The authors thank Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico, and Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty for helpful conversations and the NIH for funding (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

الأخلاق بيان: تم تنفيذ كافة من التجارب على الحيوانات في الجسم الحي وصفها وفقا لبروتوكول المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للميموريال سلون كيترينج للسرطان مركز المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC). 1. توليف TZ-BN-NOTA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وعاء التفاعل صغيرة، ويحل 7 ملغ NH 2 -Bn-NOTA (1.25 × 10 -2 ملمول) في 600 ميكرولتر NaHCO 3 عازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 8.1). تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول. إذا لزم الأمر، وضبط درجة الحموضة من الحل إلى 8.1 باستخدام مأخوذة صغيرة من 0.1 M نا 2 CO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة NH 2 حل -Bn-NOTA إلى 0.5 ملغ TZ-NHS (1.25 × 10 -3 ملمول) في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج. ملاحظة: TZ-NHS يمكن إما أن يكون وزنه من الجافة أو إضافتها من محلول المخزون من DMF الجاف أو DMSO (&lt;50 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للمحلول التفاعل الناتجة للرد لمدة 30 دقيقة في RTمع الإثارة معتدل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، وتنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة C 18 HPLC اللوني لإزالة غير المتفاعل NH 2 -Bn-NOTA. وNH 2 -Bn-NOTA يمكن رصدها عند طول موجي 254 نانومتر، في حين أن TZ-NHS وTZ-BN-NOTA من الأفضل مراقبة عند طول موجي 525 نانومتر من. ملاحظة: مرات الاحتفاظ ومن الواضح أن تعتمد اعتمادا كبيرا على الإعداد المعدات HPLC من كل مختبر (مضخات، والأعمدة، وأنابيب، وغيرها). ومع ذلك، لتقديم سبيل المثال، إذا كان التدرج من 0: 100 MeCN / H 2 O (على حد سواء مع 0.1٪ TFA) إلى 100: 0 MeCN / H 2 O أكثر من 25 دقيقة والتحليلي 4.6 × 250 ملم C 18 عمود يستخدم ومرات الاحتفاظ TZ-BN-NOTA، TZ-NHS، وNH 2 -Bn-NOTA ستكون حوالي 15 دقيقة، 16.5 دقيقة، و 10 دقيقة على التوالي. يمكن تنقية المنتج من مكونات رد فعل الأخرى إما في تشغيل واحد أو أشواط متعددة باستخدام عمود HPLC C 18 شبه إعدادي أو إعدادي 1 H-NMR، والشرجytical HPLC، وESI-MS كلها الأساليب التي يمكن استخدامها للتحقق من نقاء الانتهاء السلائف TZ-BN-NOTA 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد شاطف HPLC جمعها باستخدام النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف أنبوب جمع المجمدة في مبهمة رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب جمع المجمدة في lyophilizing سفينة O / N لإزالة الطور المتحرك HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين المنتج النقي (وردي مشرق الصلبة) في الظلام في -80 ° C. ملاحظة: هذا هو نقطة توقف مقبولة في الإجراء. وأكملت السلائف TZ-BN-NOTA مستقر لا يقل عن 1 سنة في ظل هذه الظروف. </li></ol> 2. إعداد huA33-TCO Immunoconjugate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل، وإعداد 1 ملغ / مل (2.7 ملم) حل TCO-NHS في DMF الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج، وإعداد 2 ملغ / مل (13.3 ميكرومتر) حل huA33 في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.4 (0.01 M PO 4 3-، </sub&gt; 0.154 M كلوريد الصوديوم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مأخوذة صغيرة (&lt;5 ميكرولتر) من 0.1 M نا 2 CO 3، وضبط درجة الحموضة من الحل الضد إلى 8،8-9،0. استخدام أي ورقة درجة الحموضة أو الرقم الهيدروجيني متر مع مسرى مكروي لمراقبة درجة الحموضة، ويجب الحرص على عدم السماح للدرجة الحموضة على الارتفاع فوق درجة الحموضة 9.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن حل الضد هو في درجة الحموضة الصحيحة، إضافة إلى حجم من الحل TCO-NHS الموافق 8 حكمه ضرس استر تفعيلها. على سبيل المثال، إضافة 7.9 ميكرولتر من 1 ملغ / مل TCO-NHS الحل (1.07 × 10 -7 مول TCO-NHS) إلى 1 مل من محلول 2 ملغ / مل huA33 الأجسام المضادة (1.33 × 10 -8 مول huA33). لا تتجاوز 5٪ DMF من حيث الحجم في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف الحل عن طريق قلب لأنبوب microcentrifuge عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف أنبوب microcentrifuge مبهمة في رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للحل لاحتضان لمدة 1 ساعة على RT مع الإثارة معتدل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة على RT، وتنقية immunoconjugate الناتجة باستخدام الاحجام المتاح معبأة مسبقاالبريد استبعاد العمود تحلية. أولا، وشطف العمود حجم الإقصاء كما هو موضح من قبل المورد لإزالة أي مواد حافظة موجودة على العمود أثناء التخزين. ثم، تضاف خليط التفاعل إلى العمود حجم الإقصاء، وشطف العمود مع 1.5 مل 0.9٪ ملحي معقم، وبعد ذلك جمع المنتج باستخدام 2 مل من 0.9٪ ملحي معقم مثل شاطف. ملاحظة: هذه الخطوة سوف تسفر عن الانتهاء huA33-TCO كحل 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الناتجة huA33-TCO على الأشعة فوق البنفسجية فيس معمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب تركيز أعلى، والتركيز على حل huA33-TCO باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي مع 50،000 الوزن الجزيئي قطع. ملاحظة: من المهم أن نلاحظ أنه في حين huA33 ومجموعة متنوعة من الأجسام المضادة المعروفة الأخرى (على سبيل المثال، بيفاسيزوماب، تراستوزوماب، ستوكسيماب، وJ591) ومتسامح جدا من أن تتركز، يمكن أن تحدث التجميع وهطول الأمطار على التركيز في حالات أخرى. الباحثون محاولة هذا procedلدى عودتهم مع الأجسام المضادة الجديد يجب أن تثق في الأدب أو المعرفة الخاصة بهم من الأجسام المضادة في سؤال بشأن ما إذا كان أو لم يكن لتركيز الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الانتهاء immunoconjugate huA33-TCO في 4 درجات مئوية في الظلام. ملاحظة: هذا هو نقطة توقف مقبولة في الإجراء. يجب أن يكون الانتهاء المكورات ماب-TCO مستقر لمدة 3 أشهر على الأقل في ظل هذه الظروف التخزين. </li></ol> 3. 64 النحاس Radiolabeling من TZ-BN-NOTA ملاحظة: هذه الخطوة من البروتوكول ينطوي على التعامل والتلاعب من النشاط الإشعاعي. قبل تنفيذ هذه الخطوات - أو أداء أي عمل آخر مع النشاط الإشعاعي - الباحثون أن يتشاور مع إدارة الصحة والسلامة من الإشعاع مؤسسة وطنهم و. اتخاذ جميع الخطوات الممكنة للحد من التعرض للإشعاع المؤين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل، وإعداد 0.5 ملغ / مل (723 ميكرومتر) حل TZ-BN-NOTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في microc 1.7 ملأنبوب entrifuge، إضافة 10 ميكرولتر من الحل TZ-BN-NOTA (5 ميكروغرام) إلى 400 ميكرولتر من 0.2 M NH 4 OAC درجة الحموضة 5.5 العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مصلحة الكيمياء الإشعاعية المناسبة لحفظ المذكرة، وقياس وتسجيل كمية النشاط الإشعاعي في العينة باستخدام تدريج جرعة قبل وبعد الخطوات التي تلت ذلك في البروتوكول أدناه (3،4-3،8). وهذا سوف يساعد مع تحديد دقيق لعائدات الإشعاعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2،000 μCi (74 من mbq) من 64 النحاس إلى حل TZ-BN-NOTA. ملاحظة: عادة، [64 النحاس] CuCl 2 يتم توفير في حجم صغير (&lt;30 ميكرولتر) من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك، وبالتالي فقط كميات صغيرة (&lt;10 ميكرولتر) هناك حاجة إلى هذا الحل الأسهم للتفاعل radiolabeling. إذا كانت هناك حاجة كميات أكبر من [64 النحاس] CuCl 2 الأوراق المالية، ورد فعل radiolabeling متسامح زيادة حجم رد الفعل الكلي. ومع ذلك، ينبغي رصد الرقم الهيدروجيني للمحلول التفاعل radiolabeling بعناية لضمانأنها لا تقع تحت الرقم الهيدروجيني 4.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للحل لاحتضان لمدة 10 دقيقة في RT مع الإثارة معتدل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة من الحضانة، تنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة C 18 HPLC اللوني. مرات الاحتفاظ ومن الواضح أن تعتمد اعتمادا كبيرا على الإعداد المعدات HPLC من كل مختبر (مضخات، والأعمدة، وأنابيب، وغيرها). ومع ذلك، لتقديم سبيل المثال، إذا كان التدرج من 5:95 MeCN / H 2 O (على حد سواء مع 0.1٪ TFA) ل95: 5 MeCN / H 2 O أكثر من 15 دقيقة يتم استخدامها، والوقت الاحتفاظ من 64 النحاس وTz- BN-NOTA ينبغي أن يكون حول 9.8 دقيقة في حين سيكون مجانا، uncomplexed 64 النحاس أزل مع الجبهة المذيبات في حوالي 2-4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المبخر الدوار، وإزالة شاطف HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنحل المنتج 64 النحاس وTZ-BN-NOTA في 0.9٪ ملحي معقم. ملاحظة: نظرا ل12.7 ساعة الجسدية نصف العمر لل64 النحاس، هذه ليست نقطة توقف مقبولة في الإجراء. أداء توليف 64 النحاس وTZ-BN-NOTومباشرة قبل حقن جين مشع، واتبع الخطوة 3.7 على الفور من قبل الخطوة 4.5. </li></ol> 4. في فيفو Pretargeted PET التصوير ملاحظة: كما هو الحال في القسم بروتوكول 3، هذه الخطوة من البروتوكول ينطوي على التعامل والتلاعب من النشاط الإشعاعي. قبل تنفيذ هذه الخطوات الباحثون أن يتشاور مع إدارة الصحة والسلامة من الإشعاع مؤسسة وطنهم و. اتخاذ جميع الخطوات الممكنة للحد من التعرض للإشعاع المؤين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في ماوس عارية athymic الإناث، وزرع تحت الجلد 1 × 10 6 SW1222 خلايا سرطان القولون والمستقيم والسماح لهؤلاء لتنمو لتصبح 100-150 ملم 3 طعم أجنبي (بعد 9-12 أيام التلقيح). 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع قسامة من الحل huA33-TCO من القسم بروتوكول 2 إلى تركيز 0.5 ملغ / مل في 0.9٪ ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 200 ميكرولتر من الحل huA33-TCO (100 ميكروغرام) في الوريد ذيل الفأر طعم أجنبي الحاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا 24 ساعة لتراكم huA33-TCO في الورم من الفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 64 النحاس وTZ-BN-NOTA جين مشع إلى تركيز 1.5 ميلي كوري / مل في 0.9٪ ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 200 ميكرولتر من 64 النحاس وTZ-BN-NOTA حل لجين مشع (300 μCi، 11.1 من mbq؛ 1.6 نانومول من 64 النحاس وTZ-BN-NOTA، على افتراض نشاط معين 6.7 من mbq / نانومول) في الوريد ذيل الفئران الحاملة للطعم أجنبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة زمنية التصوير المطلوب (على سبيل المثال، 2، 6، 12، أو 24 ساعة بعد الحقن)، تخدير الماوس مع الأيزوفلورين 2٪: خليط غاز الأكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على السرير من صغير الماسح الضوئي PET الحيوان. الحفاظ على التخدير أثناء الفحص باستخدام الأيزوفلورين 1٪: خليط غاز الأكسجين. قبل وضع الحيوان على السرير الماسح الضوئي، تحقق من التخدير باستخدام طريقة إصبع القدم قرصة وتطبيق مرهم البيطرية للعيون من الماوس لمنع جفاف أثناء التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات PET الماوس عن طريق ثابتمسح مع حد أدنى من 20 مليون الأحداث المتزامنة باستخدام نافذة الطاقة من 350-700 كيلو وتوقيت نافذة صدفة من 6 NSEC. بعد الانتهاء من الاستحواذ على الصورة، لا تترك الماوس غير المراقب وليس لوضعه في قفص مع فئران أخرى حتى استعاد وعيه عليه. </li></ol>

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).</li><li>Hollander, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies+for+cancer+therapy.">Bispecific antibodies for cancer therapy.</a> Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+pretargeting+in+mice+using+99mTc-labeled+morpholino,+a+DNA+analog.">Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).</li><li>Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeted+radioimmunotherapy+of+cancer:+Progress+step+by+step.">Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).</li><li>Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+pretargeting+advances+cancer+radioimmunodetection+and+radioimmunotherapy.">Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy.</a> Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).</li><li>Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeting:+taking+an+alternate+route+for+localizing+radionuclides.">Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides.</a> Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).</li><li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+delivery+of+radionuclides+for+imaging+and+therapy+of+cancer+using+pretargeting+methods.">Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods.</a> Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).</li><li>Schultz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tetravalent+single-chain+antibody-streptavidin+fusion+protein+for+pretargeted+lymphoma+therapy.">A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy.</a> Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).</li><li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy.">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pretargeted+PET+imaging+strategy+based+on+bioorthgonal+Diels-Alder+click+chemistry.">A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).</li><li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine+ligation:+fast+bioconjugation+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reactivity.">Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).</li><li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine/trans-cyclooctene+cycloaddition.">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).</li><li>Devaraj, N. K., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+tetrazine+cycloadditions.">Biomedical applications of tetrazine cycloadditions.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).</li><li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-based+cycloadditions:+application+to+pretargeted+live+cell+imaging.">Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).</li><li>Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yielding,+two-step+18F+labeling+strategy+for+18F-PARP1+inhibitors.">High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors.</a> ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).</li><li>Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+small-molecule+ligands+for+PARP1+imaging+in+living+cells.">Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells.</a> ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).</li><li>Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+in+vivo+imaging+of+a+18F-labeled+PARP1+inhibitor+using+a+chemically+orthogonal+scavenger-assisted+high-performance+method.">Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).</li><li>Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+synthesis+of+highly+reactive+dienophiles+for+the+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation.">Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).</li><li>Selvaraj, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+integrin+alpha(v)beta(3)+targeted+PET+tracer+based+on+a+cyclic+RGD+peptide.">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+18F+labeling+of+cysteine-containing+peptides+and+proteins+using+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation.">Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).</li><li>Han, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bioorthogonal+and+highly+efficient+conjugation+method+for+quantum+dots+using+tetrazine-norbornene+cycloaddition.">Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+strategy+for+the+construction+of+radiometalated+antibodies+for+positron+emission+tomography+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+click+chemistry.">Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).</li><li>Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+impact+of+bioorthogonal+click+chemistry+on+the+development+of+radiopharmaceuticals.">The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).</li><li>Reiner, T., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reaction+in+radiochemistry.">The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry.</a> Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+18-F+labeled+probes.">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes.</a> Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).</li><li>Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+a+series+of+1,2,4,5-tetrazines+for+bioorthogonal+conjugation.">Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).</li><li>Bosch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+strained+alkynes+for+Cu-free+click+reaction+in+live+mice.">Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice.</a> Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+chemisry+for+pretargeted+tumor+imaging+in+live+mice.">In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A33+antigen+displays+persistent+surface+expression.">A33 antigen displays persistent surface expression.</a> Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).</li><li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer.">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li><li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting:+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody.">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems.">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li><li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting.">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

والميزة الرئيسية لهذه الاستراتيجية التصوير PET pretargeted هو أنه قادر على ترسيم الأورام مع الهدف إلى خلفية تباين الصورة في جزء فقط من الجرعة إشعاع الخلفية التي تنتجها الأجسام المضادة المسمى مباشرة. على سبيل المثال، في نظام التصوير سرطان القولون والمستقيم وصفها هنا، تم تو...

على مدى السنوات الثلاثين الماضية، أصبح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) أداة لا غنى عنها السريرية في تشخيص وإدارة من السرطان. لطالما اعتبرت الأجسام المضادة ناقلات واعدة لتسليم النظائر المشعة الباعثة للبوزيترون لأورام بسبب تقارب رائعة وخصوصية لالمؤشرات الحيوية للسرطان. 1،2 ومع ذلك، فإن بطيئة نسبيا الدوائية في الجسم الحي من الأجسام المضادة ولايات استخدام النظائر المشعة مع عدة أيام المادية نصف حياة. وهذا يمكن الجمع تسفر الجرعات الإشعاعية العالية إلى الأجهزة غير المستهدفة من المرضى، وهي المضاعفات المهمة التي هي ذات الأهمية السريرية منذ يتم حقن radioimmunoconjugates عن طريق الوريد، وبالتالي - على عكس جزئية بمسح الجسم CT - نتيجة في جرعات استيعابها في كل جزء من أجزاء الجسم، بغض النظر عن الأنسجة للاستجواب. من أجل تجاوز هذه المسألة، فقد تم تخصيص جهد كبير لdevelopment استراتيجيات التصوير PET أن فصل النظائر المشعة وشاردة الاستهداف، وبالتالي الاستفادة من خصائص مفيدة من الأجسام المضادة في حين التفاف على القيود في وقت واحد الدوائية الذاتية الخاصة بهم. هذه الاستراتيجيات - يطلق في معظم الأحيان pretargeting أو استهداف متعددة الخطوات - وعادة ما تستخدم أربع خطوات: (1) ادارة جسم مضاد قادر على حد سواء المستضد وجين مشع ملزمة؛ (2) تراكم الأجسام المضادة في الأنسجة المستهدفة وإزالة لها من الدم. (3) إدارة لجين مشع جزيء صغير. و (4) ربط في الجسم الحي من جين مشع إلى الأجسام المضادة التي تتبعها التخليص السريع للجين مشع الزائد. 3-8 وفي بعض الحالات، يتم حقن عامل المقاصة إضافية بين الخطوتين 2 و 3 من أجل الإسراع في إفراز الأجسام المضادة أي التي لم لربط الورم ويبقى في الدم. 5 وبشكل عام، TWأنواع س استراتيجيات pretargeting هي الأكثر انتشارا في الأدب. في حين أثبتت كلا ناجحة في النماذج قبل السريرية، كما أنها تمتلك القيود الرئيسية التي أعاقت تطبيق السريرية الخاصة بهم. وتعتمد الاستراتيجية الأولى على تقارب عالية بين الأجسام المضادة streptavidin مترافق وradiolabels المعدلة البيوتين. ومع ذلك، فقد أثبتت المناعية للأجسام المعدلة streptavidin وجود مشكلة مقلقة فيما يتعلق الترجمة. 5،6،9،10 الاستراتيجية الثانية، في المقابل، توظف الأجسام المضادة bispecific التي تم هندستها وراثيا لربط كل من السرطان مستضد العلامات البيولوجية وناشبة رديولبلد جزيء صغير. 3،11-14 في حين أن هذا الطريق الأخير هو بالتأكيد الإبداعي وانطباقها اسع محدودة بسبب التعقيد، وحساب، وعدم وجود نمطية للنظام. مؤخرا، قمنا بتطوير ونشر منهجية التصوير PET pretargeted بناء على الطلب معكوس الإلكترون ديلز-ألدر (IEDDA) رد فعل الإضافة الحلقية بين -cyclooctene العابرة (TCO) وtetrazine (TZ؛ الشكل 1) 11 في حين أن رد الفعل نفسه كان معروفا منذ عقود، شهدت IEDDA الكيمياء نهضة في السنوات الأخيرة كأسلوب bioconjugation بنقرة والكيمياء، وكما يتضح من عمل رائع من مجموعات من رالف Weissleder، جوزيف فوكس، وبيتر كونتي وغيرها. وقد تم تطبيق 12-15 وIEDDA الإضافة الحلقية في مجموعة واسعة من الإعدادات، بما في ذلك التصوير مضان مع الببتيدات، والأجسام المضادة، والجسيمات النانوية وكذلك التصوير النووي . مع كل radiohalogens وradiometals 16-26 وربط عالية الغلة ونظيفة وسريعة (ك 1&gt; 30،000 M -1 ثانية -1)، انتقائي، و- خطيرة -. bioorthogonal 27 وعلى الرغم من عدد من أنواع نقرة الكيمياء - بما في ذلك أزيد آلكاين cycloadditions المحفز النحاس،-أزيد آلكاين cycloadditions-روجت سلالة، وشتاودينغر LIGations - هم bioorthogonal كذلك، هو مزيج فريد من حركية التفاعل بسرعة وbioorthogonality أن يجعل IEDDA الكيمياء ذلك مناسبة تماما لpretargeting التطبيقات في الكائنات كلها 28،29 على طول هذه الخطوط، فمن المهم أن نلاحظ أن التقرير الأخير من وجهة نظرنا وكانت مختبرات يست الأولى لتطبيق IEDDA الكيمياء لpretargeting: نشأ التقرير الأول للتصوير pretargeted مع IEDDA من عمل روسين، وآخرون وظهرت منهجية SPECT بتوظيف 111 tetrazine في المسمى 30. كما ناقشنا أعلاه، فإن منهجية pretargeting أربعة خطوات بسيطة إلى حد ما (الشكل 2). في البروتوكول في متناول اليد، ويمكن وصفها استراتيجية pretargeted للتصوير PET من سرطان القولون والمستقيم التي توظف 64 النحاس وNOTA المسمى جين مشع tetrazine والمكورات تعديل TCO للأجسام المضادة huA33. ومع ذلك، في نهاية المطاف نمطية من هذه المنهجية هو واحد من غرام لهاتأكل الأصول، كما شاردة -cyclooctene المتحولة يمكن إلحاق أي الأجسام المضادة غير استيعاب، ويمكن أن تعلق tetrazine لمجموعة واسعة من المراسلين الإشعاعي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrazine NHS Ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764701</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-cyclooctene NHS Ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764523</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-NH2-Bn-NOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-601</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the bioorthogonal inverse electron demand diels-alder cycloaddition for pretargeted pet imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

الخطوات الثلاث الأولى من التجربة - تركيب TZ-BN-NOTA، والاقتران من TCO لhuA33، وradiolabeling من TZ-BN-NOTA بناء من (أرقام 3 و 4) - هي موثوق بها للغاية. في حالة الإجراء أعلاه، تم تصنيعه في بناء TZ-BN-NOTA في ارتفاع العائد والنقاء. تم تعديل الأجسام المضادة huA33 مع 4.2 ± 0.6 TCO / ماب، وكا...

Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging at JoVE.com

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

تسخير الطلب Bioorthogonal معكوس الكترون ديلز-ألدر الإضافة الحلقية لPretargeted PET التصوير

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand. 

Video: Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; &#39;تنقل

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

سرعة المسح الضوئي الكترون ممغطس الرنين تفتح آفاقا جديدة للالتصوير الناحية الفسيولوجية معلمات هام<em&gt; في فيفو</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

المجهر الإلكتروني الارتباطية الخفيفة (كليم) لتتبع وتصوير البروتينات الفيروسية المرتبطة الهياكل في الخلايا المعطل تداولها البرد

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various factors affect the relaxation rates, such as buffer composition, solution pH, temperature, and magnetic field. In this last regard, the spin-lattice relaxation time can be measured at clinical field strengths, but at lower fields, where these compounds are dispensed from the polarizer and transported to the MRI, the relaxation is even faster and difficult to measure. To have a better understanding of the amount of magnetization lost during transport, we used fast field-cycling relaxometry, with magnetic resonance detection of 13C nuclei at ~0.75 T, to measure the nuclear magnetic resonance dispersion of the spin-lattice relaxation time of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Dissolution dynamic nuclear polarization was used to produce hyperpolarized samples of pyruvate at a concentration of 80 mmol/L and physiological pH (~7.8). These solutions were rapidly transferred to a fast field-cycling relaxometer so that relaxation of the sample magnetization could be measured as a function of time using a calibrated small flip angle (3&#176;-5&#176;). To map the T1 dispersion of the C-1 of pyruvate, we recorded data for different relaxation fields ranging between 0.237 mT and 0.705 T. With this information, we determined an empirical equation to estimate the spin-lattice relaxation of the hyperpolarized substrate within the mentioned range of magnetic fields. These results can be used to predict the amount of magnetization lost during transport and to improve experimental designs to minimize signal loss.

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

We present a protocol to measure the magnetic field dependence of the spin-lattice relaxation time of 13C-enriched compounds, hyperpolarized by means of dynamic nuclear polarization, using fast field-cycled relaxometry. Specifically, we have demonstrated this with [1-13C]pyruvate, but the protocol could be extended to other hyperpolarized substrates.

قياس الاسترخاء تدور شعرية الاعتماد المجال المغناطيسي من فرط الاستقطاب [1-13C] بيروفات

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

بروتوكول حقن الدهون لقياسات البلورات التسلسلية في السنكروترون الأسترالي

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

تصوير تدفق الدم مع دوبلر فائق السرعة

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Establishing an Octopus Ecosystem for Biomedical and Bioengineering Research

Many developments in biomedical research have been inspired by discovering anatomical and cellular mechanisms that support specific functions in different species. The octopus is one of these exceptional animals that has given scientists new insights into the fields of neuroscience, robotics, regenerative medicine, and prosthetics. Research with this species of cephalopods requires the set-up of complex facilities and intensive care for both the octopus and its ecosystem that is critical for the project&#39;s success. This system requires multiple mechanical and biological filtering systems to provide a safe and clean environment for the animal. Along with the control system, specialized routine maintenance and cleaning are required to effectively keep the facility operating long term. It is advised to provide an enriched environment to these intelligent animals by changing the tank&#39;s landscape, incorporating a variety of prey, and introducing challenging tasks for them to work through. Our results include MRI and a whole-body autofluorescence imaging as well as behavioral studies to better understand their nervous system. Octopuses possess unique physiology that can impact many areas of biomedical research. Providing them with a sustainable ecosystem is the first crucial step in uncovering their distinct capabilities.

Understanding the unique physiological and anatomical structures of octopuses can greatly impact biomedical research. This guide demonstrates how to set-up and maintain a marine environment to accommodate this species and includes state-of-the-art imaging and analytical approaches to visualize octopus' nervous system anatomy and function.

إنشاء نظام إيكولوجي للأخطبوط لأبحاث الطب الحيوي والهندسة الحيوية

Many developments in biomedical research have been inspired by discovering anatomical and cellular mechanisms that support specific functions in different ...