכיח כי זיהום סמוי עם Toxoplasma יכול להוביל לשינויים התנהגותיים במכרסמים 3,4, אם כי המנגנון אינו ידוע. באופן מפתיע, למרות נתונים אלה מדגישים את החשיבות של האינטראקציה CNS- Toxoplasma, קטן יחסית ידוע על הקשר הזה, במיוחד ברמה התאית ומולקולרית. היכולת ללמוד היבטים אפילו פשוטים של האינטראקציה המוח-טפיל כבר הקשתה בחלקו על ידי מגבלות טכנולוגיות. לדוגמא, רוב העבודה שהראה כי תאי עצב הם התאים שבי ציסטות להתמיד נעשתה עם מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) 5,6. למרות EM נותן ברזולוציה גבוהה, שזה זמן רב, עבודה אינטנסיבית, ויקר. לאחרונה Immunofluorescence מבחני (IF) היו בשימוש בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal כדי לאשר את העבודה שנעשתה על ידי 7 EM. אם מבחני הם קלים מבחינה טכנית לבצע וזולים יחסית, אך תוך שימוש בטכניקות אלה לאחורייםtand הקשר המרחבי בין ציסטה ונוירון הנגוע דורש שיקום סדרתי, שזה זמן רב, קשה מבחינה טכנית, ועלול להוביל לאובדן של מידע בעל ערך. לפיכך, פיתחנו שיטה שיכול לשמש עם מודל העכבר של טוקסופלזמוזיס CNS ומאפשרת לנו תמונת השלמות של תאי עצב נגועים ללא EM או אימונוהיסטוכימיה (IHC). על ידי פיתוח טכניקה כזו, אנחנו יכולים להתחיל לחקור את מערכת היחסים בין סלולארי התא הנגוע וציסטה באופן מהיר יחסית ולא יקר. השיטה שפיתחנו משלבת טכניקות חדשות לסליקה אופטית וחלקים במוח עבים הדמיה על ידי מיקרוסקופ confocal 8 עם מערכת שמסמנת בתאי vivo שכבר הזריקו עם חלבוני טפיל 9,10. במערכת זו, אנו להדביק עכברי Cre-כתב שמבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רק לאחר Cre בתיווך רקומבינציה 11 עם Toxoplasma </em&gt; זנים המבטאים חלבון אדום פלורסנט (RFP) ולהזריק recombinase Cre לתאי מארח 9. שילוב זה מאפשר לנו לקצור את מוח העכבר הנגוע לאחר הדבקת CNS הוקמה, לחתוך חלקים במוח עבים, ולזהות במהירות אזורים רלוונטיים לתמונה על ידי מציאת RFP + ציסטות. חשוב לציין כי כביטוי תא המארח של GFP תלוי אך ורק בהזרקה של Cre על ידי טפילים, ולא על זיהום, מספר תאי GFP + אינם מכיל טפילי 10. כמטרה של פרוטוקול זה היא להיות מסוגל נוירונים נגועים תמונה כולה, הדגש הוא רק על GFP + תאי עצב שמכיל גם RFP + ציסטה, אלא גם את הפרוטוקול יכול לשמש לתמונת GFP + / RFP - נוירונים. ברגע שהמוח הנגוע שנקטפו ומחולק, הקטעים ניתנים על ידי שקופים סליקת גליצרול. אזורים מתאימים סעיפים לאחר מכן צילמו עם מיקרוסקופ confocal, אלהדמיה חסרת תקדים געיית תאי מארח נגועים וטפילי ביצת הקיימא בשלמותם. כאן אנו מספקים פרוטוקול מלא לזיהוי, סליקה אופטית, ונוירונים הדמיה נגועה.

<table><tbody><tr><td>Vibratome Series 1000 Sectioning System</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>Other vibratomes are compatible</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;reg; Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&amp;reg; Injection Xylazine 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>7906</td><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Surgical equipment</td><td></td><td></td><td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td><td></td><td></td><td>These are primary cells from human foreskins.&amp;nbsp; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Canted neck flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Disposable Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>This product is purchased from an in-house stockroom.&amp;nbsp; Other companies are compatible.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td></td><td></td><td>Other brands are compatible</td></tr><tr><td>10 ml Syringe with Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Other syringes are compatible</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>25 G x 12&quot; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>Other brands are compatible</td></tr></tbody></table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii הוא טפיל לחייב, תאית עם מגוון רחב מארח, כולל בני אדם ומכרסמים. בשני בני האדם ומכרסמים, Toxoplasma קובע זיהום מתמשך לכל החיים במוח. בעוד זיהום מוח זה הוא ללא תסמינים ברוב האנשים עם מערכת חיסון, בעובר המתפתח או אנשים מדוכאי חיסון כגון תסמונת כשל חיסוני נרכשת חולים (איידס), נטייה זו ולהתמדה במוח יכול להוביל למחלות נוירולוגיות הרסניות. לפיכך, ברור כי האינטראקציה Toxoplasma המוחין היא קריטית למחלה סימפטומטית המיוצרת על ידי Toxoplasma, עדיין יש לנו מעט הבנה של האינטראקציה הסלולרית או מולקולרית בין התאים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) וטפיל. במודל העכבר של מערכת העצבים המרכזית טוקסופלזמוזיס זה כבר ידוע במשך 30 שנים שהנוירונים הם התאים שבו הטפיל נמשך, אך מעט מידע זמין על שחלק מתא העצב בדרך כלל נגוע (סומה, דנדריט, אקסון) ואם מערכת יחסים סלולריים זה משתנה בין זנים. בחלקו, חוסר זה הוא משניים לקושי של הדמיה חזותי נוירונים נגועים כולו מבעלי חיים. תמונות כאלה בדרך כלל ידרשו חתך ותפרים של רקמה צילמה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים או confocal לאחר immunostaining סדרתי. על ידי שילוב של מספר טכניקות, השיטה המתוארת כאן מאפשרת השימוש בחלקים עבים (160 מיקרומטר) כדי לזהות ותאי תמונה שלמה המכילים ציסטות, המאפשר הדמיה וניתוח של נוירונים בודדים, נגועים כרוני תלת-ממדיים ללא הצורך בimmunostaining, מיקרוסקופיה אלקטרונית , או חתך סידורי ותפרים. שימוש בטכניקה זו, אנו יכולים להתחיל להבין את הקשר בין סלולארי הטפיל ונוירון הנגוע.

איור 7 כולל תמונות מייצגות של שני GFP + תאי עצב משני 160 מיקרומטר חלקים שונים עבים, כמו גם מדידת נציג של המרחק מציסטה אל התא-גוף לאיור 7. איורים המכיל ציסטה 7 ו- B להמחיש שזה חדש פרוטוקול מאפשר להדמיה של תא העצב הנגוע בשלמותו. איור 7C ?...

Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

השימוש בפרוטוקול זה, הצלחנו חלקים במוח העבה מיקרומטר 160 תמונה מעכברים נגועים בטפיל טוקסופלזמה גונדי, המאפשר הדמיה וניתוח של היחסים מרחביים בין טפיל encysting ונוירון הנגוע.

הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים<em&gt; In vivo</em&gt; עם<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K Views.  University of Arizona.  השימוש בפרוטוקול זה, הצלחנו חלקים במוח העבה מיקרומטר 160 תמונה מעכברים נגועים בטפיל טוקסופלזמה גונדי, המאפשר הדמיה וניתוח של היחסים מרחביים בין טפיל encysting ונוירון הנגוע. 

Video: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Immunology and Infection

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is an obligate intracellular parasite with a diverse biology that infects several mammalian species, including humans, causing cardiac and digestive pathologies. Reliable detection of T. cruzi in vivo infections has long been needed to understand Chagas disease&#39;s complex biology and accurately evaluate the outcome of treatment regimens. The current protocol demonstrates an integrated pipeline for automated quantification of T. cruzi-infected cells in 3D-reconstructed, cleared organs. Light-sheet fluorescent microscopy allows for accurately visualizing and quantifying of actively proliferating and dormant T. cruzi parasites and immune effector cells in whole organs or tissues. Also, the CUBIC-HistoVision pipeline to obtain uniform labeling of cleared organs with antibodies and nuclear stains was successfully adopted. Tissue clearing coupled with 3D immunostaining provides an unbiased approach to comprehensively evaluate drug treatment protocols, improve the understanding of the cellular organization of T. cruzi-infected tissues, and is expected to advance discoveries related to anti-T. cruzi immune responses, tissue damage, and repair in Chagas disease.

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

The present protocol describes light-sheet fluorescent microscopy and automated software-assisted methods to visualize and precisely quantify proliferating and dormant Trypanosoma cruzi parasites and T cells in intact, cleared organs and tissues. These techniques provide a reliable way to evaluate treatment outcomes and offer new insights into parasite-host interactions.

הדמיה תלת-ממדית כמותית של תאים נגועים בטריפנוסומה קרוזי, אמסטיגוטים רדומים ותאי T באיברים מבהירים שלמים

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>שיטות הדמיה ומיון תאים של בעלי חיים חיים לחקירת ניוון עצבי במודל נמק אקסיטוטוקסי של C. elegans

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

שיטות הדמיה ומיון תאים של בעלי חיים חיים לחקירת ניוון עצבי במודל נמק אקסיטוטוקסי של C. elegans

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

הדמיה תלת-ממדית כמותית של תאים נגועים בטריפנוסומה קרוזי, אמסטיגוטים רדומים ותאי T באיברים מבהירים שלמים

שיטות הדמיה ומיון תאים של בעלי חיים חיים לחקירת ניוון עצבי במודל נמק אקסיטוטוקסי של C. elegans

שיטות הדמיה ומיון תאים של בעלי חיים חיים לחקירת ניוון עצבי במודל נמק אקסיטוטוקסי של C. elegans

שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה