The authors thank Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico, and Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty for helpful conversations and the NIH for funding (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

ÉTHIQUE DECLARATION: Toutes les expériences in vivo d&#39;animaux décrits ont été réalisés selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques de la Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité (IACUC). 1. Synthèse de Tz-Bn-NOTA <ol><li> Dans un petit récipient de réaction, dissoudre 7 mg NH 2 Bn-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) dans 600 ul NaHCO 3 tampon (0,1 M, pH 8,1). Vérifier le pH de la solution. Si nécessaire, ajuster le pH de la solution à 8,1 en utilisant de petites fractions aliquotes de 0,1 M de Na 2 CO 3. </li><li> Ajouter la solution de NH 2 Bn-NOTA à 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) dans un tube de microcentrifugation de 1,7 ml. NOTE: Le TZ-NHS peut soit être pesé à sec ou ajouté à partir d&#39;une solution mère de DMF sec ou le DMSO (&lt;50 pi). </li><li> Laisser la solution de réaction résultant réagir pendant 30 min à température ambianteavec une légère agitation. </li><li> Après 30 min, purifier le produit en utilisant C Chromatographie 18 HPLC en phase inverse pour enlever ne ayant pas réagi NH 2 Bn-NOTA. Le NH 2 Bn-NOTA peut être contrôlé à une longueur d&#39;onde de 254 nm, tandis que le Tz-NHS et Tz-Bn-NOTA sont mieux suivis à une longueur d&#39;onde de 525 nm. NOTE: Les temps de rétention sont évidemment fortement tributaire de la configuration de l&#39;équipement de HPLC de chaque laboratoire (pompes, colonnes, tubes, etc.). Toutefois, pour présenter un exemple, si un gradient de 0: 100 MeCN / H 2 O (tous deux avec 0,1% de TFA) à 100: 0 MeCN / H 2 O de plus de 25 min et une 4,6 x 250 mm C 18 colonne d&#39;analyse est utilisé Les temps de rétention des Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, et NH 2 Bn-NOTA, à environ 15 min, 16,5 min et 10 min, respectivement. Le produit peut être purifié à partir des autres composants de la réaction, soit dans un seul passage ou plusieurs passages en utilisant une colonne semi-préparative HPLC preparative ou C 18. 1 H-RMN, analytical HPLC et ESI-MS sont toutes des méthodes qui peuvent être utilisées pour vérifier la pureté du précurseur Tz-Bn-NOTA terminé. 11 </li><li> Geler l&#39;éluant HPLC recueillies à l&#39;aide de l&#39;azote liquide. </li><li> Enroulez le tube de prélèvement congelé dans de l&#39;aluminium opaque. </li><li> Placer le tube de collecte congelé dans un récipient de lyophilisation O / N pour supprimer la phase mobile de CLHP. </li><li> Stocker le produit purifié (un rose vif solide) dans l&#39;obscurité à -80 ° C. NOTE: Ce est un point d&#39;arrêt acceptable dans la procédure. Le précurseur Tz-Bn-NOTA complété est stable pendant au moins 1 an dans ces conditions. </li></ol> 2. Préparation de huA33-TCO Immunoconjugué <ol><li> Dans un tube de 1,7 ml à centrifuger, préparer un 1 mg / ml (2,7 mM) solution de TCO-NHS dans du DMF sec. </li><li> Dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 ml, préparer une 2 mg / ml (13,3 uM) de huA33 solution dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-, </sub&gt; 0,154 M de NaCl). </li><li> En utilisant de petites fractions aliquotes (&lt;5 pi) de 0,1 M de Na 2 CO 3, ajuster le pH de la solution d&#39;anticorps à 8,8 à 9,0. Utilisez soit papier pH ou un pH-mètre avec une microélectrode de contrôler le pH, et faire attention de ne pas laisser le pH à élever au-dessus de pH 9,0. </li><li> Une fois la solution d&#39;anticorps est à la bonne pH, ajouter un volume de la solution NHS-TCO correspondant à huit équivalents molaires de l&#39;ester activé. Par exemple, ajouter 7,9 pi de la solution à 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) pour les 1 ml de solution à 2 mg / ml d&#39;anticorps huA33 (1,33 x 10 -8 mol huA33). Ne pas dépasser 5% de DMF en volume dans la solution. </li><li> Mélanger doucement la solution en inversant le tube à centrifuger à plusieurs reprises. </li><li> Enroulez le microtube dans une feuille d&#39;aluminium opaque. </li><li> Laisser la solution à incuber pendant 1 heure à température ambiante avec une légère agitation. </li><li> Après 1 heure à température ambiante, purifier l&#39;immunoconjugué résultant en utilisant un siz jetable pré-emballése exclusion sur une colonne de dessalage. Premièrement, rincer la colonne d&#39;exclusion de taille comme décrit par le fournisseur pour enlever les conservateurs présents sur la colonne pendant le stockage. Ensuite, ajouter le mélange réactionnel à la colonne d&#39;exclusion de taille, rincer la colonne avec 1,5 ml de solution saline stérile à 0,9%, et ensuite récupérer le produit en utilisant 2 ml de solution saline stérile à 0,9% comme éluant. NOTE: Cette étape donnera l&#39;huA33-TCO complété comme une solution 2 ml. </li><li> Mesurer la concentration de la résultante huA33-TCO sur un spectrophotomètre UV-Vis. </li><li> Si une concentration plus élevée est souhaitée, concentrer la solution huA33-TCO l&#39;aide d&#39;une unité de filtration centrifuge avec un poids moléculaire 50.000 cut-off. NOTE: Il est important de noter que tandis que huA33 et une variété d&#39;autres anticorps bien connus (par exemple, le bevacizumab, le trastuzumab, le cetuximab, et J591) sont très tolérants d&#39;être concentrée, agrégation et la précipitation peuvent se produire lors de la concentration dans les autres cas. Les chercheurs de tenter cette Procedure avec un nouvel anticorps doit faire confiance à la littérature ou leur propre connaissance de l&#39;anticorps en question quant à savoir si ou non de concentrer l&#39;anticorps. </li><li> Rangez la immunoconjugué huA33-TCO complété à 4 ° C dans l&#39;obscurité. NOTE: Ce est un point d&#39;arrêt acceptable dans la procédure. Le conjugué mAb-TCO complété doit être stable pendant au moins trois mois dans ces conditions de stockage. </li></ol> 3. 64 Cu Radiomarquage de Tz-Bn-NOTA Remarque: cette étape du protocole impliquant le traitement et la manipulation de radioactivité. Avant d&#39;effectuer ces étapes - ou effectuer d&#39;autres travaux par la radioactivité - les chercheurs devraient consulter avec le Département de la radioprotection de leur établissement d&#39;origine. Prendre toutes les mesures possibles pour minimiser l&#39;exposition aux rayonnements ionisants. <ol><li> Dans un tube de 1,7 ml à centrifuger, préparer un 0,5 mg / ml (723 uM) solution de Tz-Bn-NOTA. </li><li> Dans une 1,7 ml MicroCTube entrifuge, ajouter 10 ul de la solution Tz-Bn-NOTA (5 ug) à 400 ul de 0,2 M de NH 4 OAc tampon pH 5,5. </li><li> Dans l&#39;intérêt de la note tenue radiochimique appropriée, mesurer et enregistrer la quantité de radioactivité dans l&#39;échantillon en utilisant un calibrateur de dose avant et après les étapes qui ont suivi dans le protocole ci-dessous (03.04 à 03.08). Cela aidera à la détermination précise des rendements radiochimiques. </li><li> Ajouter 2,000 uCi (74 MBq) de 64 Cu à la solution Tz-Bn-NOTA. NOTE: En règle générale, [64 Cu] CuCl 2 est fourni dans un petit volume (&lt;30 pi) de 0,1 N HCl, et donc que de petits volumes (&lt;10 pi) de cette solution d&#39;achat d&#39;actions sont nécessaires pour la réaction de radiomarquage. Si de plus grands volumes de la [64 Cu] CuCl 2 actions sont nécessaires, la réaction de radiomarquage est tolérant d&#39;augmenter le volume global de la réaction. Cependant, le pH de la solution de réaction de radiomarquage doit être surveillée avec soin pour garantirqu&#39;il ne tombe pas en dessous de pH 4,0. </li><li> Laisser la solution à incuber pendant 10 min à température ambiante avec une légère agitation. </li><li> Après 10 min d&#39;incubation, purifier le produit en utilisant 18 C chromatographie HPLC en phase inverse. Les temps de rétention sont évidemment fortement dépendant de la configuration de l&#39;équipement de HPLC de chaque laboratoire (pompes, colonnes, tubes, etc.). Toutefois, pour présenter un exemple, si un gradient de 5:95 MeCN / H 2 O (tous deux avec 0,1% de TFA) à 95: 5 MeCN / H 2 O de plus de 15 min est utilisé, le temps de rétention de 64 Cu-Tz- Bn-NOTA devrait être autour de 9,8 min alors libre, non complexée 64 Cu sera élue avec le front du solvant à environ 2-4 min. </li><li> En utilisant un évaporateur rotatif, retirer l&#39;éluant HPLC. </li><li> Reprendre le produit 64 Cu-Tz-Bn-NOTA 0,9% dans une solution saline stérile. NOTE: Compte tenu de l&#39;12,7 h demi-vie physique de 64 Cu, ce ne est pas un point d&#39;arrêt acceptable dans la procédure. Effectuer la synthèse de 64 Cu-Tz-Bn-PASA immédiatement avant l&#39;injection du radioligand, et suivez l&#39;étape par étape immédiatement 3,7 4,5. </li></ol> 4. En Vivo préalablement visées PET Imaging Remarque: Comme dans la section Protocole 3, cette étape du protocole impliquant le traitement et la manipulation de radioactivité. Avant d&#39;effectuer ces étapes chercheurs devraient consulter avec le Département de la radioprotection de leur établissement d&#39;origine. Prendre toutes les mesures possibles pour minimiser l&#39;exposition aux rayonnements ionisants. <ol><li> Dans une souris nude athymiques femelles, implant sous-cutanée 1 x 10 cellules du cancer du côlon SW1222 de 6 et de permettre à ceux-ci se développent dans une xénogreffe de 100 à 150 mm 3 (9 à 12 jours après l&#39;inoculation). 11 </li><li> Diluer une partie aliquote de la solution huA33-TCO de service du protocole 2 à une concentration de 0,5 mg / ml dans 0,9% de solution saline stérile. </li><li> Injecter 200 ul de la solution huA33-TCO (100 pg) dans la veine caudale de la souris portant une xénogreffe. </li><li> Autoriser 24 h pour l&#39;accumulation de la huA33-TCO dans la tumeur de la souris. </li><li> On dilue le 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand à une concentration de 1,5 mCi / ml dans 0,9% de solution saline stérile. </li><li> Injecter 200 ul de la solution de ligand radioactif Cu-Tz-Bn-NOTA 64 (300 uCi; 11,1 MBq; 1,6 nmol de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, en supposant une activité spécifique de 6,7 MBq / nmol) dans la veine caudale de la xénogreffe-souris porteuses. </li><li> Au point de temps d&#39;imagerie désiré (par exemple, 2, 6, 12, ou 24 heures après l&#39;injection), Anesthésier la souris avec un isoflurane 2%: mélange de gaz d&#39;oxygène. </li><li> Placer la souris sur le lit de la petite scanner TEP animale. Maintenir l&#39;anesthésie pendant l&#39;analyse en utilisant un 1% d&#39;isoflurane: mélange de gaz d&#39;oxygène. Avant de placer l&#39;animal sur la vitre du scanner, vérifiez l&#39;anesthésie selon la méthode toe-pincement et appliquer une pommade vétérinaire aux yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant l&#39;anesthésie. </li><li> Acquérir les données PET pour la souris via un statiquebalayer avec un minimum de 20 millions d&#39;événements coïncidents à l&#39;aide d&#39;une fenêtre d&#39;énergie de 350-700 keV et une fenêtre de cadencement de coïncidence de 6 nanosecondes. Après avoir complété l&#39;acquisition de l&#39;image, ne laissez pas la souris sans surveillance et ne pas le placer dans une cage avec les autres souris jusqu&#39;à ce qu&#39;il a repris conscience. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer.">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li><li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting:+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody.">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems.">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li><li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting.">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le principal avantage de cette stratégie d&#39;imagerie par PET préalablement visées, ce est qu&#39;il est capable de délimiter les tumeurs avec la cible et le contraste de l&#39;image en arrière-plan seulement une fraction de la dose de rayonnement d&#39;arrière-plan produit par les anticorps directement marqués. Par exemple, dans le système d&#39;imagerie du cancer colorectal décrit ici, les données provenant des expériences de biodistribution aiguë ont été utilisées pour effectuer des calculs de dosim?...

Au cours des trente dernières années, la tomographie par émission de positons (TEP) est devenu un outil clinique indispensable dans le diagnostic et le traitement du cancer. Des anticorps ont longtemps été considérés comme des vecteurs prometteurs pour la livraison de radio-isotopes émettant des positrons à des tumeurs en raison de leur affinité exquise et la spécificité de biomarqueurs du cancer. 1,2 Toutefois, le relativement lents pharmacocinétique in vivo d&#39;anticorps obligatoire l&#39;utilisation de radio-isotopes avec multi-jours demi-vies physiques. Cette combinaison peut donner de fortes doses de rayonnement aux organes non-cibles de patients, une complication importante qui est d&#39;une importance particulière clinique depuis radioimmunoconjugués sont injectés par voie intraveineuse et donc - contrairement partielles scans corps CT - résultat dans doses absorbées dans chaque partie du corps, quels que soient les tissus interrogés. Afin de contourner ce problème, des efforts importants ont été consacrés à l&#39;dévepement de stratégies d&#39;imagerie PET dissociant le radio-isotope et la fraction de ciblage, se appuyant ainsi les propriétés avantageuses des anticorps en longeant simultanément leurs limites pharmacocinétiques intrinsèques. Ces stratégies - le plus souvent appelés préciblage ou ciblage en plusieurs étapes - utiliser habituellement quatre étapes: (1) l&#39;administration d&#39;un anticorps capable de se lier à la fois un antigène et un radioligand; (2) l&#39;accumulation de l&#39;anticorps dans le tissu cible et de son dégagement à partir du sang; (3) l&#39;administration d&#39;une petite radioligand molécule; et (4) la ligature in vivo du ligand radioactif à l&#39;anticorps suivie de la clairance rapide de l&#39;excès de radioligand. 8.3 Dans certains cas, un agent de compensation supplémentaire est injecté entre les étapes 2 et 3 de façon à accélérer l&#39;excrétion de tout anticorps qui n&#39;a pas encore d&#39;engager la tumeur et reste dans le sang. 5 D&#39;une manière générale, two préciblage types de stratégies sont les plus répandus dans la littérature. Bien que les deux ont fait leurs preuves dans des modèles précliniques, ils possèdent aussi des limites clés qui ont empêché leur applicabilité clinique. La première stratégie se appuie sur la forte affinité entre les anticorps de streptavidine conjugué et radiomarqueurs de biotine modifiée; cependant, l&#39;immunogénicité des anticorps de streptavidine modifiée se est avérée être un problème préoccupant en ce qui concerne la traduction. 5,6,9,10 La seconde stratégie, au contraire, utilise des anticorps bispécifiques qui ont été modifiés par génie génétique pour se lier à la fois un cancer antigène de biomarqueurs et un petit haptène radiomarqué molécule. 3,11-14 Bien que cette dernière voie est certainement créatif, sa large applicabilité est limitée par la complexité, le coût et le manque de modularité du système. Récemment, nous avons élaboré et publié une méthode d&#39;imagerie PET préalablement visées sur la base de la demande d&#39;électrons inverse de Diels-Alder (IEDDA) de réaction de cycloaddition entre -cyclooctene trans (TCO) et tétrazine (Tz;. Figure 1) 11 Bien que la réaction se est connu depuis des décennies, IEDDA chimie a connu une renaissance au cours des dernières années comme une technique de bioconjugaison click chemistry, comme illustré par le travail fascinant des groupes de Ralph Weissleder, Joseph Fox et Peter Conti entre autres. 12-15 Le IEDDA cycloaddition a été appliquée dans un large éventail de paramètres, y compris l&#39;imagerie de fluorescence avec des peptides, des anticorps, et des nanoparticules ainsi que l&#39;imagerie nucléaire . avec les deux radiohalogens et radiométaux 16-26 La ligature est un rendement élevé, propre, rapide (k 1&gt; 30000 M -1 sec -1), sélective et - critique -. bioorthogonal 27 Et si un certain nombre de types de chimie clic - y compris azoture alcyne cycloadditions de Cu-catalysée, cycloadditions azoture-alcyne contrainte promu, et Staudinger ligations -. bioorthogonal sont ainsi, ce est la combinaison unique de la cinétique de réaction rapides et bioorthogonality qui rend IEDDA chimie si bien adapté à préciblage applications dans des organismes entiers 28,29 long de ces lignes, il est important de noter que le récent rapport de notre laboratoires ne était pas le premier à appliquer IEDDA chimie pour préciblage: le premier rapport de l&#39;imagerie préalablement visées avec IEDDA née du travail de Rossin, et al et a présenté une méthodologie SPECT utilisant un 111 tétrazine Dans marqué 30.. Comme nous avons discuté ci-dessus, la méthodologie préciblage comporte quatre étapes assez simples (figure 2). Dans le protocole à portée de main, une stratégie préalablement visées pour l&#39;imagerie PET du cancer colorectal qui emploie une Cu-NOTA radioligand marqué 64 de tétrazine et un conjugué TCO modifiée de l&#39;anticorps huA33 va être décrit. Cependant, en fin de compte la modularité de cette méthodologie est l&#39;un de ses gractifs en mangeras, que la fraction -cyclooctene trans peuvent être ajoutés à tout anticorps non-internalisation et l&#39;tétrazine peuvent être attachés à une grande variété de journalistes radioactives.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrazine NHS Ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764701</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-cyclooctene NHS Ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764523</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-NH2-Bn-NOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-601</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the bioorthogonal inverse electron demand diels-alder cycloaddition for pretargeted pet imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Les trois premières étapes de l&#39;expérience - la synthèse de Tz-Bn-NOTA, la conjugaison du TCO huA33 et le radiomarquage de la Tz-Bn-NOTA construire (figures 3 et 4) - sont très fiables. Dans le cas de la procédure ci-dessus, le produit d&#39;assemblage Tz-Bn-NOTA a été synthétisé avec un rendement élevé et de pureté. L&#39;anticorps huA33 a été modifié avec 4,2 ± 0,6 TCO / mAb et Tz-Bn-NOTA était marqué à 64 Cu pour donner le radioligand purifié dans&...

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Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

Exploiter la demande Bioorthogonal inverse Electron Diels-Alder Cycloaddition pour préalablement visées PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K vues.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand. 