DRW è sostenuto da sovvenzioni NIH AI089972 e AI113217, e dalla mucosa Immunologia Studi della squadra, e in possesso di un Premio alla Carriera per medici scienziati del Wellcome Fondo Burroughs.

NOTA: Tutti gli esperimenti descritti erano in conformità con le Istituzionale Cura e uso Comitato Animal (IACUC) le linee guida e approvato dal Hospital Children Research animali (ARCH), Boston, Mass. 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> 1,000x IL-4 Stock: Diluire citochina IL-4 a 20 pg / ml in H 2 O o 0,1% di siero albumina bovina (BSA). Distribuire in 200 aliquote microlitri provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C. </li><li> 1,000x anti-CD40: ottenere dal produttore a 1,0 mg / ml, conservare a 4 ° C. </li><li> B stimolazione cellulare multimediale: per 425 ml di terreno RPMI-1640, aggiungere 75 ml di siero di vitello fetale appena scongelati (FCS), 10 ml di 1,0 M tampone HEPES, 5 ml di L-glutammina magazzino, 5 ml penicillina: streptomicina magazzino, 5 ml essenziali media non essenziali Aminoacidi microlitri minimi (MEM-NEAA), e 3,5 di 2-mercaptoetanolo. Tenere i supporti a 4 ° C per un massimo di una settimana. Aggiungere IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 mcg / ml) immediatamente prima dell&#39;usosolo il volume di supporti necessari. </li><li> 2% FCS-FACS Buffer: Aggiungi 10 ml di FCS a 490 ml di 1x PBS. Conservare a 4 ° C. </li><li> 2x soluzione tripsina-EDTA: Diluire 5 ml di soluzione di 10x tripsina-EDTA magazzino (5,0 g tripsina, EDTA 2,0 g per litro) in 20 ml di PBS 1x. Conservare tripsina-EDTA in 2x aliquote di lavoro a 4 ° C. Lasciar riscaldare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Siero fetale di vitello: Mantenere FCS scongelati a 4 ° C per un massimo di due settimane. Mettere in ghiaccio 15 minuti prima che la procedura di colorazione citoplasmatica. </li><li> Neutral-buffered formalina: Preparare una soluzione di formalina al 10% (3,7% paraformaldeide). Formalina è tossica e quindi gestirlo sotto una cappa di laboratorio mentre indossa appropriate DPI. Conservare formalina a temperatura ambiente in un armadietto di immagazzinaggio chimico. </li><li> Metanolo: Conservare metanolo assoluto (100%) a -20 ° C finché le cellule sono pronte per essere permeabilizzate. Si noti che il metanolo è infiammabile e deve essere conservato in un freezer adeguato. </li></ol> 2.Purificazione e attivazione delle cellule B <ol><li> Da una milza del mouse appena raccolte, preparare una sospensione di cellule singole premendo delicatamente l&#39;organo attraverso un colino cella di 70 micron con lo stantuffo di una siringa da 3 ml. In una provetta da centrifuga da 15 ml conica, raccogliere le cellule in 10 ml di PBS 1x e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di globuli rossi Lysing Buffer per 5 min. Neutralizzare con 13,5 ml di 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> (Opzionale) magneticamente separare le cellule B e che utilizzano anti-CD45R (B220) -labeled perline, seguendo il protocollo di purificazione MACS secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Stimolare le cellule B purificate a 1,0 x 10 6 cellule / ml in scaldato mezzi stimolazione delle cellule B contenente IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 mcg / ml) per 5 giorni a 37 ° C. Iniziare con 8 ml di coltura divisi in 2 pozzetti di una piastra di coltura da 6 pozzetti (4 ml). </li><li> Controllare culturi giornaliero di mantenere a 1,0 x 10 6 cellule / ml. Regolare la concentrazione suddividendo in altri pozzi e diluendo la cultura dei media con la stimolazione delle cellule B contenente IL-4 freschi e anti-CD40. </li></ol> 3. tripsinizzazione, Fissazione e permeabilizzazione <ol><li> Tripsinizzazione <ol><li> Raccogliere fino a 1.0 x 10 7 cellule coltivate in una provetta conica da 15 ml, centrifugare a 300 xg per 5 min, e decantare il surnatante. </li><li> Lavare con 10 ml di PBS per rimuovere la proteina residua dal supporto di raccolta delle cellule. Ripetere la fase di centrifugazione e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule nel volume residuo dopo decantazione (circa 100 ml). </li><li> Aggiungere con cautela 800 ml di temperatura ambiente 0,1% (2x) tripsina-EDTA alle cellule. Versare lentamente con un angolo di 45 ° lungo la parete del tubo conico. </li><li> Chiudere la provetta e miscelare delicatamente inclinando il tubo in modo che il liquido corre lungo la lunghezza del tubo di tempo 5-6s. A filante, precipitato bianco potrebbe formarsi nella soluzione. Limitare il tempo tripsinizzazione di sotto di un min. </li><li> Placare la reazione tripsinizzazione con 1 ml di FCS freddo. Diluire il FCS immediatamente aggiungendo 10 ml di PBS freddo. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C, poi decantare il supernatante e restituire i tubi in ghiaccio. </li></ol></li><li> Fissazione <ol><li> Risospendere le cellule nel volume residuo dopo decantazione. Se necessario, portare il volume fino a 100 ml con PBS freddo. </li><li> In una cappa aspirante, aggiungere 800 ml di soluzione di formalina tamponata neutra al 10% per le cellule e pipettare su e giù. Il tubo scalderà seguito all&#39;aggiunta di formalina. Incubare a 37 ° C per 10 min. </li></ol></li><li> Permeabilization <ol><li> Impostare un mixer da banco vortex ad una velocità di agitazione delicata. </li><li> Disegna 9 ml di freddo (-20 ° C), metanolo in un 10 ml pipetta sierologica. </li><li> Tenere la provetta contenente le cellule sopra il vortex e iniziare dolcemente shaking cellule. </li><li> Aggiungere metanolo freddo al tubo in modo cade a gocce sulle cellule mentre il tubo è ancora scuotendo modo che il metanolo è continuamente miscelazione. Dopo i primi 2 ml di metanolo la velocità di erogazione può essere aumentata a un flusso lento. </li><li> Lasciate che il tubo di sedersi sul ghiaccio per 30 minuti per completare la permeabilizzazione. In alternativa, le cellule possono essere conservati a -20 ° C per un mese. </li></ol></li></ol> 4. fluorescenza colorazione per IgG1 e IgE di conversione <ol><li> Campione Centrifugare a 300 xg per 5 minuti e decantare la soluzione di metanolo. Un precipitato bianco può sedimentare le cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di temperatura ambiente 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 minuti per lavare le cellule. Ripetere una volta. Nota: Lavare il pellet con temperatura ambiente PBS dissolve precipitato in più che può formare dopo la fase 4.1. </li><li> Eseguire un lavaggio supplementare con 10 ml di 2% FCS-tampone FACS. </li><li> Distribuire campioni ad un 96-ben piatto rotondo fondoe centrifugare a 300 xg per 5 min. Decantare il surnatante e mettere il piatto su ghiaccio. </li><li> Stain in 60 ml di 2% di buffer FCS-FACS per bene con le seguenti diluizioni degli anticorpi: anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li> Dopo 5 min di colorazione, lavare la piastra con 150 ml di 2% FCS-tampone FACS e centrifugare per 5 min a 300 x g. </li><li> Risospendere in 400 ml di 2% di buffer FCS-FACS e pipetta attraverso una 40 micron colino cella nylon in 5 ml FACS tubo. </li></ol> 5. Utilizzare la seguente strategia Gating: <ol><li> Isolare CD45R (B220) cellule positive da parte della popolazione brillamento linfociti situato sul / plot SSC FSC (Figura 1). </li><li> Dalle cellule positive B220, utilizzare la trama IgE e IgG1 di rivelare le popolazioni corrispondenti. </li></ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination.">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li><li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk.">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. 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IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li><li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo.">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li><li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgE(+)+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways.">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li><li>He, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE++B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response.">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li><li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI.">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li></ol>

The authors have no disclosures.

La stimolazione di topo milza cellule B in coltura con anti-CD40 e IL-4 simulerà T helper di tipo 2 (T H 2) le interazioni, il passaggio di classe incoraggiante IgG1 e IgE 5. Cellule B possono essere attivate per la RSI nel contesto di splenociti totale 12 o come purificati cellule B della milza 11. Come indicato nel protocollo (passo 2.3), B arricchimento delle cellule è opzionale, ed è a discrezione dello sperimentatore per determinare se sarebbe vantaggioso. Positivo sep...

Durante immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) in topi e nell&#39;uomo, il IgH μ esoni regione costanti (Cu) vengono cancellati e sostituiti da uno dei diversi gruppi di downstream esoni regione costanti (C H s) (es Cγ, Cε e Cα), risultando in un interruttore dalla produzione di IgM alla produzione di altre classi di Ig (ad esempio IgG, IgE, o IgA). CSR avviene entro interruttore (S) le regioni, che sono 1-10 sequenze kb situati 5 &#39;per ogni set di C H 1 s. L&#39;attivazione indotta citidina deaminasi (AID) enzima avvia CSR attraverso l&#39;attività citidina deamination. IgE è un mediatore chiave della malattia allergica 2 e una maggiore comprensione di come IgE è prodotto e regolato può aprire le porte a nuovi approcci terapeutici per la malattia atopica. In topi e nell&#39;uomo, IgE è isotipo Ig più strettamente regolata. IgE è normalmente rilevato livelli migliaia di times meno di altri IgH isotipi 3, ma possono essere molto elevati negli stati di malattia 4. Tuttavia, la RSI per IgE non è completamente comprensibile. In vitro attivazione delle cellule B con IL-4 in combinazione con anti-CD40 o LPS, induce la RSI sia IgG1 e IgE 5. Cellule B attivate esprimono il recettore a bassa affinità IgE FcεRII / CD23 2,6, che lega IgE solubile secreta nella cultura dopo CSR. Perciò quando si analizzano con citometria a flusso, le cellule B con il recettore legato IgE macchia simile a B cellule che esprimono endogenamente IgE 7. Mentre è noto che il mouse B cellule esprimono il recettore a bassa affinità IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, nella nostra esperienza non sembra interferire con la misura di commutazione classe IgG1. Tuttavia, quando si misura IgE commutazione dopo l&#39;attivazione delle cellule B nella cultura, non specifica di superficie legato IgE può oscurare l&#39;analisi. Con i metodi di colorazione comuni, le cellule non-IgE-esprimono macchia positivo per IgE. Delineato qui è una strategia che è stata utilizzata per condurre test di CSR e rilevare vere cellule-IgE esprimono B da topi 9-11. Il trattamento delle cellule B attivate con tripsina, un reagente di laboratorio comune a digerire le proteine, rimuove sia cytophylic e la membrana superficiale legata IgE. Permeabilizzazione successiva e colorazione per citoplasmatica IgE rivela così le vere cellule-IgE che producono.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:301px;">Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:343px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-Mouse IgE FITC</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553415</td>
			<td>clone R35-72</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Rat Anti-Mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550083</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Falcon Cell Strainer 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Falcon Cell Strainer 70 &#181;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-4052-82</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">anti-Mouse/Rat CD40</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-0402-85</td>
			<td>clone HM40-3</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MEM-NEAA (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Phosphate Buffered Saline (10X)</td>
			<td>Lifetechnologies (Corning)</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;">MACS CD45R (B220) microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MACS purification column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">IL-4</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>214-14</td>
			<td>Reconstitute in water or 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Trypsin-EDTA Solution (10X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4174-100mL</td>
			<td>5.0g Trypsin, 2.0g EDTA&#376;4Na per Liter of 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100mL</td>
			<td>10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">2-mercaptoethanol (99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1140-17</td>
			<td>clone 1B4B1</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">HyClone Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;">B cell Stimulation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:343px;">B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,&#160; 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 &#181;g/ml), Beta-mercaptoethanol (7 &#181;L/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of true ige-expressing mouse b lineage cells

B linfociti immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) è un processo in cui inizialmente espresso IgM passa ad altri isotipi IgH, come IgA, IgE e IgG. Misurazione di IgH CSR in vitro è un metodo fondamentale per lo studio di un certo numero di processi biologici che vanno dalla ricombinazione e riparazione del DNA agli aspetti della immunologia molecolare e cellulare. Test in vitro CSR coinvolge citofluorimetrica superficie di misurazione espressione Ig sulle cellule B attivate. Mentre la misurazione di IgA e IgG sottoclassi è semplice, misurazione delle IgE con questo metodo è problematico a causa IgE solubile legame FcεRII / CD23 espresso sulla superficie delle cellule B attivate. Qui si descrive una procedura unica per la misurazione accurata delle IgE-produzione di cellule del mouse B che hanno subito la RSI nella cultura. Il metodo si basa sulla tripsina-mediata scissione di complessi IgE-CD23 sulla superficie delle cellule, consente il rilevamento di IgE-cellule produttrici B lineage da cycolorazione toplasmic. Questa procedura offre una soluzione conveniente per l&#39;analisi di citometria di flusso della RSI a IgE.

Questa procedura è stata implementata con successo per studiare la RSI a IgE in cellule del mouse B. Per dimostrare l&#39;efficienza di misura della RSI, abbiamo stimolato le cellule B della milza di topo con anti-CD40 e IL-4 come descritto in precedenza 11. Dopo cinque giorni di stimolazione, le cellule sono state raccolte ed elaborate utilizzando il protocollo sopra descritto e colorati con fluorescenza marcata IgM, IgG1, IgE, gli anticorpi e B220 (CD45R). Gated sui linfociti sabbiatura (figura 1),...

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Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K Views.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.