The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

הערה: אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישרה את כל הניסויים. 1. הכנת מכשירי אולטרסאונד-microinjection ועוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הבמה, הר, ובדיקה (איור 1), כמו גם מכשירי ניתוח (איור 2). פתרון פוספט המקום שנאגרו מלוח (PBS) (pH7.4) באמבט התחממות 37 ° C. מלא מחט microinjection לחלוטין עם שמן מינרלים, באמצעות מיליליטר המזרק 1 מצורף ל-25 גמישים מחט G שנייה, דרך הבסיס שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המחט על סיבוב הר זרוע, ומחט ריקה של פתרון שמן מינרלים. למלא מחדש עם 2.5 μl של פתרון TL. ודא שאין בועות אוויר נמצאות בתוך מחט הזריקה. סובב את זרוע מחט לכיוון קיר, הרחק מהבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את האמא בהריון בתא הרדמה באמצעות עירוי מתמשך של isoflurane. כשאמא שלו אבדה את ההכרה, להעביר את ההרדמה לצינור האף ממוקם בגצד audal של השלב, ואמא של מקום במצב שכיבה עם חוטם בצינור האף כדי לאפשר המשך מצב בהרדמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גפיים קלטת ב -45 מעלות זוויות, או עם ידיים ורגליים נחו ואת מיקומו כרטיסיות / צג טמפרטורת overtop ECG. חשוב שהסכר בהריון מנוטר כל הזמן כדי להבטיח הרדמה שמספיק והמשחה שביישומים לעיניים להפחתת ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מוצר להסרת שיער על פני בטן תחתונה של האמא, לנגב בעדינות את עם צמר גפן יבש, ולאחר מכן שוב עם צמר גפן רווי אתנול 70% כדי להסיר כל מוצר ושיער עודפים. ודא לנקות את עור בטן של כל השיער באתר של חתך (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע laparotomy על האמא בהריון באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס ומספריים. תשמור על עצמך כדי להימנע מחיתוך כל כלי גדולים או איברים פנימיים. הפוך ראשון, חתך ישר של האפידרמיס 1.5-2 סנטימטר מעל הנרתיק וממשיך לחתוך לכיוון צלעות לapproximatסנטימטר Ely 2-3. לחשוף את הקרום תת-עורי, לאתר את alba linea (&quot;הקו לבן&quot;) (איור 3), ולחתוך במקביל לחתך ראשוני, יחד באותו האורך, לחשוף פנימי איברים פנימיים וsaccules רחם. </li></ol> 2. הפקה של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהחלה מכותנת שקצה 6 אינץ &#39;לתמרן אמא ועוברים. דחפו בעדינות (לא מכריח) על עור עם המוליך לתמרן עובר ראשון מתוך פתיחת חתך. לאחר החילוץ של שקיק העובר הראשון, בעדינות ולאט לאט למשוך את יתרת קרן הרחם דרך ועל חיצוני של האם. הימנע ממשייכת מעי או לאיברים אחרים דרך חתך בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת עוברים ומניחים בעדינות קרן רחם עזב בחזרה לאמא. לאחר מכן להתחיל בהצטרפות לקרן רחם הזכות חזרה אל אמא מתחילה עם מרוחק שקיק עובר מהנרתיק על הצופר ולנוע כלפי מטה. תמשיך את זה עד שרק שני עוברים יישארו חשופים (Fiתרשים 4). לבסוף, עוברי עמדה בטור לעיל ומקביל לחתך קו, להיות מודע לא לנתק את זרימת דם ברחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בלוקים חימר ועמדה בין זרועות וגוף, כמו גם את הרגליים וזנב. ודא שמשטחי החימר כ רמה עם חתך laparotomy. להרטיב את צלחת פטרי fenestrated עם 37 ° C PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס מלקחיים הארכה עם יד ימין וצלחת פטרי עם fenestrated יד שמאל (במקביל אשנוב לעוברים) ולהביא מלקחיים ~ 5 סנטימטר סגור דרך אשנוב, מהחלק העליון של צלחת פטרי. מלקחיים פתוחים לחלוטין מבלי לקרוע רשת אשנוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן את הידיים מעל עוברים ולהתמקד מראה על שני saccules העובר. ללא (או קל) נוגע saccules עם התמזגות אשנוב או מלקחיים, להחליק אותם דרך חריץ ולהגדיר צלחת פטרי על הבטן של אמא. עם מלקחיים עדיין מורחבים, לתפעל רשת fenestrated להושיב אותו על שני צדדים ובבסיסו של כל עובר (איור 5 </stרונג&gt;) ולמשוך מלקחיים מפתיחת חריץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא, במקום גומי כחול המכיל קיר בצלחת פטרי, בלי לצבוט או פצעו עוברים (איור 6). הפוך לוקי חימר בטוחים בתקיפות מאזנים צלחת פטרי, עובר, וקיר המכיל גומי. לבסוף, למלא צלחת פטרי עם 37 מעלות צלזיוס PBS עד עובר הם שקועים לחלוטין (איור 6), תוך פיקוח על דליפות בהתמזגות fenestrated. </li></ol> נוהל 3. הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב תחתון הזרקה עם אמו ועוברים למטה באמצעות כפתור כוונון הרמה-Z (איור 1) ולאחר מכן לסובב מחט זריקה ולעלות זרוע והשורה ישירות עם הבדיקה אולטרסאונד, עם סנטימטר ½ מחט משמאל ומתחת לקצה הבדיקה (איור 7) . לדחוף מחט-זרוע (לא מחט) 45 ° מהבדיקה. היזהר שלא פגע בקצה המחט עם חללית הצלחת או אולטרסאונד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות שלב הזרקה חזרה לגובה מקורי, עם p אולטרסאונדגלימה ישירות מעל Probe עוברים חייבת להיות שקועה מעט ובתוך 3-4 מ&quot;מ של הרקמה העוברית. כפתורי התאמת שלב השימוש X &amp; Y (איור 8) לתיקון מצב עובר / אמא / במה כדי לאתר את הלב העוברי להכות באופן שיטתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות מרכז של מסך אולטרסאונד להתבונן טוש שחור יעד המרכז נמשך (*). אתר חדר השמאלי (עדיף) או אטריום באמצעות כפתורי התאמת שלב X &amp; Y (איור 8) ולאחר מכן להגדיל או להקטין את השלב באמצעות ידית מסתובבת על הבמה למצב את יעד הזרקה בדיוק מעל הסמן המרכזי בצבע השחור על מסך אולטרסאונד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפתור כוונון שלב X לעבור עובר בצד הימין, מעל מסך אולטרסאונד. מיקום מחדש מחט microinjection וזרוע אחורית למקום, סנטימטר וחצי מו -90 מעלות לבדיקת אולטרסאונד (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microinjection הר כפתורי התאמה (איור 9 ג-G), מחט עמדה עם הקצה בבירור אלigned עם הסמן המרכזי. להתאים את זווית הזרקה (תוך שימוש בידיות באיור 9 ג וEG), ו- X, Y, Z ווקטורים של מיקרו-מחט על מנת להבטיח במטוס הנכון קצה מחט מתמקד. לחזור בו מחט microinjection באמצעות אך ורק את הכפתור &quot;זריקה&quot; (איור 9F), נזהר שלא להתאים ממדים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, באמצעות רק את עובר X ​​עדין התאמת מהלך ידית שלב בחזרה מתחת לבדיקה, עם היעד בדיוק על סימן המרכז על מסך אולטרסאונד. ודא שהחדר השמאלי הוא עכשיו בדיוק באותו X, Y, Z ומטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, רק עם הידית &quot;ההזרקה&quot; על microinjection הר, לנקב לאט עובר עם מחט microinjection ולהביא בהדרגה קצה לתוך החדר השמאלי. הזרק 2.5 μl המלא של פתרון TL לתוך חדר השמאלי או עד שצלילי צפצוף אזהרה הריקים, על ידי החזקה &quot;ריק&quot; וקשה &quot;למלא&quot; פעם אחת (איורים 2 א &amp; B). בשלב זההזרקה להתבונן צל שייוצר מקצה המחט שהוא TL נכנסים לתוך תא הלב (איור 10). בכיוון הפוך, לחזור בו במהירות מחט microinjection סיבוב ידית &quot;הזריקה&quot; (איור 9F) על microinjection הר כאשר ההזרקה היא מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לעובר הבא ולחזור על הליך זה עבור עוברים שנותרו לאחר סדרה זו של צעדים ולבסוף מניחים את העוברים הסופיים חזרה לבטן של הסכר. לעבור הרדמה לחדר תיבה ועדינות להעביר אמא כאן במשך 15 דקות מהזמן של הזריקה האחרונה. </li></ol> 4. קציר עוברים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את הסכר באמצעות נקע בצוואר הרחם. להרחיב את חתך laparotomy להסיר בקלות קרנות רחם מהאם. שמור את העוברים בתוך שק רחם. הנח עוברים בPBS המקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עובר מן שק רחם (אם רקמת גוביינא הכרחית לגנוטיפ) ולמקם את כל העובר iParaformaldehyde n 4% (PFA) לילה, ואז לתוך 30% סוכרוז לילה, להקפיא בcryostat חתך בינוני. ואז לחתוך את cryosection ולמקם אותו על גבי שקופיות לניתוח immunohistochemical. לחלופין, להשתמש ברקמות לכל הר על ידי ההתייבשות במתנול 100%, לאחר הקיבוע בPFA 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח immunohistochemical למקם את cryosections לPBS להסיר אוקטובר אז לחסום את החלקים עם 10% חמורים בדם נורמלי למשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף נוגדן ראשוני PECAM ב 1: 100 דילול הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את השקופיות בPBT 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ולהוסיף עכברוש אנטי חמור 594 משניים ודגירה עבור שעה 1 ב RT. הערה: זוהי טכניקה מאוד תובענית הדורשת אופטימיזציה ותיאום של אולטרסאונד וmicroinjection. יש עקומה למידה תלולה מאוד הקשורים לטכניקה זו ודורשת ארבעה עד שישה שבועות של זריקות מורה רוחניות לפני אחד הופך מיומן. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הרדמה Microinjection ומסגרת זמן בכל הקשור להרדמה של האמא, זה חיוני כדי לשמור על זרימת אוויר קבוע (2-3 L / min) ובPSI הנמוך. הזרימה של ההרגעה חייבת להיות מוחזקת בכ 1.75-2 L / min. במקביל, לוחות זמנים שבי הזריקות יתקיימו חייבים להיות תחת פיקוח הדוק ומבו?...

במהלך התפתחות עוברית שני תהליכים נפרדים, עדיין בו-זמנית, כלי דם יתקיימו: אנגיוגנזה, התהליך שבו גדל כלי מכלי שיט, וvasculogenesis גדולים קיימים מראש, שהוא במערך דה נובו של כלי מאבות אנדותל מגורים 1,2. בהתאמה, לשעבר הוא שם נרדף לזרימת דם, ואילו הוא חשב שהאחרון לקחת במידה רבה את המקום בהעדרו. במקביל להיווצרות כלי דם, תהליך מחזורי ודינמי של סינתזת אב כליות תא, התפשטות, ובידול מתחיל להתפתח ביום עוברי 9.5 (E9.5). בשלב זה ניצן ureteric (UB) פולש dorsally למקיף mesenchyme metanephric (MM), וממשיך עד לידת 3. חזר הסתעפות של UB למהירות עיבוי mesenchyme כובע metanephric מתחילה ההיווצרות של היחידות פונקציונליות של הכליות, נפרון. עם כל דור חדש של UB וnephרון, דורות מבוגרים הם עקורים לאזורים בקליפת המוח והלשדיים פנימיים, שבו הם לאחר מכן לעבור הבשלה והתמיינות נוספות בתוך סביבות בעיקר כלי דם צפופים. כפי שמעיד דרסלר et al. 3, תהליך עוברי זה, מוגבר על ידי איתות אינדוקטיביים, כגון crosstalk בין UB וMM, ומספר עצום של גורמים תאיים 3-6. שני גורמים שנחקרו לאחרונה תאיים בתוך לבלב הפיתוח וכליות כוללים מתח חמצן וזרימת דם 7,8. האחרון יידון בפירוט בהמשך ביחס לפיתוח כליות. על מנת לחשוף את התפקיד אינדוקטיביים שזרימת דם שעלול להיות משחקת בבידול אב נפרון תא, כמו גם בתהליכי organogenesis אחרים, שיטות מדויקות ומדויקות של זרימת דם מיפוי העוברי הוא הכרחי. שיטות חלופיות של מדידת זרימת דם כוללות את המרשם של ulההדמיה trasound ושרף מטילים 9,10. באופן חד משמעי, מצבים אלה הוכחו להיות מטבע חסר יכולתם לחשוף זמנית צירופים של זמן ומרחב בין זרימת דם וגזע התמיינות תאים. יציקות שרף, למשל, לספק מודל תקף של דפוסי כלי בתוך רקמות בוגרות, אולם בכלי בשלה, כמו עם נקודות זמן עובריים, כלים הם גס מפותחים ודולפים. לכן, שרף מטיל מצליח להחזיק בתוך כלי הזעירים, לעתים קרובות נקבוביים,. למכשולים נראות לעין אלה, בין יתר, בחרנו לשלב בmicroinjections vivo תוך-לב לקטינים עגבניות עובריים (TL) לחקירות של פיתוח כליות שלנו מונחה אולטרסאונד. בהליך זה אנו מנצלים בדיקה אולטרסאונד כדי להנחות את מחט micropipette רכובה מלאה 2.5 μl של פתרון TL לתוך החדר השמאלי של עכבר עובר בנקודות E11.5, E13.5, E15.5, וזמן E17.5 סינכרוני. E17.5 הוא הגיל ההתפתחותי האחרון כמחטים הן לא חזקות מספיק כדי לחדור את העובר מפותח יותר. היתרונות של שיטה זו הם בשפע microinjection. microinjection מודרך אולטראסאונד מאפשר מיקום מדויק של מחט זריקה בתוך החדר השמאלי העוברי, גירוש פסיבי ושליטה מלאה של פתרון ללב הפועם של בעלי החיים, נזק מינימאלי ללב ורקמות הסובבות, והימנעות מכישלון לב הפתאומי ומותו של עובר לפני זלוף גוף מלא. עם השימוש בTL FITC שכותרתו, כל כלי דם perfused ישמור את הסמן לאורך קרום פסגת אנדותל. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, ניצול PECAM (CD31, מולקולת הידבקות תא אנדותל טסיות דם) וסמנים אחרים של כלי דם שונים, אנו יכולים להבחין בבירור בין כלי perfused ו- perfused un, כמו גם לאפיין כל כתמים חריגים של רקמות הסובבות.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>022M4004V</td><td>concentration 1:5,000</td></tr><tr><td>Pecam</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>concentration 1:100</td></tr><tr><td>FITC-Tomato Lectin</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1321</td><td>concentration 2.5 &amp;micro;l / embryo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-585-150</td><td>concentration 1:200</td></tr><tr><td>Microinjection Needle</td><td>Origio Mid Atlantic Devices</td><td>C060609</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-20</td><td></td></tr><tr><td>Clay Blocks</td><td>Fisher Scientific</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-380</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9763655</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Product</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Marking Pen</td><td>Fine Science tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>Right angle forceps (for hysterectomy)</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

ההיווצרות וזלוף, יצירת כלי דם כליות (מלבד glomeruli) הם understudied מאוד. ככלי דם מתפתח באמצעות אנגיוגנזה (שהוא מתפצלים כלי גדולים) וvasculogenesis (היווצרות כלי דה נובו), טכניקות מיפוי זלוף כגון יציקות שרף, in vivo הדמיה אולטרסאונד, ומיקרו לנתיחה היו מוגבלות במפגינות יחסים האינטימיים בין שני תהליכים אלו ומבני כליות מתפתחים בתוך העובר. כאן, אנו מתארים את ההליך של בmicroinjections הרחם תוך-לב מודרך-אולטרסאונד FITC שכותרתו עגבניות לקטינים בעוברי עכבר כדי לאמוד את ontogeny של פרפוזיה. קטיני עגבניות (TL) היה perfused לאורך העובר והכליות שנקטפו. רקמות שיתוף מוכתמות עבור מבנים שונים בכליות כוללים: אבות נפרון, מבני נפרון, האפיתל ureteric, וכלי דם. החל מ E13.5 כלי קליבר גדולים היו perfused, ציוד היקפי ואולםכלי נשארו unperfused. על ידי E15.5 וE17.5, כלי היקפיים קטנים, כמו גם glomeruli התחילו להיות perfused. טכניקה ניסויית זה היא קריטי ללימוד התפקיד של כלי דם וזרימת דם במהלך התפתחות עוברית.

היווצרות כלי דם מקדימה זרימה בפיתוח בכליות רוב הרקמות עובריים (כולל הכליות) מכיל כלי דם צפופים (שני unperfused וperfused), אפילו בנקודות זמן עובריים מוקדמות. כדי לאמוד ולנתח טובים יותר את זרימת דם בתוך הכליה הפיתוח אנו מנוצלים שיטה בmicroinjecti...

Watch this Scientific Journal Video about In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow at JoVE.com

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

בזריקות עגבניות-לקטינים הרחם Intra-לב בעוברי עכבר כדי לאמוד את זרימת דם בכליות

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.7K Views.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Video: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Medicine

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Murine Fetal Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding the molecular mechanisms underlying both normal cardiovascular function and the pathophysiological basis of human cardiovascular disease. Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development 1-3. In order to study the role of genetic or pharmacologic alterations in the early development of cardiac function, ultrasound imaging of the live fetus has become an important tool for early recognition of abnormalities and longitudinal follow-up. Noninvasive ultrasound imaging is an ideal method for detecting and studying congenital malformations and the impact on cardiac function prior to death 4. It allows early recognition of abnormalities in the living fetus and the progression of disease can be followed in utero with longitudinal studies 5,6. Until recently, imaging of fetal mouse hearts frequently involved invasive methods. The fetus had to be sacrificed to perform magnetic resonance microscopy and electron microscopy or surgically delivered for transillumination microscopy. An application of high-frequency probes with conventional 2-D and pulsed-wave Doppler imaging has been shown to provide measurements of cardiac contraction and heart rates during embryonic development with databases of normal developmental changes now available 6-10. M-mode imaging further provides important functional data, although, the proper imaging planes are often difficult to obtain. High-frequency ultrasound imaging of the fetus has improved 2-D resolution and can provide excellent information on the early development of cardiac structures 11.

Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development. High-frequency ultrasound imaging has improved 2-D resolution and can provide excellent information on early cardiac development and is an ideal method to detect the impact on cardiac structure and function prior to death.

אקו העוברי Murine

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

במדידת רחם של קצב לב בעכבר על ידי אקו M-המצב פולשנית

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

ניתוח כמותי מיקרו-CT Aortopathy במודל של עכברים של β-aminopropionitrile-induced מפרצת אבי העורקים, דיסקציה

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...