We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

1. קריו בעל הכנה ותחזוקה הערה: תחנת השאיבה היבשה, בהיקף של תחנת שאיבה טורבו ובקרים קרים שלב אחד או יותר, משמשת בעיקר לשלוש מטרות: א) זה הוא מקום בטוח לאחסון בעלי cryo כאשר הם לא בשימוש. הדרך הנכונה כדי לאחסן את הבעלים היא להשאיר אותם בתחנה תחת ואקום. ב) כדי להתאדות הצטברות הכפור ולחות המתרחשת כאשר החנקן הנוזלי הוא להסיר את דיואר וקצו של בעל cryo חשוף; זו מושגת עם מחזור החימום. ג) כדי להתחדש יבוש זאוליט, וכדי להשיג את ואקום גבוה בDewars cryoholder. זה הכרחי לקיום טמפרטורה קבועה כאשר עושה במיקרוסקופ האלקטרונים cryo. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור חימום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בעל cryo לאחת מיציאות השאיבה של תחנת השאיבה. להתחבר אחד צינורות הפינוי לשקע מתכת מתחת לשסתום הוואקום של בעל. הפוךבטוח שכל השסתומים בתחנה (V1, V2, וV3) ועל בעל cryo סגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את בקר השלב הקר ולחבר אותו לבעל באמצעות כבל השליטה. הפעל את מתג ההפעלה של תחנת השאיבה טורבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את אפשרות מחזור ההתחממות בבקר השלב הקר. כאשר הוואקום בתחנת השאיבה טורבו קורא 10 -3 Torr או טוב יותר, לפתוח את V2 שסתום הפרפר, לחכות עד שהאבק יתייצב, ולאחר מכן פתח את V1 שסתום פרפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחזור החם לכ -30 דקות עד שהטמפרטורה בבעל יציבה מעל C ° 20. V1 הקרוב, ולאחר מכן להפסיק את המעגל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור זאוליט. הפעל את מחזור זאוליט בין 4 שעות וO / N לפני מושב CryoEM, ופעם בשבוע אם לא בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את אפשרות מחזור זאוליט ובחר את הזמן הדרוש כדי להגיע לואקום טוב, בטווח של 1-2 x 10 -4 Torr, וזמן המתנה ארוך ובכך. כאשר הוואקום מגיע 10 -3Torr, פתח את שסתום פינוי דיואר, V3. אז תחנת השאיבה תפנה את הקו לבעל; לחכות עד שהאבק יתייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתום על בעל cryo. כאשר המחזור יושלם, לסגור את השסתומים בסדר ההפוך שבו הם נפתחו: השסתום על בעל, אז V3, V2, ולבסוף V1. כבה את תחנת השאיבה טורבו ובקר השלב הקר, ונתק את בעל cryo מן הבקר השלב הקר ותחנת השאיבה טורבו. </li></ol></li></ol> 2. הכנת רשת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי. הערה: בעת שימוש רשתות מחוררות מסחריות, מומלץ לנקות אותם לפני השימוש, כדי להסיר כל פולימר שייר ששימש בתהליך הייצור. לעשות את זה בצלחת פטרי מזכוכית עם 5 שכבות של נייר סינון הניחו בתחתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרשתות על נייר הסינון עם צד פחמן המחורר פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, להרטיב את הנייר עם כמה טיפות oכלורופורם f סביב הרשתות עד שהם פשוט להתחיל צפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת פטרי עם המכסה פתוח מעט בN / O מנדף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: תמיכת פחמן הדק (שלבים 2.2-2.3) ניתן להשמיט כשכבת הקרח יכולה להיווצר ישירות מול החורים הקטנים בפחמן הרשת המחוררת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה, לדבוק פיסה נציץ לחשוף שני משטחים חדשים. מניחים את המשטחים החשופים החדשים של פנים כלפי מעלה נציץ על פיסת נייר לבנה בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי בצנצנת הפעמון של מאייד פחמן. התחל רצף המשאבה למטה עד ואקום הוא מתחת ל -2 x 10 -6 Torr. להתאדות כל זיהומים על פני השטח של מוט פחמן, לבצע מראש אידוי עם צלחת פטרי המכוסה. לאחר מכן ישודר צנצנת הפעמון והסיר את הכיסוי מצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את רצף המשאבה למטה עד הוואקום הוא מתחת ל -10 -6 ומעיל Torr נציץ בשכבה דקה (~ 5 ננומטר) של פחמן. השתמש במשקפי מגן במהלך פחמןאידוי. לפקח על העובי של סרט פחמן על ידי החושך וכתוצאה מכך על הנייר שהונח מתחת לסדינים נציץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פחמן הדק לרשת TEM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי פיסת נציץ מצופה 0.5 x 1 סנטימטר ולרחף מעל פחמן על גבי המשטח השטוח של מים מסוננים דה המיונן,. השתמש בנייר עדשה אופטי כדי לקבל פני מים שטוחים. באמצעות פינצטה, לשים בצד פחמן המחוררת של הרשת במגע עם פני השטח העליונים של שכבת פחמן צף ולהרים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.3.1 ו2.3.2 עד מספר מספיק של רשתות מוכנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוהר פריקה. הערה: ההפרשות זוהרת ממירה את שכבת פחמן ציפוי טבעי הידרופובי של הרשתות להידרופילי. שלב זה הוא אופציונאלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרשתות עם צד פחמן פונה כלפי מעלה בשקופית זכוכית 7.5 x 2.5 סנטימטר מכוסה Parafilm. למקם אותו לתוך התא של ציוד זוהר פריקה ולסגור את התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבהצנצנת הפעמון וזוהר פריקה למשך 20 שניות במהירות של 25 מילי-אמפר ו -7 x 10 -2 mbars. הערה: במהלך תקופה זו זוהר סגול אור הופך לגלוי. הסר את שקופיות זכוכית עם הרשתות ולהשתמש בם בתוך שעות 1, אחרת, הם יצטרכו להיות זוהר שוחרר שוב. </li></ol></li></ol> לצלול-הקפאת 3. דוגמא הערה: השתמש במשקפי מגן ונעליים מתאימות בעת שימוש במכשיר זה כדי להגן מפני כתמי חנקן ואתאן נוזליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מנגנון הקפאה-לצלול. מלא מאגר אדים עם מים מזוקקים. הגדר את הטמפרטורה הרצויה, לחות היחסית ותנאי צלילה לזמן כתם, כוח למחוק וזמן ספיחה (22 ° C, 95%, 2 שניות, 2 ו -40 שניות בדוגמא המובאת כאן). מניחים נייר סינון סופג חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר את מיכל אתאן על ידי מילוי המאגר החיצוני עם חנקן נוזלי עד יציבות מושגת (כ -10 דקות). ברגע שהחנקן הנוזלי מפסיק רתחg, מקום הקצה של הצינור המגיע ממכל אתאן בחדר הפנימי ולפתוח את השסתום באיטיות רבה. נזל אתאן בחדר הפנימי ולמלא אותו עד 1 מ&quot;מ מהחלק העליון. הימנע מהקפאת אתאן. זהירות: אתאן מאוד דליק ונפיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פינצטה בטוחה מיושרות בתוך מנגנון ההקפאה לצלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל לחות. לטעון רשת על פינצטה, ולטעון 3-5 μl של מדגם על פני השטח פחמן (צד משעמם) של הרשת המחוררת. חכה למדגם לספוג לרשת ולבצע הסופג כדי להשיג שכבת נוזל דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Flash-להקפיא את הרשת על ידי צולל אותו לאתאן הנוזלי. הסר את מכלול פינצטה-הרשת מאתאן הנוזלי מחזיק פינצטה בהתמדה, ולהעביר אותו לחדר החיצוני עם חנקן נוזלי. העבר את הרשת לתיבת רשת קטנה שקועה בחנקן הנוזלי. הקפד לשמור מדגם המזוגג בחנקן נוזלי כל הזמן בזמן העברה או מיכל האחסוןאו לבעל cryo. ניתן לאחסן קופסות רשת בדיואר חנקן נוזלי קיבולת גדולה (35-50 ליטר) במשך לפחות 1 שנה: הערה. לאחסון נוח הם יכולים להיות ממוקמים בשפופרת 50 מיליליטר פלקון עם שני חורים שנקדחו בראש וחוט דיג המחובר לכובע שלה שיכול להיות משך מפיו של דיואר. </li></ol> 4. מעבירים את קריו הרשת לTEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בעל cryo לתחנת העבודה cryo-ההעברה. הקפד שלא לפגוע בקצו של בעל במהלך החדרה. לבדוק את קיומו של סיבים קטנים ואבק על המוט וO-הטבעת של בעל cryo באמצעות זכוכית מגדלת, אם יש להסיר אותו עם נייר עדשה אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את דיואר של בעל cryo וכלי העבודה עם חנקן נוזלי. הימנע משפיכת החנקן הנוזלי על ידי שימוש במשפך הלכודים שמגיע עם תחנת העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את בעל cryo לבקר שלב הקר כדי לפקח על הטמפרטורה, ולשמור על הוספת נוזל חנקן &amp; #160; עד שהטמפרטורה מתייצבת בסביבות -194 מעלות צלזיוס. ודא שרמת החנקן הנוזלי היא מתחת לרמה של חותם הוואקום הן בכלי העבודה ודיואר בעל cryo. טרום מגניב פינצטה הרשת, טבעת קליפ והקצה הקהה של כלי טבעת קליפ בתחנת העבודה. גם טרום מגניב סט של פינצטה הגדולה ומברג בדיואר נוסף מלא עם חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להעביר את תיבת רשת cryo המכילה רשתות hydrated קפואות לחנקן הנוזלי בתחנת העבודה באמצעות פינצטה הגדולה. פתח את תיבת רשת cryo עם המברג, לקחת את רשת hydrated קפואה ולמקם אותו לתוך חריץ בעל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את טבעת קליפ על גבי הרשת ולחץ בעדינות אותו עם הקצה הקהה של כלי טבעת קליפ עד אשר תתייצב במקום. סגור את cryo-התריס. הסר את תיבת כלים וcryo רשת מתחנת העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל תחנת העבודה עם בעל ורשת לקונסולת מיקרוסקופ כדי מינימייז זמן ההעברה של הרשת באוויר חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדף את אנטי-contaminator TEM עם חנקן נוזלי, שהיה מלא בעבר והתקרר לפחות 20 דקות. Pre-להטות את הבמה מיקרוסקופ ל -60 מעלות. הערה: זה יהיה למזער אובדן של חנקן נוזלי כבעל מוכנס לתוך מנעל האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל את מחזור מנעל אוויר מראש משאבה במיקרוסקופ. ודא שהסתום לתותח האלקטרונים סגור (במיוחד אם היא TEM FEG). חכה לרצף מנעל האוויר מראש המשאבה לסיים (כ -2 דקות) לפני הכנסת בעל cryo. הערה: זה מצויינים על ידי האור האדום שבכיבו את הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בעל למנעל האוויר ולסובב אותו 90 מעלות בכיוון השעון; חבור את כבל בקר שלב הקר לבעל cryo כדי לפקח על הטמפרטורה. חכה שוב עד שהנורית האדומה היא כיבתה ולסובב שתי במה ובעל בחזרה למצב של 0 ° להכניס את בעל להיי של TEMטור ואקום GH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוודא כי הטמפרטורה לא עולה מעל -160 ° C, כדי למנוע היווצרות של גבישי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את דיואר של בעל cryo. חכה 15-45 דקות, עד שבעלה equilibrated תרמית וואקום TEM התאושש לפני הקלטת תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מבעבע של החנקן הנוזלי מזוהה, לשנות את גובה מילוי חנקן הנוזלי, או לגעת בעדינות במקור המבעבע עם מקלון צמר גפן. </li></ol> איסוף נתוני 5. במינון נמוך הערה: טכניקת איסוף הנתונים במינון הנמוך משמשת כדי למזער את נזקי קרינת אלקטרונים לדוגמה על ידי הגבלת החשיפה לאלקטרוני 20/2. זו מושגת על ידי לסירוגין בין שלוש תצורות: &quot;חיפוש&quot;, עם ההגדלה נמוכה (~ 5,000X) ושדה ראיה רחב, &quot;פוקוס&quot;, עם ההגדלה גבוהה (~ 150,000X) ושדה קטן של תצוגה, ו&quot; חשיפה &quot;, עם Magni הסופי הרצויfication ומכיל השטח של עניין שיירשם. בלנק הקורה בין מצבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת TEM ותכנית במינון נמוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בי cryo-התריס ולפתוח את שסתומי העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את הבמה ולהגדיר את גובה eucentric (Z) באמצעות wobbler אלפא לטלטל את הבמה ± 15 °. להתאים את מיקום Z עד אין תנועה ניכרת ואילו השלב מתנדנד. הפעל את התכנית במינון הנמוך ובחר את הגלאי לכל מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חשיפה למצוא שטח של הרשת שאין לו פחמן, להתאים את התאורה על ידי בחירת גודל צמצם הקבל ונקודה האופטימלי, כך שהאזור שיירשם מואר באופן מלא. הקפד להפיץ את הקורה בכיוון overcondensation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חיפוש, למצוא תכונה קטנה שתהיה קל לזיהוי בהגדלה גבוהה יותר. במצב חשיפה, מרכז תכונה זו עם ג&#39;ויסטיק (בקר שלב XY). התחל בהגדלה נמוכה יותר אם featיור הוא לא בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חיפוש, להביא בתכונה זו למרכז השדה באמצעות פקדי שינוי תמונת XY במינון הנמוכים. עבור למצב חשיפה ולהעביר את התכונה לאורך ציר ההטיה באמצעות ג&#39;ויסטיק עד שהוא מחוץ לאזור שיירשם (0.5-3 מיקרון). עבור למצב להתמקד ולמרכז את התכונה באמצעות פקדי שינוי תמונת XY. התחל בהגדלה נמוכה יותר אם התכונה היא לא בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הקרן מרוכזת בכל העת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בי cryo-התריס ולפתוח את שסתומי העמודה. הפעל את התכנית במינון הנמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חיפוש, לזהות רבוע רשת המכיל קרח דק ואחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חור מתאים ולמקם אותו במרכז השדה. לעבור להתמקד במצב ולמקד את התמונה. אז underfocus התמונה בין 0.5-4.5 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור למצב חשיפה ולהקליט את התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תעבור למצב חיפוש ולחזור על צעדים 5.2.3-5.2.4.לנוע על פני כיכר רשת הימנעות מראש לחשוף חורים טובים שיירשם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את כיכר הרשת ולעבור לעוד אחד טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקין מחדש גובה (Z) ולהמשיך איסוף הנתונים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RyRs:+Their+Disposition,+Frequency,+and+Relationships+with+Other+Proteins+of+Calcium+Release+Units.">RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units.</a> Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+from+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).</li><li>Radermacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+three-dimensional+reconstruction+of+the+calcium+release+channel/ryanodine+receptor+from+skeletal+muscle.">Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).</li><li>Stewart, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+bias+in+the+refinement+of+structures+derived+from+single+particles.">Noise bias in the refinement of structures derived from single particles.</a> Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).</li><li>Serysheva, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+and+angular+reconstitution+used+to+visualize+the+skeletal+muscle+calcium+release+channel.">Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel.</a> Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+reconstructions+of+the+transferrin-transferrin+receptor+complex+obtained+with+different+specimen+preparation+techniques.">Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques.</a> J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).</li><li>Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+apolipoprotein+serum+amyloid+A+in+solution+forms+a+hexamer+containing+a+central+channel.">Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).</li><li>Amunts, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+yeast+mitochondrial+large+ribosomal+subunit.">Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.</a> Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+the+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: the new Leginon system.</a> J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, e00461 (2013).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).</li><li>Lerch, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+AAV-DJ,+a+retargeted+gene+therapy+vector:+cryo-electron+microscopy+at+4.5+A+resolution.">Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution.</a> Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).</li><li>Govindasamy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+adeno-associated+virus+serotype+5.">Structural insights into adeno-associated virus serotype 5.</a> J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods.">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).</li><li>Ge, P., Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-bonding+networks+and+RNA+bases+revealed+by+cryo+electron+microscopy+suggest+a+triggering+mechanism+for+calcium+switches.">Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).</li><li>Clare, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-triggered+conformational+changes+delineate+substrate-binding+and+-folding+mechanics+of+the+GroEL+chaperonin.">ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin.</a> Cell. 149 (1), 113-123 (2012).</li><li>Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+model+of+the+human+26S+proteasome.">Molecular model of the human 26S proteasome.</a> Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Markl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keyhole+limpet+hemocyanin:+9-A+CryoEM+structure+and+molecular+model+of+the+KLH1+didecamer+reveal+the+interfaces+and+intricate+topology+of+the+160+functional+units.">Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units.</a> J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).</li><li>Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+the+'Wild+West'+of+structural+biology.">Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).</li><li>Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).</li><li>DiMattia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+structural+studies+of+adeno-associated+virus+serotype+5.">purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).</li><li>Samso, M., Shen, X., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+RyR1-FKBP12+interaction.">Structural characterization of the RyR1-FKBP12 interaction.</a> J Mol Biol. 356 (4), 917-927 (2006).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors:+insights+into+disease+mutations.">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+electron+crystallography.">Introduction to electron crystallography.</a> Methods Mol Biol. 955, 1-16 (2013).</li><li>Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+gaining+insight+into+cellular+processes+by+structural+approaches.">Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+supramolecular+assemblies+by+cryo-electron+tomography.">Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography.</a> Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).</li><li>Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+structure+and+visualization+of+transmembrane+domains+of+the+RyR1+calcium+release+channel+by+cryo-EM.">Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM.</a> Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).</li><li>Sharma, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoelectron+microscopy+and+image+analysis+of+the+cardiac+ryanodine+receptor.">Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor.</a> J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+with+contrast+transfer+function+correction+from+energy-filtered+cryoelectron+micrographs:+procedure+and+application+to+the+70S+Escherichia+coli+ribosome.">Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome.</a> J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).</li><li>Thon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phase contrast electron microscopy. , (1971).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

TEM ואחרי SPA תרם רבים מבני 3D macromolecular, מתקרב 2,000 ערכים בEMDB עד אמצע 2014. באופן כללי, למקרומולקולה נתון, מבנה 3D ברזולוציה נמוכה נקבע תחילה מנתוני NS, אשר עשוי להיות מלווה גבוה יותר מבנה הרזולוציה cryoEM 3D. ניגודיות הגבוה של הגבולות המולקולריים הניתנים על ידי NS, המאפשר שחזור 3D הראשון, הוא מעודן מאוחר יותר על ידי cryoEM עם יכולתה כדי למפות את המבנה הפנימי של הפולימר מצוי במצב התייבשות המלאה שלה, וכן את האפשרות להגיע לרזולוציה גבוהה הרבה יותר. יתרון נוסף של cryoEM הוא החיסול של מתח התייבשות שעלולה לגרום לקריסה של מקרומולקולה. בנוסף, קיים האפשרות להשמיט את תמיכת פחמן, אשר מבטלת השפעות קליטת משטח אפשרי ומציגה את קונפורמציה שמקרומולקולה מאמץ בפתרון. צביעת קריו שלילית, שילוב של cryoEM וNS, מעניקה ניגודיות גבוהה בhyd מלאדירוג דגימה וגם יכול להוביל לשחזור 3D באמצעות SPA, אולם זה כבר נעשה שימוש בתדירות נמוכה יותר, עם פחות מ -10 ערכי EMDB, בין שאר משום שהכתם עצמו עלול להפריע לשלמות מקרומולקולה 31. שתי טכניקות TEM אחרות תורמים לשחזור 3D הן קריסטלוגרפיה אלקטרון 2D וטומוגרפיה של האלקטרון. קריסטלוגרפיה אלקטרון 2D דורשת גביש מישוריים או צינורי; התאבכות האלקטרונים של הגביש המשמשת לשחזור 3D שעלול לגרום לרזולוציה אטומית 32. בטומוגרפיה של האלקטרון של דגימות קבועות מזוגגות או מסורתיים, מרכיב מקרומולקולה או תת-תאי הוא הסתובב בתוך TEM לשיקום טומוגרפית הבא 33, עם היתרון שניתן לשחזר אובייקטים ייחודיים; עם זאת כיום בטכניקה זו יש מגבלת רזולוציה נעה 40-20 Å 34,35. בין כל טכניקות TEM מולקולריות אלה, SPA של נתונים NS וcryoEM היה נרחב ביותרבשימוש. הפרוטוקול המאויר כאן מוקדש לקבלת תמונות cryoEM מתאימות לניתוח SPA; אף על פי כן רוב הפרוטוקול גם לגבי גבישים ודגימות טומוגרפית cryoEM של 2D. מושב cryoEM מוצלח תלוי בהצלחה בשילובם של רבים שלבים קריטיים; היבטים חשובים לזכור, הסבר של חפצי cryoEM הנפוץ וכיצד להימנע מהם מתוארים בסעיפים הבאים. סעיף זה מתאר גם הנחיות לאיסוף נתונים להשגת שחזורי 3D באיכות גבוהה תוך שימוש בשיטת SPA. הימנע ממעבר לצח קרח. היבט מרכזי הוא שהמדגם צריך להישאר במדינת זגוגית מרגע לאורך תצפית TEM צולל-cryo. כך לאחר ירידה חדה במדגם אתאן הנוזלי בכל הצעדים הבאים מבוצעים בחנקן נוזלי (-196 ° C) או הליום נוזלי (-269 ° C) טמפרטורות. התחממות לעיל -135 מעלות צלזיוס הופכת מים זגוגית בלמים גבישים; אז שחלופי macromolecular עשויים להתרחש וגבישי מים שולטים בתמונה (איור 3 א); המדגם צריך להיות מושלך. מדגם חימום מקרי יכול לקרות אם cryo-צולל, העברת הרשת הקפואה בין מכולות (גם אם מוגן על ידי gridbox), ו / או הכנסת בעל cryo לTEM היא איטית מדי, או אם פינצטה הטיפול היתה מספיק מראש מקורר. הרעה משמעותית בואקום TEM על cryo-העברה (אוויר הנכנס מלכודות מדגם קרות חם יותר) יכולה גם לחמם את המדגם. לבסוף, על-הקרנה של המדגם יכול גם לגרום למעבר לצח, קרח. למזער את זיהום קרח. בהתחשב בנפח הדגימה הקטן (3-5 μl) פנה לרשת TEM, אידוי יכול להתרכז רכיבי חיץ (מלח, חומרי ניקוי) ובכך להשפיע על שלמות macromolecular לרבות אובדן מדינת Multimeric. לעקוף או מייקרו-סביבת תא לחות היחסית גבוהה (RH)של בעיה זו. לחלופין cryo-צולל ניתן לעשות זאת בחדר קר סביבתי מאוורר במידה מספקת. לאחר RH צולל-cryo צריך להיות נמוך ככל האפשר על מנת למנוע זיהום קרח, או התעבות של לחות סביבה בcryo-הרשת, כמו cryo-הרשת עצמו פועל כמלכודת קרה. זיהום קרח מורכב מחלקיקים עם ניגודיות גבוהה ולא מסד עם גדלים הנעים בין 5 ~ ננומטר וכמה מיקרונים שמפריעים או אפילו לחלוטין לחסום את התמונה. הימנע טיוטות אוויר, מדבר / נשימה לקראת cryo-הרשת במהלך העברת אוויר, ולהפחית RH הסביבה. מכולות פתוחות חנקן נוזליים עם מים תמצית (נראים כמו חלקיקים מרחפים לבנים) גם צריכה להיות מושלכות. מקסם אוריינטציות / צפיות macromolecular. לתמיכת מדגם, בחירה להתבצע היא בין רשתות המחוררת האמיתיות ופחמן דק על רשתות מחוררות. זה תלוי ב( i) איך המדגם משתרע על פני סרט פחמן לעומת חורי פחמן, (ii) conce מדגם זמיןntration, כמו חורים חשופים עשויים לדרוש ריכוז 100X גבוה מתמיכת פחמן לצפיפות חלקיקים דומה בתמונה (מ~ 0.02-2 מיקרומטר), ו- (iii) כיצד אקראי היא ההפצה של אוריינטציות מקרומולקולה. שים לב שהפרשות זוהרת, מה שהופך את הידרופילי פחמן, תהיה לכך השפעה חשובה בכל שלושת היבטים ושזה יהיה מדגם תלוי. לגבי הכיוון של מקרומולקולה, תוך מבט חוזר רצוי לקביעה המבנית הראשונית על ידי שחזור חרוטי אקראי, אקראית דעות macromolecular רצויה בעת שיפור שחזור 3D לרזולוציות גבוהות יותר. בדוגמא שלנו, RyR1 אינטראקציה עם פחמן עם נוף אהוב &quot;פי ארבעה&quot; (איור 2 ד) ודורש רשתות מחוררות לאקראיות של אוריינטציות ורזולוציה גבוהה יותר 36. למקסם את יחס אות לרעש. האסטרטגיה הטובה ביותר כדי להגדיל את יחס האות לרעש הוא להפחית את מקורות רקע של רעש. קרח מוגזםעובי ו( אם קיים) עובי סרט פחמן מעבר למה שנדרש כדי לתמוך ולהטביע את החלבון יוסיף רעש נוסף. כך עובי קרח צריך להיות מופחת למינימום הנדרש על ידי שליטה בזמן, לחץ, RH, ואיכות נייר סינון סופג. לתמיכת פחמן, (~ 5 ננומטר) סרט פחמן דק מונח על פני סרט פחמן המחורר העבה: פחמן המחורר העבה מספק התנגדות מכאנית ואילו המדגם צילם מעל החור מכוסה פחמן הדק. מצד השני, שימו לב שמאוד קרח דק ו / או פחמן עלולה לגרום לתמיכה נשברה בקלות שיכול להפוך לאינטרנט (איור 3D). על מנת למקסם את יחס האות לרעש, יש להימנע בכל רכיבי חיץ מיותרים. לחלבוני קרום, חומרי הניקוי לוקח אגרה משמעותית על ניגוד (ראה איור 2 ד, פנל מימין). בנוסף על ידי הפחתת מתח פן חומר הניקוי משנה את האופן שבו המדגם מתפשט על התמיכה. חלבוני קרום מסוימים דורשים נוכחות של שומנים בדם, בנוסף לDetergent, אשר מפחית את הניגוד נוסף. כדי להתגבר על זה המדגם יכול להיות מדולל בחיץ עם ריכוז חומר ניקוי נמוך יותר וללא שומנים רק לפני cryo-צולל 37. חומרי ניקוי חדש חלופי 16 והשימוש בnanodisks 38 כדי לייצב את מרכיב תחום הטרנסממברני נראים גישות מוצלחות לחלבוני קרום הדמיה על ידי cryoEM. לשאוף לתמונות באיכות גבוהות ולהתכונן לתיקון CTF. מזוגגות דגימות דורשות ערכי defocus גבוהים כדי ליצור תמונה מספיק (שלב) לעומת זאת יש בי CTF, הפונקציה המתייחסת עוצמה לתדר, כמה אפס מעברים, ובנקודה אין מידע. בעוד תיקון CTF אין צורך לשחזור 3D ברזולוציה נמוכה, כאשר מכוונים לרזולוציה גבוהה יותר, כדי להתאושש ייצוג מדויק של אובייקט 3D, תמונות עם defoci שונה צריכה להיות שנאספו כך שתיקון CTF חישובית ניתן לעשות.נחישות CTF ותיקון כלולה בחבילות תוכנת SPA הגדולות 4-7; ניתן למצוא את פרטים במקומות אחרים 39. לתיקון CTF אופטימלי, משתמש במגוון של defoci. אסטרטגיה טובה היא להחליף בין 3-4 ערכי defocus. הערכים תלויים בגודל של מקרומולקולה (גדלים גדולים יותר דורשים פחות defocus), עובי קרח / פחמן (לדוגמא דקה יותר דורשת פחות defocus), והמתח (מתח נמוך דורש פחות defocus). עבור 200 וולט, טווח התחלה טוב של ערכים הוא 2.5, 3, 3.5 ו -4 מיקרומטר defocus. CTF בא לידי ביטוי לסירוגין טבעות של אינטנסיביות גבוהה ונמוכה (Thon מצלצל 40) בייצוג המרחב ההדדי, ספקטרום הכח. מציג את ספקטרום הכח יגלה את הפוטנציאל להחלטה; התדירות של טבעת Thon הגלוי הרחבה ביותר היא הקרובה ביותר הערכה מראש של ההחלטה ברת-השגה. ספקטרום הכח צריך להיבדק מעת לעת, וטבעות astigmatic (מעגלי שאינו) Thon (איור 3C) צריך להיות מתוקן עם stigmator האובייקטיבי. טבעות Thon צריכה להיות גלויות לפחות עד הרזולוציה הרצויה. בסיס נתוני cryoEM שהושג באמצעות פרוטוקול זה יכול להיות מעובד ישירות על ידי SPA על מנת ליצור שחזור 3D. אפילו עם מדגם אידיאלי, איכות שחזור 3D תהיה תלויה בביצועים והמפרטים של ציוד TEM, ועל עיבוד התמונה. עם השיפורים המשיכו בשתי החזיתות הללו, ועם אזכור מיוחד לגלאי אלקטרונים הישירים שפותחו לאחרונה, את האפשרות להשיג שחזורי 3D ברזולוציה אטומית יותר באופן עקבי היא קרוב יותר ממה שהיה אי פעם.

המטרה של cryoEM היא להשיג תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים של מקרו-מולקולות במצב התייבשות האם שלהם. מכוח הטבעת מקרומולקולה במים מזוגגים, מדגם קפוא hydrated יכול להיות הציג ישירות ומדמיין במכשיר TEM. Vitrification, השיג הבזק הקפאה (10,000 C / sec o) על ידי, מקפיא את המדגם מבלי התגבשות מים ומבטיח כי ארגון מחדש מולקולרי במהלך ההקפאה הוא חסרי משמעות. העודף של פיזור אלקטרונים של המדגם ביחס לחיץ סביב מספק ניגוד קטן אבל מספיק לראות את מקרומולקולה בהעדר כל כתם 1. עיבוד תמונה ממוחשב לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לשחזר מבנה 3D של מקרומולקולה. מקרו-מולקולות גדולות בטווח ~ 500 מד&quot;א הרב kDa- הן דוגמאות אידיאליים עבור cryoEM (המייצגות למעלה מ- 80% מהגדה נתונים מיקרוסקופית אלקטרונים (EMDB) כניסות); אלה כוללים חלבונים, קומפלקסי חלבונים, חלבון חומצות גרעין גomplexes, וחלבוני קרום משובצים בbilayer. מקרו-מולקולות אלה הם פחות סיכוי להיות מגובש (עם פחות מ -2% ערכים במסד נתוני PDB) עדיין זה קורה לעתים קרובות שחתיכות קטנות יותר לפתרון על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן או NMR ניתן לעגן למעטפת 3D נוצרה על ידי cryoEM. מצד השני, חלק מהמבנים הגדולים ביותר נפתרו על ידי cryoEM ניתן לזהות בתוך התא המלא בסעיף דק TEM 2. לפיכך, cryoEM יעילות מגשר על הגודל ורזולוציה הפער בין מבני subcellular והאטומיים. CryoEM משקף מבנה טוב יותר של מקרומולקולה ילידים מאשר בשיטה הקלאסית יותר של מכתים שלילי (NS), שבו מקרומולקולה מיובש ומוקף בשכבה של כתם מתכת כבד לפי אזור הדרת כתם יוצר תמונה מאוד בניגוד &quot;שלילית&quot; 3. בשני המקרים אלומת האלקטרונים מפיקה תמונות 2D השלכה של מקרו-המולקולות, חלקיקים הנקראים, שבו יםhape תלוי בכיוון של מקרומולקולה ביחס לאלומת האלקטרונים. חלקיקים רבים, לפחות ~ 1000 וללא גבול עליון, ניתן לנתח במחשב עם &#39;ניתוח יחיד חלקיקים &quot;(SPA) תוכנה כדי להגדיל את יחס האות לרעש (SNR) אם כי מיצוע, ולמצוא פרמטרים ההתמצאות במרחב של החלקיקים צורך לשחזר 3D המבנה של הפולימר מצוי על ידי 4-7 הקרנה אחורית. NS, עם יחס אות לרעש גבוה יותר, משמש לאפיון מדגם ראשוני וליצור דה נובו שחזור 3D; הרזולוציה שלה לעתים רחוקות עולה על 20 א &#39;, שמוטל על ידי ההתייבשות והגודל של גרגר המתכת הכבד. באופן כללי, לקביעה מבנית cryoEM 3D, שחזור 3D ברזולוציה נמוכה מתקבל ראשונה מNS ולאחר מכן cryoEM משמש כדי לחדד את המפה ראשונית ברזולוציה נמוכה זה כדי ללמוד עוד מקרומולקולה במדינת hydrated המקורי שלו, כדי לראות את המבנה הפנימי שלה, וכדי להגדיל את הרזולוציה שלה. לאte שאם מודל NS היה מעוות (הדוגמא הנפוצה ביותר היא ההשטחה כתוצאה מהתייבשות 8) והיו לי חלקיקי cryoEM SNR הנמוך, אז העיוות יכולה לשאת לתוך מודל cryoEM (חפץ המודל-משוא פנים, שהוא נפוץ בSNR הנמוך מערכי נתונים 9). עיוות מבנית תביא לחוסר התאמה בין NS וחלקיקי גלם cryoEM ובין חלקיקי cryoEM גלם והתחזיות מקבילה של מודל 3D מאונך לכיוון השיטוח. הטיה דגם עשויה לפתור בעצמו כמודל 3D עובר מחזורים רצופים עידון. צריך שלא יתרחש, שיזוהה כחוסר התאמה בין חלקיקי גלם cryoEM ותחזיות המקבילה ממודל 3D, אז מודל דה נובו צריך להיות בנוי מנתוני cryoEM. גישה טובה יכולה להיות לשימוש באלגוריתם הזוויתי הכינון מחדש 10, אשר עשוי להניב כמה כרכי 3D אפשריים, ולאחר מכן להשתמש במודל NS 3D כדי לבחור את מודל cryoEM הטוב ביותר האפשרישיהיה מעודן 11 נוסף. אסטרטגיה אפילו טובה יותר היא להגדיל את יחס האות לרעש של בסיס נתוני cryoEM (ראה סעיף ייעודי בדיון). יש האיכות ביוכימיים של מקרומולקולה המטוהר השפעה מירבית בתוצאה הסופית. מקרומולקולה, מטוהר מרקמות או באו לידי ביטוי במערכות Heterologous, צריך להיות ברמה גבוהה של טוהר ולהיות מבני בשלמותה. זה צריך לא ליצור אגרגטים ולא צריך את זה disaggregate. כדי להגדיר קונפורמציה מסוימת, תנאי ההכנה צריכים לקדם מדינת קונפורמציה אחידה. ללמוד מתחמים, זה אופטימלי שD k הוא בטווח ננומטר, אחרת fixatives שימש בהצלחה לייצוב אינטראקציות זיקה נמוכה 12,13. תמונות cryoEM לא מעובדות להניב מידע רב ערך על הממדים, קווי המתאר כלליים, מצב צבירה / multimerization, הומוגניות, ומבנה פנימי של macromolecule. אף על פי כן את הפוטנציאל של הטכניקה הוא משופר בהרבה עם עיבוד תמונה. מבנה 3D מגלה ארכיטקטורה הכוללת של מקרומולקולה, מיקום 3D של הליגנדים ויחידות משנה, שינויי קונפורמציה, ומאפשר עגינה של מבנים אטומיים נקבעו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן או NMR. כמות המידע של שחזור 3D מגדילה בשלבים כפי שהרזולוציה גדלה: ברזולוציה גנרל 15-20 מאפשרת עגינה חד-משמעית של מבנים אטומיים, ב9-10 סלילי אלפא נראה כמוטות, בשעה 5 Å ניתן להבחין גיליונות בטא, ובהחלטות של 3.5 ויותר טובים שאפשר לבנות מודל אטומי 14. האפשרות לקבל תמונות אינפורמטיבי ושחזור 3D באמצעות SPA מכמויות קטנות יחסית של מדגם לעשות cryoEM טכניקה אטרקטיבית, כמו 3-5 μl של לפחות 0.05 מ&quot;ג / מיליליטר מספיקים כדי להכין את רשת TEM אחד. דרישות מינימום אינסטרומנטלילcryoEM הם cryo-בוכנת תוצרת בית או מסחרי, מיקרוסקופ אלקטרונים עם ואקום גבוה במיוחד, תקשורת הקלטת תמונה וערכה במינון נמוך, cryo-בעל עם תחנת השאיבה שלו, מנגנון הפרשות זוהרים, ומאייד. תכונות שאינן חיוניות, אך רצויות נוסף על TEM הן מצלמת CCD (קיים בכל TEMs המודרני) או גלאי אלקטרונים ישירים, אקדח פליטת שדה (FEG), סינון אנרגיה, ותוכנה לאיסוף נתונים תפוקה גבוהה. תוכנה בעיקרון זה מאפשרת איסוף עשרות אלפי חלקיקים במושב cryoEM יחיד 15, אולם לצרכי אחסון נתונים המוגבר וצורך זמן שלאחר עיבוד בפיקוח לאחר להילקח בחשבון. FEG בשילוב עם פונקצית העברה בניגוד תיקון (CTF) עומד בבסיס רוב שחזורי 3D שהגיעו רזולוציה מספיקה כדי להמחיש סלילי אלפא. בשלב זה, את רמת הרזולוציה היא גם מדגם תלויה: הגיע 10 רזולוציה A הוא פחות נפוצה לחלבוני קרום ואילו אםסדר גבוה של סימטריה קיים אז הרזולוציה אטומית היא ברת השגה יותר. הפיתוח האחרון של גלאי אלקטרונים ישירים אפשר רזולוציה אטומית אפילו למקרו-מולקולות עם סימטריה נמוכה (4x) או לא, שבו האיכות של מפות צפיפות האלקטרונים cryoEM תואמת נגזרים אלה מנתוני רנטגן עקיפה 16,17. דוגמאות מעשיות הממחישות את היכולות של הטכניקה מובאות כאן כארבעה סוגים חשובים של מקרו-מולקולות שבי cryoEM יש תפקיד ראשי בהמשך הנחישות המבנית שלהם. (I) עם הסימטריה icosahedral שמגדילה את בסיס הנתונים של פי 60 וגודל שלהם גדול המאפשר נאמן ויישור לשחזור, המבנים של כמה וירוסי icosahedral נפתרו לרזולוציה כמעט אטומית על ידי cryoEM אחרי SPA 18. אנחנו מראים דוגמא של כיתה של וירוסי icosahedral, adeno הקשורים וירוסים (AAVs), שלמבנים ליד-אטומיים על ידי cryoEM ועל ידי HY / רנטגן cryoEMשיטות Brid קיימות 19,20. (Ii) מקרומולקולות עם מבנה סליל כוללת microtubules, חוטים ווירוסים. יחידות החוזרות על עצמן לאורך ציר הסליל יכולות להיות מנותחות על ידי גרסה מורכבת יותר של SPA המותאם לגיאומטרית הסליל 21. בדוגמא שאנו מציגים וירוס טבק פסיפס (TMV), וירוס RNA שנפתר לרזולוציה אטומית על ידי 22 cryoEM. (Iii) חלבונים מסיסים גדולים נחקרו בשפע. בין אלה, מקרו-מולקולות ויוצרות גלילי Multimeric סימטריים מהוות ארכיטקטורה חוזרת לעתים קרובות לפתור ברזולוציה subnanometer 23,24. כאן אנו מראים תמונות של KLH, מוביל חמצן חסר חוליות, שבו מודל מולקולרי היברידי נוצר משיטות היברידיות קריסטלוגרפיה cryoEM / רנטגן 25. (Iv) חלבוני ממברנה הם מעמד חשוב של חלבונים; הם מהווים כ- 1/3 מהחלבונים מקודדים על ידי הגנום האנושי, אך הם קשים לאפיון מבני בשל מורכבות הקשורים trייצוב ansmembrane תחום 26, ומהווה פחות מ -1.5% מהמבנים נפתרו על ידי כל טכניקה מבנית בשילוב. התפקיד של שיקום cryoEM ו3D בנחישות המבנית שלהם בא לידי ביטוי עם קולט ryanodine (RyR), Ca 2 + ערוץ תאיים אוקריוטים גדול חשוב בהתכווצות שרירים ואיתות המוח. מבני cryoEM הרזולוציה הגבוהים ביותר עד כה, עם 10 רזולוציה Å, לחשוף מבנה משני 27.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:243px;">Ethane</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">371745</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:243px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27135</td>
			<td style="width:167px;">99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5326</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mica sheets, 1 x 4 cm</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Graphite rods, presharpened size 1/8&#8221; dia x 2 &#188;&#8221; long tip 0.039&#8221; dia neck type</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">70220-45</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">350 ml cryo-dewars</td>
			<td style="width:132px;">Pope</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids&#160; Quantifoil</td>
			<td style="width:132px;">Quantifoil</td>
			<td style="width:119px;">Q10525</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td>
			<td style="width:132px;">Protochips</td>
			<td style="width:119px;">CF-1.2/1.3-4C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Glow discharge device</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Model E7620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Turbo pumping station</td>
			<td style="width:132px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;">Model 655</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Carbon evaporator</td>
			<td style="width:132px;">Denton Vaccum</td>
			<td style="width:119px;">Model 502B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Freeze plunger</td>
			<td style="width:132px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software EMAN</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:243px;">Image Processing software Spider</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software Freealign&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">3D visualization software Chimera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td>
			<td style="width:132px;">Biosyn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

ביצוע מדוקדק של כל שלבי הפרוטוקול שתוארו באיור 1 מאפשר הדמיה של מקרו-מולקולות קפוא התייבשות, שאינן מוכתם. תוצאות עבור ארבע דגימות נציג עם מאפיינים מבניים שונים מוצגות. התמונות המיקרוסקופיות שלהם מתקבלות על ידי השיטות של NS וcryoEM מושוות (איור 2). תמונות (i) NS של AAV5 לחשוף חלקיקים כמו וירוס-של כ -130 קוטר Å. דו-הקיום של מבנים ריקים ומלאים מתאים לשבור (המאפשר כניסת כתם) וcapsids מבני בשלמות, בהתאמה. CryoEM תערוכות מבנים אחיד ריקים; אכן חלקיקים הנגיפיים אלה אינם מכילים חומר גנטי 28. NS תערוכות חלקיקים עגולים בולטים ואילו cryoEM תערוכות חלקיקים בעיקר משושה, המשקפות צורת icosahedral. (Ii) תמונות של מוטות תכנית TMV סליל בקוטר 180 A ואורך משתנה, לעתים קרובות יותר מ -0.1 מיקרומטר, עם חוזר סליל של 23 גלוי שניבNS ובcryoEM. הערוץ המרכזי 40 מלא בכתם בתמונות NS וריק בתמונות cryoEM. (Iii) Native KLH, didecamer של 8 מד&quot;א, מרכיב בחביות אופייניות של 350 קוטר A ואורך 400. NS וcryoEM לחשוף KLH של צד נופים מלבניים ועגול סוף על-נוף. שני הטכניקות לחשוף שישה פסים בניצב לציר הסימטריה ויחידות מורפולוגיים במרווחים שווה בשווה בכל רובד. CryoEM מגלה מבנה פנימי ריק. (Iv) קולט Ryanodine, ערוץ תאיים tetrameric גדול של 2.26 מד&quot;א, נתפס כריבוע של 275 x 275 2. תכונות פני השטח מורכבות כגון צלב מרכזי ודיכאון מרכזי מניפסט כהצטברות כתם על ידי NS, וכאזורי צפיפות נמוכים יותר על ידי cryoEM. בעוד NS תערוכות ניגוד דומה בכל ארבע דגימות שנבדקו, השוואה של לוחות cryoEM חושפת את יחס האות לרעש הנמוך (בניגוד) של RyR1 בשל נוכחותם של חומרי ניקוי לsolubilize חלבון קרום זה. דוגמאות אופייניות של חפצי cryoEM מוצגות לRyR1: קרח גבישים, זיהום קרח, אסטיגמציה, ומבנים-כמו אינטרנט (איור 3). הסיבות שלהם ומניעה מתוארות נוספות בסעיף הדיון. שחזור SPA ו3D של RyR1 קפוא hydrated חושף את המבנה שלה פי ארבעה סימטרי, המשקף הארגון של החלבון homotetrameric (איור 4 א). תחום cytoplasmic מהווה פריזמה מרובעת של 275 x 275 x 120 3 ומכיל מספר תחומים כדוריים לשחזור יוצרים מבנה דמוי פיגום. תחום הטרנסממברני מהווה פריזמה מרובעת מחודדת קטנה יותר בממדים מרביים 115 x 115 x 60 3. בשעת 10 ברזולוציה Å אפשר לדמיין סלילי אלפא (איור 4). מיפוי הבדל 3D יכול לחשוף את המיקום של ligands החשוב, במקרה זה הבדל מפת 3D של FKBP12, conside 12 חלבון KDאדום למקטע של RyR1, הוא על גבי RyR1 (איור 4C) 29. לבסוף, שינויי קונפורמציה לספק תצוגה דינאמית של מקרומולקולה. במקרה זה RyR1 התייצב בעבר בתנאים או סגורים או פתוחים מגלה טרנסלוקציה המונית מהסגורה למצב הפתוח (איור 4D) 27. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים זרימה של הטכניקה במיקרוסקופ האלקטרונים cryo. התרשים מדגיש את השלבים העיקריים של הפרוטוקול. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> איור 2. השוואה של NS וcryoEM עבור מגוון רחב של דוגמאות. () AAV5, וירוס icosahedral. (B) TMV, וירוס סליל. ריבועים להראות חוזר הסליל, 23 א &#39;. (ג) Native KLHRyR1 (D).; צפיות נציג מודגשות (ו, השקפה פי ארבעה ושל, מבט מצד). כל הדגימות הם צילמו בתנאים במינון נמוכים ובו בהגדלה של 50,000X תחת מתח מאיץ של 200 וולט. ברים סולם, 10 ננומטר. כל דגימות NS הן על תמיכת פחמן, דגימות cryoEM, C, D נמצאים על פחמן דק מעל quantifoil, ומדגם cryoEM B הוא ישירות על חורי quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> איור 3. גלריה של תמונות מראים ממצאי cryoEM נפוצים על מדגם RyR1 cryoEM. (א) קרח. זיהום קרח (B) גבישים (חיצים). אסטיגמציה (C). RyR1s בתמונה astigmatic הם בקושי נראה. הבלעה בצד הימין מראה את הכח SPECTרום של התמונה עם טבעות Thon א-סימטריים. הבלעה משמאל מראה את כוח הספקטרום של תמונה שאינה astigmatic להתייחסות. מבנים (D) כמו אינטרנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> איור 4. שחזור CryoEM ו3D של הקולטן ryanodine. . (א) ייצוג Isosurface (B) עגינה של מבנה הגבישי של של RyR1 N-סופית 30 מראה הסכם טוב בין הקואורדינטות האטומיות ואת מעטפת cryoEM; חיצים מצביעים על שני סלילי אלפא שיבלטו מהמבנה. ראש החץ מצביע על אחד מהסלילים ארבעת המקיפים את חור של ערוץ היון. הקווים מקווקווים מציינים את הגבולות של הקרום. (C) RyR1 ו3D loקטיון של יגנד FKBP12 (הצבע כתום). (ד) שינויי קונפורמציה של RyR1 בהולכים מסגור (הכתום) לקונפורמציה הפתוחה (השחורה רשת). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction at JoVE.com

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

do-s-don-ts-cryo-electron-microscopy-primer-on-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

45.9K Views.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Video: Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal colony. Proper collection of tissues for further histological processing can impact the quality of testing results. This article describes the conduct of a basic gross examination including identification of heart, liver, lungs, kidneys, and spleen, as well as how to collect those organs. Additionally four of the more difficult tissue/sample collection techniques are demonstrated. Lung collection and perfusion can be particularly challenging as the tissue needs to be properly inflated with a fixative in order for inside of the tissue to fix properly and to enable thorough histologic evaluation. This article demonstrates the step by step technique to remove the lung and inflate it with fixative in order to achieve optimal fixation of the tissue within 24 hours. Brain collection can be similarly challenging as the tissue is soft and easily damaged. This article demonstrates the step by step technique to expose and remove the brain from the skull with minimal damage to the tissue. The mesenteric lymph node is a good sample type in which to detect many common infectious agents as enteric viruses persist longer in the lymph node than they are shed in feces. This article demonstrates the step by step procedure for locating and aseptically removing the mesenteric lymph node. Finally, identification of infectious agents of the respiratory tract may be performed by bacterial culture or PCR testing of nasal and/or bronchial fluid aspirates taken at necropsy. This procedure describes obtaining and preparing the respiratory aspirate sample for bacterial culture and PCR testing.

This article describes the procedures for conducting a basic postmortem examination of a mouse or rat, and the collection of basic organs, as well as more challenging sample types from for histological, microbiological, and PCR evaluation.

Necropsy לאבחון רקמות אוסף נבחר מדגם של חולדות ועכברים

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...