The authors thank Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico, and Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty for helpful conversations and the NIH for funding (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

מסר של אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC). 1. סינתזה של TZ-BN-NOTA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכלי תגובה קטנים, לפזר 7 מ&quot;ג NH 2 -Bn-NOTA (1.25 x 10 -2 mmol) ב600 NaHCO 3 חיץ μl (0.1 מ &#39;, pH 8.1). בדוק את ה- pH של התמיסה. במידת צורך, להתאים את ה- pH של התמיסה ל -8.1 באמצעות aliquots הקטן של 0.1 M Na 2 CO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את פתרון -Bn-NOTA NH 2 ל -0.5 מ&quot;ג TZ-NHS (1.25 x 10 -3 mmol) בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge. הערה: אם אפשר לשקול TZ-NHS החוצה יבש או הגיע מפתרון מניות של DMF היבש או DMSO (&lt;50 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון התגובה וכתוצאה מכך להגיב למשך 30 דקות ב RTעם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, לטהר את המוצר באמצעות הפוך-שלב כרומטוגרפיה 18 HPLC C כדי להסיר NH unreacted 2 -Bn-נוטה. ניתן לנטר NH 2 -Bn-NOTA באורך גל של 254 ננומטר, ואילו TZ-NHS וTZ-BN-NOTA נמצאים תחת פיקוח הטוב ביותר באורך גל של 525 ננומטר. הערה: זמני שייר הם כמובן תלויות מאוד בהגדרת ציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, צינורות, וכו &#39;). עם זאת, להציג דוגמא, אם שיפוע של 0: 100 MeCN / H 2 O (שניהם עם 0.1% TFA) 100: 0 MeCN / H 2 O מעל 25 דקות ועמודת 4.6 x 250 מ&quot;מ C 18 אנליטיות משמש , הפעמים השמירה של TZ-BN-נוטה, TZ-NHS, וNH 2 -Bn-NOTA יהיו סביב 15 דקות, 16.5 דקות, 10 דקות ו, בהתאמה. המוצר יכול להיות מטוהר ממרכיבי תגובה האחרים באו ריצה אחת או ריצות מרובות באמצעות טור HPLC למחצה preparative או preparative C 18. 1 H-NMR, אנאליytical HPLC, וESI-MS כל השיטות שניתן להשתמש בהם כדי לאמת את טוהר של מבשר TZ-BN-NOTA הושלם. 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את eluent HPLC נאסף באמצעות חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את צינור האיסוף הקפוא ברדיד אלומיניום אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור איסוף הקפוא בO כלי lyophilizing / N כדי להסיר את השלב הנייד HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המוצר המטוהר (ורוד בהיר מוצקה) בחושך ב -80 ° C. הערה: זו נקודת עצירה מקובלת בהליך. מבשר TZ-BN-NOTA הושלם הוא יציב במשך לפחות 1 שנה בתנאים אלה. </li></ol> 2. הכנת huA33-TCO Immunoconjugate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין 1 מ&quot;ג / מיליליטר (2.7 מ&quot;מ) פתרון של TCO-NHS בDMF היבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge, להכין 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון (13.3 מיקרומטר) של huA33 ב 1 מיליליטר של בופר פוספט, pH 7.4 (0.01 M 4 PO 3, </sub&gt; 0.154 M NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות aliquots הקטן (&lt;μl 5) של 0.1 M Na 2 CO 3, להתאים את ה- pH של תמיסת הנוגדן ל8.8-9.0. השתמש באחת נייר pH או מטר pH עם microelectrode לפקח pH, ולהיזהר שלא לאפשר את ה- pH להתעלות מעל pH 9.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון הנוגדן הוא בpH הנכון, להוסיף נפח של פתרון TCO-NHS המקביל ל 8 שווה טוחנת של אסתר הופעלה. לדוגמא, להוסיף 7.9 μl של 1 מ&quot;ג הפתרון / מיליליטר TCO-NHS (1.07 x 10 -7 mol TCO-NHS) למ&quot;ל 1 של פתרון 2 מ&quot;ג / מיליליטר נוגדן huA33 (1.33 x 10 -8 mol huA33). לא יעלה על 5% DMF לפי נפח בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות את הפתרון על ידי צינור היפוך microcentrifuge מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את צינור microcentrifuge ברדיד אלומיניום אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לדגירה עבור שעה 1 ב RT עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי השעה 1 בRT, לטהר את immunoconjugate וכתוצאה מכך באמצעות siz חד פעמי מראש ארזהדרת דואר טור desalting. ראשית, יש לשטוף את עמודת הדרת גודל כפי שתואר על ידי הספק כדי להסיר כל חומרים משמרים נוכחי בעמודה במהלך האחסון. לאחר מכן, מוסיף את תערובת התגובה לטור הדרת גודל, לשטוף את הטור עם 1.5 מיליליטר 0.9% תמיסת מלח סטרילית, ולאחר מכן לאסוף את המוצר באמצעות 2 מיליליטר של 0.9% תמיסת מלח סטרילית כeluent. הערה: שלב זה יניב huA33-TCO הושלם כפתרון 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של התוצאה huA33-TCO על UV-Vis ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז גבוה יותר הוא רצוי, לרכז את פתרון huA33-TCO באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי. הערה: חשוב לציין כי בעוד huA33 ומגוון של נוגדנים אחרים ידועים (למשל, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, וJ591) הם סובלניים מאוד להיות מרוכז, וצבירת משקעים יכולים להתרחש על ריכוז במקרים אחרים. חוקרים מנסים זה procedיור עם נוגדן חדש צריך לסמוך על הספרות או הידע שלהם של הנוגדנים בשאלה בנוגע לשאלה האם לא להתרכז הנוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את immunoconjugate huA33-TCO הושלם על 4 מעלות צלזיוס בחושך. הערה: זו נקודת עצירה מקובלת בהליך. המצומד מב-TCO השלים צריכה להיות יציב במשך לפחות 3 חודשים בתנאי האחסון הללו. </li></ol> 3. 64 Cu Radiolabeling של TZ-BN-NOTA הערה: שלב זה של הפרוטוקול כרוך הטיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים - או ביצוע כל עבודה אחרת עם רדיואקטיביות - חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. קח את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר (723 מיקרומטר) פתרון של TZ-BN-נוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בmicroc 1.7 מיליליטרצינור entrifuge, להוסיף 10 μl של פתרון TZ-BN-NOTA (5 מיקרוגרם) 400 μl של 0.2 M NH 4 OAC pH 5.5 חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעניין של פתק שמירת radiochemical הנכונה, למדוד ולתעד את כמות הרדיואקטיביות במדגם באמצעות כיל מנה לפני ואחרי הצעדים שהתפתחו בפרוטוקול בהמשך (3.4-3.8). זה יעזור לך עם הקביעה מדויקת של תשואות radiochemical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2,000 μCi (74 MBq) של 64 Cu לפתרון TZ-BN-נוטה. הערה: בדרך כלל, [64 Cu] CuCl 2 מסופקת בנפח קטן (&lt;30 μl) של 0.1 N HCl, ובכך רק בנפחים קטנים (&lt;10 μl) של פתרון מניות זו נדרשות לתגובת radiolabeling. אם בכמויות גדולות של המניות [64 Cu] CuCl 2 יש צורך, תגובת radiolabeling היא סובלנית של הגדלת נפח התגובה הכוללת. עם זאת, ה- pH של תמיסת תגובת radiolabeling צריך להיות במעקב צמוד כדי להבטיחשזה לא יפחת מ pH 4.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לדגירה של 10 דקות ב RT עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות של דגירה, לטהר את המוצר באמצעות C 18 כרומטוגרפיה HPLC ההפוך-שלב. פעמים שמירה הן כמובן תלויות מאוד בהגדרת ציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, צינורות, וכו &#39;). עם זאת, להציג דוגמא, אם שיפוע של 5:95 MeCN / H 2 O (שניהם עם 0.1% TFA) 95: 5 MeCN / H 2 O מעל 15 דקות משמש, זמן השמירה של 64 Cu-Tz- BN-NOTA צריך להיות סביב 9.8 דקות בזמן חופשי, 64 Cu uncomplexed יהיה elute עם חזית הממס בסביבות 2-4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מאייד סיבובי, להסיר את eluent HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Redissolve מוצר 64 Cu-טז-BN-NOTA בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. הערה: בהתחשב 12.7 שעות זמן מחצית החיים הפיזיים של 64 Cu, זה לא נקודת עצירה מקובלת בהליך. לבצע הסינתזה של 64 Cu-טז-BN-לאמייד לפני ההזרקה של radioligand, ובצעו את שלב 3.7 מייד אחר צעד 4.5. </li></ol> 4. בVivo Pretargeted PET הדמיה הערה: כמו בסעיף 3 לפרוטוקול, צעד זה של הפרוטוקול כרוך טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. קח את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעכבר נקבת athymic בעירום, שתל תת עורי 1 x 10 תאי סרטן מעי גס 6 SW1222 ולאפשר לגדול אלה לתוך xenograft 100-150 מ&quot;מ 3 (9-12 ימים לאחר חיסון). 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל aliquot של פתרון huA33-TCO מפרוטוקול סעיף 2 לריכוז של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 μl של פתרון huA33-TCO (100 מיקרוגרם) לוריד הזנב של עכבר xenograft נושאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 24 שעות לצבירת huA33-TCO בגידול של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את radioligand Cu-טז-BN-NOTA 64 לריכוז של 1.5 מיליליטר / MCI בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 μl של פתרון 64 Cu-טז-BN-NOTA radioligand (300 μCi; 11.1 MBq; 1.6 nmol של 64 Cu-טז-BN-נוטה, בהנחת פעילות ספציפית של 6.7 MBq / nmol) לוריד הזנב של עכברי נושאי xenograft. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת זמן ההדמיה הרצויה (למשל, 2, 6, 12, או 24 שעות לאחר הזרקה), להרדים את העכבר עם 2% isoflurane: תערובת גז חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על המיטה של ​​סורק PET בעלי החיים הקטן. לשמור על הרדמה במהלך הסריקה באמצעות isoflurane 1%: תערובת גז חמצן. לפני הצבת בעלי החיים על מיטת הסורק, ודא הרדמה בשיטת הבוהן הקמצוץ ולהחיל משחה וטרינרים לעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש נתונים PET לעכבר באמצעות סטטילסרוק עם מינימום של 20 מיליון אירועים חופפים באמצעות חלון אנרגיה של 350-700 קאב וחלון תזמון מקרי של 6 NSEC. לאחר השלים הרכישה של התמונה, לא עוזב את העכבר ללא השגחה ולא למקם אותו בכלוב עם עכברים אחרים עד שהוא חזר להכרה. </li></ol>

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).</li><li>Hollander, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies+for+cancer+therapy.">Bispecific antibodies for cancer therapy.</a> Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+pretargeting+in+mice+using+99mTc-labeled+morpholino,+a+DNA+analog.">Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).</li><li>Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeted+radioimmunotherapy+of+cancer:+Progress+step+by+step.">Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).</li><li>Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+pretargeting+advances+cancer+radioimmunodetection+and+radioimmunotherapy.">Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy.</a> Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).</li><li>Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeting:+taking+an+alternate+route+for+localizing+radionuclides.">Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides.</a> Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).</li><li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+delivery+of+radionuclides+for+imaging+and+therapy+of+cancer+using+pretargeting+methods.">Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods.</a> Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).</li><li>Schultz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tetravalent+single-chain+antibody-streptavidin+fusion+protein+for+pretargeted+lymphoma+therapy.">A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy.</a> Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).</li><li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy.">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pretargeted+PET+imaging+strategy+based+on+bioorthgonal+Diels-Alder+click+chemistry.">A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).</li><li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine+ligation:+fast+bioconjugation+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reactivity.">Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).</li><li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine/trans-cyclooctene+cycloaddition.">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).</li><li>Devaraj, N. K., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+tetrazine+cycloadditions.">Biomedical applications of tetrazine cycloadditions.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).</li><li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-based+cycloadditions:+application+to+pretargeted+live+cell+imaging.">Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).</li><li>Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yielding,+two-step+18F+labeling+strategy+for+18F-PARP1+inhibitors.">High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors.</a> ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).</li><li>Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+small-molecule+ligands+for+PARP1+imaging+in+living+cells.">Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells.</a> ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).</li><li>Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+in+vivo+imaging+of+a+18F-labeled+PARP1+inhibitor+using+a+chemically+orthogonal+scavenger-assisted+high-performance+method.">Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).</li><li>Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+synthesis+of+highly+reactive+dienophiles+for+the+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation.">Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).</li><li>Selvaraj, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+integrin+alpha(v)beta(3)+targeted+PET+tracer+based+on+a+cyclic+RGD+peptide.">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+18F+labeling+of+cysteine-containing+peptides+and+proteins+using+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation.">Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).</li><li>Han, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bioorthogonal+and+highly+efficient+conjugation+method+for+quantum+dots+using+tetrazine-norbornene+cycloaddition.">Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+strategy+for+the+construction+of+radiometalated+antibodies+for+positron+emission+tomography+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+click+chemistry.">Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).</li><li>Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+impact+of+bioorthogonal+click+chemistry+on+the+development+of+radiopharmaceuticals.">The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).</li><li>Reiner, T., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reaction+in+radiochemistry.">The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry.</a> Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+18-F+labeled+probes.">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes.</a> Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).</li><li>Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+a+series+of+1,2,4,5-tetrazines+for+bioorthogonal+conjugation.">Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).</li><li>Bosch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+strained+alkynes+for+Cu-free+click+reaction+in+live+mice.">Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice.</a> Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+chemisry+for+pretargeted+tumor+imaging+in+live+mice.">In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A33+antigen+displays+persistent+surface+expression.">A33 antigen displays persistent surface expression.</a> Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).</li><li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer.">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li><li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting:+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody.">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems.">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li><li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting.">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

היתרון העיקרי של אסטרטגית ההדמיה PET pretargeted הזה הוא שהוא מסוגל התוויית גידולים עם ניגודיות תמונת יעד לרקע בחלק קטן בלבד של מינון קרינת רקע המיוצר על ידי נוגדנים שכותרתו ישירות. לדוגמא, במערכת ההדמיה סרטן המעי הגס שתוארה כאן, נתונים מניסויי biodistribution חריפים הועסקו כדי לב...

בשלושים השנים האחרונות, טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) הפכה לכלי הכרחי קליני באבחון ובטיפול בסרטן. נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים פולטות פוזיטרונים לגידולים בשל זיקתם המעודנת והספציפיות לסמנים לסרטן. 1,2 הפרמקוקינטיקה עם זאת, איטית יחסית in vivo של נוגדנים מחייבת שימוש ברדיואיזוטופים עם multi-יום מחצית חיים פיזיים. שילוב זה יכול להניב מינוני קרינה גבוהה לאיברים שאינם היעד של חולים, סיבוך חשוב שיש משמעות קלינית בפרט מאז radioimmunoconjugates מוזרק לוריד ולכן - בניגוד סריקות CT הגוף חלקיים - תוצאה במינונים שקועים בכל חלק של הגוף, ללא קשר לרקמות נחקרו. כדי לעקוף בעיה זו, מאמץ משמעותי הוקדשה לdevelopment של אסטרטגיות ההדמיה PET שלנתק את הרדיו-איזוטופי ומחצית המיקוד, וכך למנף את מאפייני יתרון של נוגדנים תוך עוקפים בו-זמנית מגבלות pharmacokinetic הפנימיות שלהם. אסטרטגיות אלה - לרוב מכונות pretargeting או מיקוד רב שלבי - בדרך כלל להעסיק ארבעה שלבים: (1) מתן נוגדן מסוגל להיקשר גם אנטיגן וradioligand; ההצטברות של הנוגדן ברקמת המטרה והפינוי שלה מהדם (2); (3) הניהול של radioligand מולקולה קטנה; ו- (4) קשירת in vivo של radioligand לנוגדן ואחרי הפינוי המהיר של radioligand העודף. 3-8 בחלק מהמקרים, סולק נוסף מוזרקת בין השלבים 2 ו -3 כדי להאיץ את ההפרשה של כל נוגדן שעדיין לא מחייבים את הגידול ונשאר בדם. 5 באופן כללי, twסוגי o אסטרטגיות pretargeting הם נפוצים ביותר בספרות. בעוד שני הוכיחו מוצלחים במודלים פרה, הם גם בעלי מגבלות עיקריות שמנעו היישום הקליני שלהם. האסטרטגיה הראשונה מסתמכת על הזיקה הגבוהה בין נוגדני streptavidin מצומדות- וradiolabels-שונה ביוטין; עם זאת, immunogenicity של הנוגדנים-שונה streptavidin הוכיח להיות בעיה מדאיגה בכל קשור לתרגום. 5,6,9,10 האסטרטגיה השנייה, לעומת זאת, מעסיקה נוגדני bispecific כי כבר-מהונדס גנטי כדי לאגד את שני סרטן אנטיגן הסמן הביולוגי וhapten radiolabeled מולקולה קטנה. 3,11-14 בעוד המסלול אחרון זה בהחלט יצירתי, תחולתו הרחבה הוא מוגבלים על ידי מורכבות, חשבון, וחוסר המודולריות של המערכת. לאחרונה, פיתחנו ופרסמנו מתודולוגיה ההדמיה PET pretargeted מבוססים על ביקוש האלקטרון ההפוך דילס-Alder (אניאדה) תגובת cycloaddition בין -cyclooctene טרנס (TCO) וtetrazine (טז;. איור 1) 11 בעוד התגובה עצמו כבר ידוע במשך עשרות שנים, הכימיה IEDDA חוותה רנסנס בשנים האחרונות כטכניקת bioconjugation כימיה לחץ, כפי שמודגם על ידי העבודה המרתקת של הקבוצות של ראלף Weissleder, יוסף פוקס, ופיטר Conti בין יתר. 12-15 cycloaddition IEDDA יושם במגוון רחב של הגדרות, כולל הדמיה הקרינה עם פפטידים, נוגדנים, וחלקיקים, כמו גם הדמיה גרעינית . עם שני radiohalogens וradiometals 16-26 קשירה היא גבוהה מניב, נקייה, מהירה (k 1&gt; 30,000 M -1 שניות -1), סלקטיבי, ו-- ביקורתי -. Bioorthogonal 27 ובעוד מספר סוגים של כימיה לחץ - כולל cycloadditions-זרז Cu-אזיד alkyne, cycloadditions אזיד-alkyne-קידם מתח, וStaudinger ligations -. גם הוא bioorthogonal, זה שילוב הייחודי של קינטיקה מהירה תגובה וbioorthogonality שעושה כימיה IEDDA גם כך מתאים לpretargeting יישומים בכל האורגניזמים 28,29 לאורך שורות אלה, חשוב לשים לב כי לאחרונה דווח משלנו מעבדות לא היו הראשונה ליישם כימיה IEDDA לpretargeting: הדו&quot;ח הראשון של הדמיה pretargeted עם IEDDA נבעו מהעבודה של Rossin, et al והשתתפות מתודולוגיה SPECT העסקת 111 tetrazine שכותרתו ב- 30.. כפי שהזכרנו לעיל, יש מתודולוגיה pretargeting ארבעה צעדים פשוטים למדי (איור 2). בפרוטוקול ביד, אסטרטגית pretargeted להדמית PET של סרטן מעי גס שמעסיקה radioligand 64 שכותרתו Cu-NOTA tetrazine והמצומד שונה-TCO של נוגדן huA33 תתואר. עם זאת, בסופו של המודולריות של מתודולוגיה זו היא אחת מגרנכסי eatest, כמחצית -cyclooctene טרנס יכולים להיות מצורפים לכל נוגדן שאינה הפנמה, וtetrazine יכול להיות מחובר למגוון רחב של כתבים רדיואקטיביים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrazine NHS Ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764701</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-cyclooctene NHS Ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764523</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-NH2-Bn-NOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-601</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the bioorthogonal inverse electron demand diels-alder cycloaddition for pretargeted pet imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

שלושה שלבים הראשוניים של הניסוי - הסינתזה של TZ-BN-נוטה, נטיה של TCO לhuA33, וradiolabeling של TZ-BN-NOTA לבנות (איורים 3 ו -4) - הם אמין ביותר. במקרה של ההליך הנ&quot;ל, מבנה TZ-BN-NOTA היה מסונתז בתשואה גבוהה וטוהר. נוגדן huA33 היה שונה עם 4.2 ± 0.6 TCO / מב, וTZ-BN-NOTA היה radiolabeled עם 64 Cu ...

Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging at JoVE.com

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand. 

Video: Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

ראפיד סריקת אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה פותחת אפיקים חדשים עבור פרמטרים חשובים מבחינת פיזיולוגית ההדמיה<em&gt; In vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various factors affect the relaxation rates, such as buffer composition, solution pH, temperature, and magnetic field. In this last regard, the spin-lattice relaxation time can be measured at clinical field strengths, but at lower fields, where these compounds are dispensed from the polarizer and transported to the MRI, the relaxation is even faster and difficult to measure. To have a better understanding of the amount of magnetization lost during transport, we used fast field-cycling relaxometry, with magnetic resonance detection of 13C nuclei at ~0.75 T, to measure the nuclear magnetic resonance dispersion of the spin-lattice relaxation time of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Dissolution dynamic nuclear polarization was used to produce hyperpolarized samples of pyruvate at a concentration of 80 mmol/L and physiological pH (~7.8). These solutions were rapidly transferred to a fast field-cycling relaxometer so that relaxation of the sample magnetization could be measured as a function of time using a calibrated small flip angle (3&#176;-5&#176;). To map the T1 dispersion of the C-1 of pyruvate, we recorded data for different relaxation fields ranging between 0.237 mT and 0.705 T. With this information, we determined an empirical equation to estimate the spin-lattice relaxation of the hyperpolarized substrate within the mentioned range of magnetic fields. These results can be used to predict the amount of magnetization lost during transport and to improve experimental designs to minimize signal loss.

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

We present a protocol to measure the magnetic field dependence of the spin-lattice relaxation time of 13C-enriched compounds, hyperpolarized by means of dynamic nuclear polarization, using fast field-cycled relaxometry. Specifically, we have demonstrated this with [1-13C]pyruvate, but the protocol could be extended to other hyperpolarized substrates.

מדידת רשת ספין-סריג הרפיה השדה המגנטי של היפרקוטב [1-13ג] פיבט

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

הדמיית זרימת דם עם דופלר אולטרה מהיר

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Establishing an Octopus Ecosystem for Biomedical and Bioengineering Research

Many developments in biomedical research have been inspired by discovering anatomical and cellular mechanisms that support specific functions in different species. The octopus is one of these exceptional animals that has given scientists new insights into the fields of neuroscience, robotics, regenerative medicine, and prosthetics. Research with this species of cephalopods requires the set-up of complex facilities and intensive care for both the octopus and its ecosystem that is critical for the project&#39;s success. This system requires multiple mechanical and biological filtering systems to provide a safe and clean environment for the animal. Along with the control system, specialized routine maintenance and cleaning are required to effectively keep the facility operating long term. It is advised to provide an enriched environment to these intelligent animals by changing the tank&#39;s landscape, incorporating a variety of prey, and introducing challenging tasks for them to work through. Our results include MRI and a whole-body autofluorescence imaging as well as behavioral studies to better understand their nervous system. Octopuses possess unique physiology that can impact many areas of biomedical research. Providing them with a sustainable ecosystem is the first crucial step in uncovering their distinct capabilities.

Understanding the unique physiological and anatomical structures of octopuses can greatly impact biomedical research. This guide demonstrates how to set-up and maintain a marine environment to accommodate this species and includes state-of-the-art imaging and analytical approaches to visualize octopus' nervous system anatomy and function.

הקמת מערכת אקולוגית של תמנון למחקר ביו-רפואי וביו-הנדסה

Many developments in biomedical research have been inspired by discovering anatomical and cellular mechanisms that support specific functions in different ...

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, an abundant supply of AAAs is important for cancer cells to maintain their rapid growth and division. With this, there is a rising demand for a highly specific, noninvasive imaging approach with minimal sample preparation to directly visualize how cells harness AAAs for their metabolism in situ. Here, we develop an optical imaging platform that combines deuterium oxide (D2O) probing with stimulated Raman scattering (DO-SRS) and integrates DO-SRS with two-photon excitation fluorescence (2PEF) into a single microscope to directly visualize the metabolic activities of HeLa cells under AAA regulation. Collectively, the DO-SRS platform provides high spatial resolution and specificity of newly synthesized proteins and lipids in single HeLa cell units. In addition, the 2PEF modality can detect autofluorescence signals of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin in a label-free manner. The imaging system described here is compatible with both in vitro and in vivo models, which is flexible for various experiments. The general workflow of this protocol includes cell culture, culture media preparation, cell synchronization, cell fixation, and sample imaging with DO-SRS and 2PEF modalities.

We present a protocol to directly visualize metabolic activities in cells regulated by amino acids using deuterium-oxide (heavy water D2O) probed stimulated Raman scattering (DO-SRS) microscopy, which is integrated with two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEF).

הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

ניתוח התכווצות הלב של דגי זברה עם אינטראקציית מציאות מדומה

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

מחבר זרקור: דימות גיליון אור ברזולוציה גבוהה 4D ומציאות מדומה בדגי זברה לניתוח תא יחיד של תפקוד הלב

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...