The authors thank Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico, and Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty for helpful conversations and the NIH for funding (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

ÉTICA DECLARACIÓN: Todos los experimentos con animales en vivo descritos fueron realizados de acuerdo con un protocolo aprobado y bajo las directrices éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. Síntesis de Tz-Bn-NOTA <ol><li> En un pequeño recipiente de reacción, se disuelven 7 mg NH 2--Bn NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) en 600 l de NaHCO3 tampón (0,1 M, pH 8,1). Comprobar el pH de la solución. Si es necesario, ajustar el pH de la solución a 8,1 usando pequeñas alícuotas de 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Añadir la solución de NH 2--Bn NOTA a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. NOTA: El Tz-NHS o bien se puede pesar a cabo en seco o se añade de una solución madre de DMF seco o DMSO (&lt;50 l). </li><li> Dejar que la solución de reacción resultante reaccionara durante 30 min a RTcon agitación suave. </li><li> Después de 30 min, purificar el producto mediante cromatografía de C 18 HPLC de fase inversa para eliminar sin reaccionar NH 2--Bn NOTA. El NH 2 -Bn-NOTA puede ser monitoreado en una longitud de onda de 254 nm, mientras que el Tz-NHS y Tz-Bn-NOTA están mejor controlados a una longitud de onda de 525 nm. NOTA: Los tiempos de retención son, evidentemente, muy dependiente de la configuración del equipo de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.). Sin embargo, para presentar un ejemplo, si un gradiente de 0: 100 MeCN / H 2 O (ambos con 0,1% TFA) a 100: 0 MeCN / H 2 O durante 25 min y una columna analítica 4,6 x 250 mm C 18 se utiliza , los tiempos de retención de Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, y NH-2 -Bn NOTA será de alrededor de 15 min, 16,5 min y 10 min, respectivamente. El producto puede ser purificado de los otros componentes de la reacción, ya sea en una sola carrera o carreras múltiples utilizando una columna de HPLC C 18 semi-preparativa o preparativa. 1 H-NMR, analytical HPLC y ESI-MS son todos los métodos que se pueden utilizar para verificar la pureza del precursor Tz-Bn-NOTA completado. 11 </li><li> Congelar el eluyente HPLC recogido utilizando nitrógeno líquido. </li><li> Envolver el tubo de recogida de congelados en papel de aluminio opaca. </li><li> Colocar el tubo de recogida congelado en un recipiente de liofilización de O / N para eliminar la fase móvil de HPLC. </li><li> Almacenar el producto purificado (un rosa brillante sólido) en la oscuridad a -80 ° C. NOTA: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El precursor Tz-Bn-NOTA completado es estable durante al menos 1 año en estas condiciones. </li></ol> 2. Preparación de huA33-TCO Inmunoconjugado <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 1 mg / ml (2,7 mM) de solución TCO-NHS en DMF seca. </li><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 2 mg / ml (13,3 mM) de huA33 en 1 ml de tampón fosfato salino, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-, </sub&gt; 0,154 M NaCl). </li><li> El uso de pequeñas alícuotas (&lt;5 mu l) de 0,1 M Na 2 CO 3, ajustar el pH de la solución de anticuerpo a 8,8-9,0. Utilice papel de pH o un medidor de pH con un microelectrodo para monitorear el pH, y tener cuidado de no permitir que el pH se eleve por encima de pH 9,0. </li><li> Una vez que la solución de anticuerpo está en el pH correcto, añadir un volumen de la solución TCO-NHS correspondiente a 8 equivalentes molares del éster activado. Por ejemplo, añadir 7,9 l de la solución de 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) a los 1 ml de solución de 2 mg / ml de anticuerpo huA33 (1,33 x 10 -8 mol huA33). No superar el 5% de DMF en volumen en la solución. </li><li> Mezclar suavemente la solución invirtiendo el tubo de microcentrífuga varias veces. </li><li> Envuelva el tubo de microcentrífuga en papel de aluminio opaco. </li><li> Deje que la solución se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Después de 1 hora a temperatura ambiente, purificar el inmunoconjugado resultante utilizando un siz desechable preenvasadose exclusión columna de desalación. En primer lugar, enjuagar la columna de exclusión de tamaño como se describe por el proveedor para eliminar cualquier conservantes presentes en la columna durante el almacenamiento. A continuación, añadir la mezcla de reacción a la columna de exclusión por tamaño, enjuagar la columna con 1.5 ml 0.9% de solución salina estéril, y posteriormente recoger el producto usando 2 ml de 0,9% de solución salina estéril como eluyente. NOTA: Este paso será dar el terminado huA33-TCO como una solución de 2 ml. </li><li> Medir la concentración de la resultante huA33-TCO en un espectrofotómetro UV-Vis. </li><li> Si se desea una mayor concentración, concentrar la solución huA33-TCO utilizando una unidad de filtro centrífugo con un peso molecular 50.000 de corte. NOTA: Es importante observar que mientras que huA33 y una variedad de otros anticuerpos conocidos (por ejemplo, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, y J591) son muy tolerantes de concentrarse, la agregación y la precipitación pueden ocurrir después de la concentración en otros casos. Los investigadores de intentar este procedUre con un nuevo anticuerpo debe confiar en la literatura o su propio conocimiento del anticuerpo en cuestión con respecto a si es o no concentrar el anticuerpo. </li><li> Guarde el inmunoconjugado huA33-TCO completado a 4 ° C en la oscuridad. NOTA: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El conjugado de mAb-TCO completado debe ser estable durante al menos 3 meses en estas condiciones de almacenamiento. </li></ol> 3. 64 Cu radiomarcaje de Tz-Bn-NOTA NOTA: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos - o la realización de cualquier otro trabajo con radiactividad - investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante. <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 0,5 mg / ml (723 mM) de solución de Tz-Bn-NOTA. </li><li> En una MicroC 1,7 mltubo entrifuge, añadir 10 l de la solución Tz-Bn-NOTA (5 mg) a 400 l de NH4OAc 0,2 M, pH 5,5. </li><li> En aras de la radioquímica nota de mantenimiento de la correcta, medir y registrar la cantidad de radiactividad en la muestra usando un calibrador de dosis antes y después de los pasos siguientes en el protocolo a continuación (3.4 a 3.8). Esto le ayudará con la determinación precisa de los rendimientos de radioquímica. </li><li> Agregar 2000 Ci (74 MBq) de 64 Cu a la solución Tz-Bn-NOTA. NOTA: Típicamente, [64 Cu] CuCl 2 se suministra en un volumen pequeño (&lt;30 l) de HCl 0,1 N, y por tanto sólo pequeños volúmenes (&lt;10 l) de esta solución madre se necesitan para la reacción de radiomarcado. Si se necesitan mayores volúmenes de la [64 Cu] CuCl 2 stock, la reacción de radiomarcaje es tolerante de aumentar el volumen de reacción total. Sin embargo, el pH de la solución de reacción de radiomarcaje debe controlarse cuidadosamente para asegurarque no caiga por debajo de pH 4,0. </li><li> Deje que la solución se incuba durante 10 min a TA con agitación suave. </li><li> Después de 10 min de incubación, purificar el producto mediante cromatografía de HPLC de fase inversa C 18. Los tiempos de retención son, evidentemente, muy dependiente de la configuración del equipo de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.). Sin embargo, para presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN / H 2 O (ambos con 0,1% TFA) a 95: 5 MeCN / H 2 O durante 15 min se utiliza, el tiempo de retención de 64 Cu-Tz- Bn-NOTA debe estar alrededor de 9,8 minutos, mientras gratis, no acomplejada 64 Cu eluirá con el frente del disolvente en torno a 2-4 min. </li><li> Usando un evaporador rotatorio, retire el eluyente HPLC. </li><li> Se vuelve a disolver el producto 64 Cu-Tz-Bn-nota en el 0,9% de solución salina estéril. NOTA: Dado el 12,7 hr vida media física de 64 Cu, esto no es un punto de parada aceptable en el procedimiento. Realizar la síntesis de 64 Cu-Tz-Bn-NOA inmediatamente antes de la inyección del radioligando, y seguir paso a paso inmediatamente 3,7 4,5. </li></ol> 4. En Vivo Pretargeted TEP NOTA: Como en la sección Protocolo 3, este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante. <ol><li> En un ratón atímicos hembra, implante subcutáneamente 1 x 10 células de cáncer colorrectal 6 SW1222 y permita que éstas se conviertan en un xenotrasplante 100-150 mm 3 (9-12 días después de la inoculación). 11 </li><li> Diluir una alícuota de la solución huA33-TCO de la sección Protocolo 2 a una concentración de 0,5 mg / ml en 0,9% de solución salina estéril. </li><li> Inyectar 200 l de la solución huA33-TCO (100 g) en la vena de la cola del ratón de xenoinjerto de soporte. </li><li> Permita 24 horas para la acumulación de la huA33-TCO en el tumor del ratón. </li><li> Diluir el 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligando a una concentración de 1,5 mCi / ml en 0,9% de solución salina estéril. </li><li> Inyectar 200 l de la solución de radioligando Cu-Tz-Bn-NOTA 64 (300 Ci; 11,1 MBq; 1,6 nmol de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, asumiendo una actividad específica de 6,7 MBq / nmol) en la vena de la cola de la xenoinjerto ratones portadores. </li><li> En el punto de tiempo de formación de imágenes deseado (por ejemplo, 2, 6, 12, o 24 horas después de la inyección), anestesiar al ratón con un isoflurano 2%: mezcla de gas de oxígeno. </li><li> Coloque el ratón sobre la cama del pequeño escáner PET animal. Mantener la anestesia durante el análisis utilizando un isoflurano al 1%: mezcla de gas de oxígeno. Antes de colocar el animal en el escáner, verifique la anestesia utilizando el método del dedo del pie-pinch y aplicar ungüento veterinario a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la anestesia. </li><li> Adquirir los datos de PET para el ratón a través de una estáticaescanear con un mínimo de 20 millones de eventos coincidentes utilizando una ventana de energía de 350-700 keV y una ventana de tiempo coincidencia de 6 nseg. Después de completar la adquisición de la imagen, no deje el ratón sin atención y no lo coloque en una jaula con otros ratones hasta que se haya recuperado la conciencia. </li></ol>

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).</li><li>Hollander, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies+for+cancer+therapy.">Bispecific antibodies for cancer therapy.</a> Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+pretargeting+in+mice+using+99mTc-labeled+morpholino,+a+DNA+analog.">Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).</li><li>Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeted+radioimmunotherapy+of+cancer:+Progress+step+by+step.">Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).</li><li>Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+pretargeting+advances+cancer+radioimmunodetection+and+radioimmunotherapy.">Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy.</a> Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).</li><li>Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeting:+taking+an+alternate+route+for+localizing+radionuclides.">Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides.</a> Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).</li><li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+delivery+of+radionuclides+for+imaging+and+therapy+of+cancer+using+pretargeting+methods.">Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods.</a> Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).</li><li>Schultz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tetravalent+single-chain+antibody-streptavidin+fusion+protein+for+pretargeted+lymphoma+therapy.">A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy.</a> Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).</li><li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy.">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pretargeted+PET+imaging+strategy+based+on+bioorthgonal+Diels-Alder+click+chemistry.">A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).</li><li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine+ligation:+fast+bioconjugation+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reactivity.">Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).</li><li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine/trans-cyclooctene+cycloaddition.">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).</li><li>Devaraj, N. K., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+tetrazine+cycloadditions.">Biomedical applications of tetrazine cycloadditions.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).</li><li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-based+cycloadditions:+application+to+pretargeted+live+cell+imaging.">Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).</li><li>Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yielding,+two-step+18F+labeling+strategy+for+18F-PARP1+inhibitors.">High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors.</a> ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).</li><li>Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+small-molecule+ligands+for+PARP1+imaging+in+living+cells.">Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells.</a> ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).</li><li>Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+in+vivo+imaging+of+a+18F-labeled+PARP1+inhibitor+using+a+chemically+orthogonal+scavenger-assisted+high-performance+method.">Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).</li><li>Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+synthesis+of+highly+reactive+dienophiles+for+the+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation.">Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).</li><li>Selvaraj, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+integrin+alpha(v)beta(3)+targeted+PET+tracer+based+on+a+cyclic+RGD+peptide.">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+18F+labeling+of+cysteine-containing+peptides+and+proteins+using+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation.">Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).</li><li>Han, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bioorthogonal+and+highly+efficient+conjugation+method+for+quantum+dots+using+tetrazine-norbornene+cycloaddition.">Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+strategy+for+the+construction+of+radiometalated+antibodies+for+positron+emission+tomography+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+click+chemistry.">Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).</li><li>Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+impact+of+bioorthogonal+click+chemistry+on+the+development+of+radiopharmaceuticals.">The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).</li><li>Reiner, T., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reaction+in+radiochemistry.">The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry.</a> Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+18-F+labeled+probes.">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes.</a> Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).</li><li>Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+a+series+of+1,2,4,5-tetrazines+for+bioorthogonal+conjugation.">Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).</li><li>Bosch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+strained+alkynes+for+Cu-free+click+reaction+in+live+mice.">Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice.</a> Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+chemisry+for+pretargeted+tumor+imaging+in+live+mice.">In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A33+antigen+displays+persistent+surface+expression.">A33 antigen displays persistent surface expression.</a> Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).</li><li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer.">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li><li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting:+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody.">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems.">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li><li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting.">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La principal ventaja de esta estrategia de formación de imágenes PET pretargeted es que es capaz de delinear los tumores con contraste de la imagen-objetivo a fondo a sólo una fracción de la dosis de radiación de fondo producida por los anticuerpos marcados directamente. Por ejemplo, en el sistema de imágenes de cáncer colorrectal se describe aquí, se emplearon datos de los experimentos de biodistribución agudos para realizar cálculos de dosimetría para la estrategia de predireccionamiento a base de Cu 6...

Durante los últimos treinta años, la tomografía por emisión de positrones (PET) se ha convertido en una herramienta clínica indispensable en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Los anticuerpos han sido considerados vectores prometedores para la entrega de radioisótopos emisores de positrones a los tumores debido a su exquisita afinidad y especificidad para biomarcadores de cáncer. 1,2 farmacocinética Sin embargo, la relativamente lentos in vivo de anticuerpos ordena el uso de radioisótopos con multi-día semividas físicas. Esta combinación puede producir altas dosis de radiación a los órganos que no son objeto de los pacientes, una complicación importante que es de particular importancia clínica ya radioinmunoconjugados se inyectaron por vía intravenosa, por lo que - a diferencia de las tomografías computarizadas cuerpo parciales - resultado en dosis absorbidas en cada parte del cuerpo, independientemente de los tejidos interrogados. Para evitar este problema, esfuerzo significativo se ha dedicado a la desallo de estrategias de formación de imágenes de PET que desacoplar el radioisótopo y el resto de dirección, aprovechando así las propiedades ventajosas de anticuerpos bordeando simultáneamente sus limitaciones intrínsecas farmacocinéticos. Estas estrategias - más a menudo denominados predireccionamiento o focalización de varios pasos - emplean típicamente cuatro pasos: (1) la administración de un anticuerpo capaz de unirse tanto un antígeno y un radioligando; (2) la acumulación del anticuerpo en el tejido diana y su aclaramiento de la sangre; (3) la administración de una pequeña molécula de radioligando; y (4) la ligación in vivo del radioligando con el anticuerpo seguido por la rápida eliminación del exceso de radioligando. 3-8 En algunos casos, se inyecta un agente de compensación adicional entre los pasos 2 y 3 con el fin de acelerar la excreción de cualquier anticuerpo Sin embargo, eso tiene que obligar a la tumor y permanece en la sangre. 5 En términos generales, twtipos o de estrategias predireccionamiento son más frecuentes en la literatura. Mientras que ambos han demostrado su eficacia en modelos preclínicos, también poseen limitaciones clave que han impedido su aplicabilidad clínica. La primera estrategia se basa en la alta afinidad entre los anticuerpos conjugados con estreptavidina y radiomarcadores modificados con biotina; Sin embargo, la inmunogenicidad de los anticuerpos modificados con estreptavidina ha demostrado ser un problema preocupante con respecto a la traducción. 5,6,9,10 La segunda estrategia, en cambio, emplea anticuerpos biespecíficos que han sido genéticamente modificados para-unirse tanto un cáncer antígeno biomarcador y un pequeño hapteno marcado radiactivamente molécula. 3,11-14 Mientras que esta última ruta es ciertamente creativo, su amplia aplicabilidad está limitada por la complejidad, gasto, y la falta de modularidad del sistema. Recientemente, hemos desarrollado y publicado una metodología de formación de imágenes PET pretargeted basado en la demanda de electrones inversa Diels-Alder (IEdda) reacción de cicloadición entre -cyclooctene trans (TCO) y tetrazina (Tz;. Figura 1) 11 Mientras que la reacción misma se conoce desde hace décadas, la química IEDDA ha experimentado un renacimiento en los últimos años como una técnica bioconjugación de química, como se ilustra en el fascinante trabajo de los grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, y Peter Conti entre otros. 12.15 El IEDDA cicloadición se ha aplicado en una amplia gama de entornos, incluyendo imágenes de fluorescencia con péptidos, anticuerpos, y nanopartículas, así como imágenes nucleares . con ambas radiohalogens y radiometales 16-26 La ligadura es de alto rendimiento, limpia, rápida (k 1&gt; 30000 M -1 s -1), selectiva y - crítica -. bioorthogonal 27 Y mientras que una serie de tipos de química modular - incluyendo cicloadiciones Cu-catalizada por azida alquino, cicloadiciones-azida alquino deformación-promovido y Staudinger ligciones -. bioorthogonal son, así, es la combinación única de la cinética de reacción rápidos y bioorthogonality que hace que la química IEDDA tan bien adecuado para el predireccionamiento aplicaciones en organismos enteros 28,29 A lo largo de estas líneas, es importante tener en cuenta que el reciente informe de nuestro laboratorios no fue el primero en aplicar la química IEDDA a predireccionamiento: el primer informe de la imagenología pretargeted con IEDDA surgió del trabajo de Rossin, y otros, y contó con una metodología que emplea un SPECT 111 tetrazina En marcado 30.. Como ya comentamos anteriormente, la metodología predireccionamiento tiene cuatro pasos muy simples (Figura 2). En el protocolo a la mano, se describirá una estrategia pretargeted para la formación de imágenes PET de cáncer colorrectal que se emplea un 64 marcado con Cu-NOTA radioligando tetrazina y un conjugado modificado-TCO del anticuerpo huA33. Sin embargo, en última instancia, la modularidad de esta metodología es uno de sus grcomieres activos, como el resto -cyclooctene trans se pueden adjuntar a cualquier anticuerpo no internalización, y la tetrazina se pueden unir a una amplia variedad de reporteros radiactivos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrazine NHS Ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764701</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-cyclooctene NHS Ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764523</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-NH2-Bn-NOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-601</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the bioorthogonal inverse electron demand diels-alder cycloaddition for pretargeted pet imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Los tres pasos iniciales del experimento - la síntesis de Tz-Bn-NOTA, la conjugación de TCO para huA33, y el radiomarcado del Tz-Bn-NOTA construyen (Figuras 3 y 4) - son altamente confiables. En el caso del procedimiento anterior, el constructo Tz-Bn-NOTA se sintetizó de alto rendimiento y pureza. El anticuerpo huA33 fue modificado con 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, y Tz-Bn-NOTA fue radiomarcado con 64 Cu para producir el radioligando purificada en&gt; 99% de pureza radioquímica,&...

Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging at JoVE.com

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

El aprovechamiento de la demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder Cicloadición para Pretargeted TEP

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K vistas.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand. 