לאחרונה מצאנו כי תאי B רבים ב- LCK GFP זברהפיש מבטאים רמות נמוכות של GFP. פעולה זו הופכת קו זה לכלי שימושי לחקר תאי B ותאי T. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעכשיו אנחנו יכולים לחקור תאי B ותאי T מ LCK GFP זברהפיש או שאנחנו יכולים ללמוד B-ALL ותאי T-ALL מדגים עם סרטן.
שיטות אלה מאפשרות פיתוח תאי B ומחקרי B-ALL בזברה- דגי זברה. שרלוונטיים להבנת המערכת החיסונית הסתגלותית וזה ממאירות נפוצה בסרטן ילדים. אם מעולם לא עשית ניתוחים אלה לפני ייתכן שתרצה לחדד את הטכניקה שלך כמה פעמים עד שתוכל להשיג תימוס טוב דגימות מח עצם.
הדגמה חזותית תסייע לצופים לזהות פלואורים ו- B-ALL בדגים ולבחור את ההגדרות הנכונות להפלות תאי B ו- T לבידודם. לאחר הרדמה עם 0.02% Tricaine במים מערכת דגים להשתמש במסנן GFP על מיקרוסקופ epifluorescence לבחון חודשיים עד שישה חודשים זברה דגי תימי פלואורסצנטי בהיבט המדיאלי הגבי של חלל הענף. לאחר איתור התימוס במקום דגים המתת חום בצלחת פטרי ולהשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להסיר את התימין החיובי GFP.
והגדרות מיקרוסקופיה בהירה כדי לקצור את מח הכליות ואת הטחול. מניחים כל איבר שנאסף בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 500 microliters של מדיום מיון קר ולהשתמש homogenizer microtube עלה הומוגניזציה של הרקמות על הקרח. לאחר מכן, מסננים את הרקמה ההומוגנית באמצעות מסנן רשת של 35 מיקרומטר כדי ליצור השעיה של תא יחיד ולמקום את התאים על קרח.
החל מחודשיים עד ארבעה חודשים השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן rag2:hMYC LCK EGFP דגים באמצעות הגדרות חשיפה נמוכה כדי לזהות לוקמיה לימפובלסטית חריפה תא T בהיר או T-ALL והגדרות חשיפה גבוהה כדי לזהות בעלי חיים B-ALL עמום. בקרת סוג פראי ודגים טרום לויקמיים יש GFP מקומי רק התימוס. לסווג את הדגים על סמך היקף פלואורסצנטיות GFP באמצעות מערכת פשוטה שלוש קטגוריות.
דג ברמה אחת מדגים אות פלואורסצנטי כגידול תימי עם התפשטות מקומית מוגבלת בלבד. דגים ברמה 2 מדגימים אות פלואורסצנטי מעבר לתימוס המערב פחות מ-50% מהגוף. ודגים ברמה שלוש מדגימים אות פלואורסצנטי המשתרע מעבר ל-50% מהגוף.
להפריד את הדגים עם כל מאלה ללא סרטן. ולפקח על הדגים טרום לויקמי ללא גידולים חיוביים GFP פעם בחודש לפיתוח של ALL חדש. עבור T או B-ALL בידוד התא להשתמש סכין גילוח כדי להסיר את הראש ואת האזור התימי של דג ברמה המתת דם שלושה ולהנחות את הגוף בצלחת פטרי.
השתמש P-1000 פיפטה לשטוף את חלל הצפי דגים עם 500 microliters של מדיום מיון קר, איסוף התאים בינוני בצינור חמישה מיליליטר. באמצעות קצה פיפטה טרי להזריק שניים עד שלושה נוספים 200 כדי 300 כרכים microliter של מדיום מיון קר לתוך חלל הגוף ולהשתמש בקצה של פיפטה כדי להפעיל לחץ עדין על גוף הדגים כדי להבליט את התאים מתוך חלל הגוף לתוך צינור חמישה מיליליטר. לאחר מכן, מסננים את ההשעיה של התא באמצעות מסנן רשת רשת של 35 מיקרוליטר.
ולמקום את התאים על קרח עד הניתוח שלהם על ידי ציטומטריה זרימה. עבור הומוגניזציה של כל הגוף להשתמש homogenizer microtube עלה כדי homogenize את הגוף של הדג ולהוסיף 300 microliters נוספים של מדיום מיון קר לצינור. מסננים את מתלי התא באמצעות מסנן רשת רשת של 35 מיקרומטר, שוטפים את המסנן באמצעי מיון נוסף לפי הצורך עד שרק פסולת רקמה נשארת על המסנן.
לאחר מכן, מניחים את התאים על קרח עד הניתוח שלהם. לניתוח ציטומטרי זרימה של התאים המבודדים להגדיר את הפרמטרים cytometer זרימה על פי הנחיות היצרן. ולרכוש 10, 000 עד 50, 000 אירועים כדי להגדיר את פיזור קדימה ופרמטרים פיזור בצד להגדרת שערי הלימפוציטים ותאי הצאצאים ולא לכלול את הפסולת התאית.
אל תכלול את כפילויות התא ולהשתמש בשערי הלימפה ו/או מבשר כדי לקבוע את המספר והאחוז של התאים החיוביים GFP. באמצעות פיקוריתרין ואת התעצמויות GFP להגדיר שערים עבור GFP שלילי לעומת GFP נמוך לעומת תאים גבוהים GFP. לימוד היכן למקם את השערים לבודד את התאים הגבוהים GFP נמוך GFP הוא קריטי להשגת אוכלוסיות טהורות של תאי B ו- T.
שתי אוכלוסיות חיוביות GFP נפרדות, GFP נמוך B תאים ותאי GFP גבוה T ניתן להשיג מן התימוס. תאי B המתגוררים מח הכליה של דגי זברה בן שלושה חודשים להביע רמות נמוכות של GFP. תאים גבוהים GFP הם נדירים עם זאת, המציין כי רק אחוז קטן של לימפוציטים T נמצאים מח העצם בגיל שלושה חודשים.
כמו כן, דגימות טחול להראות אחוזים גבוהים יותר של GFP נמוך מאשר תאים גבוהים GFP. בדגים מהופנטים כפולים שעדיין לא פיתחו לוקמיה לימפובלסטית חריפה, ביטוי GFP בתימוס, מח העצם והטחול דומה לזה שנצפה בדגי LCK EGFP מהופנטים. עם זאת, מספר הלימפוציטים לכל איבר גדל.
ככל הנראה, בשל התפשטות מונעת MYC של אוכלוסיות תא B ו- T לא בוגרות שבהן מקדם הסמרטוטים פעיל. בדגים מהופנטים כפולים עם B ו- T-ALL שפיתחו סרטן פלואורסצנטי בשישה חודשים B-ALL הם סרטן פלואורסצנטי עמום המכיל בעיקר תאים נמוכים GFP. לעומת זאת, דגים פלואורסצנטיים בהירים יכולים לספק מחסה לאוכלוסיות T-ALL מבודדות או מעורבות של תאי B-ALL ו-GFP גבוהים של GFP.
ואכן, כפי שהוערך על ידי ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית GFP תאים נמוכים מבטאים רמות גבוהות יותר של תעתיקי תאי B. ותאי GFP גבוהים מבטאים רמות גבוהות יותר של גנים של תאי T, LCK וסמן GFP. זה קריטי ללמוד כיצד לזהות דגים עם B-ALL על ידי מיקרוסקופיה.
וכיצד להגדיר כראוי את שערי ציטומטריית הזרימה להפרדת אוכלוסיות גבוהות GFP נמוך GFP. בעקבות הליך זה, אתה יכול לבודד DNA, RNA, או חלבון מן GFP נמוך GFP תאים גבוהים GFP עבור PCR, רצף, מה יש בדם או בניסויים השתלת vivo. ברגע שלמדנו שלדגי LCK GFB יש תאי B פלואורסצנטיים בנוסף לתאי T, נוכל לחקור את שני סוגי התאים מאותה חיה כדי להעריך B ו- T-ALL.
