המחברים מודים הקרן Leducq (מיטרלי) וNationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר (מענק ANR Specistem) למימון מחקר זה.

1. הכנה נהלי בעלי חיים לקבל אישור מועדת אתיקה של בעלי חיים ופעל בהתאם להנחיות מוסדיות לעבודה עם וירוס, HuESC ו / או iPSC (כאשר רלוונטי), כמו גם טיפול בעכבר, קבלת עוברי עכברים, וביצוע ניתוחי עכבר. להזדווגויות מתוזמן, היום של התקע נחשב יום עוברי 0.5 / 0.5 ימים לאחר coitum-(E). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטי Microinjection: עבור לשעבר רחם microinjection, למשוך טפטפות זכוכית (צינורות נימי ורוסיליקט הקוטר חיצוניים 1.2 מ&quot;מ) באמצעות חולץ פיפטה / beveller לקבל מיקרומטר קוטר 1 או 10 פנימי קצה וצורת קצה חדה וחרוטים להזריק DNA או תאים, בהתאמה. זריקות בתיווך אולטרסאונד, שימוש מותאם אישית מחטים סטריליות, אשר יש קוטר חיצוני / פנימי (OD / ID) של 1.14 mm/0.53 מ&quot;מ, עם טיפ 50/35 OD מיקרומטר / זהות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי מלאות סיליקון: הכן סיליקון כפי שמתואר במדריך. למלאצלחת פטרי זכוכית נקייה 60 קוטר מ&quot;מ עם שכבת אלסטומר של ~ 1 סנטימטר. למנוע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירים: שמור את כל מכשירי ניתוח סטרילי לפני ובמהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ה-DNA: הוסף 3 DNA מיקרוגרם ו12 μl Opti-ממ בצינור אחד. הוסף 3 Lipofectamine μl 2000 ו12 μl Opti-ממ בצינור אחר. דגירה במשך 5 דקות ב RT ולערבב את שני הפתרונות. השתמש באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תא: הכן השעיה של 10 6 תאים / מיליליטר DMEM (של Dulbecco נשר בינוני, גלוקוז גבוה ו50% בסרום חולדה). 50 μl של השעיה תא הסופית הוא מספיק ל8-10 עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוע הכנה: השתמש בניאון הירוק CDCFDA-SE ב25 מ&quot;ג / מיליליטר DMSO. הכן 20 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C. לדלל 1:100 / 1:200 בתמיסת מלח או PBS סטרילי לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת וירוס: השתמש-GFP-לבטא PGK lentivirus דור 3 rd מסחרי עם כייל של ~ 10 9 -10 10 טרהnsducing יחידות / מיליליטר DMEM. להכנת lentivirus, ראה Tiscornia et al. 14 ללבוש ציוד מגן אישי ולהשתמש בבטחה ובלהיפטר מנגיף. </li></ol> 2. אוסף של E9.5 וE10.5 עוברים לvivo הזרקה אקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר בהריון ביום עוברי 9.5 או 10.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את החזה והבטן של העכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו האמצע הגחון כדי לפתוח את הבטן ולאחזר את קרן הרחם ב RT ב-PBS ולהעביר אותו אחרי שני שוטף PBS לצלחת פטרי המלא בסיליקון עם מדיום M16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את קרן הרחם עם סיכות חרקים לשכבת סיליקון כך שצד vascularized של הרחם הוא בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את פני השטח של הרחם עם מלקחיים בסדר, וכובע של decidua ב1 מ&quot;מ מתחת לפני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשלוף את העובר בצק החלמון ע&quot;י פרישת קירות decidua. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את העוברים על 37 מעלות; C בM16 בינוני לפני הזרקת תא. להזרקה, כל עובר מועבר לצלחת סיליקון מלאה בינוני M16 מראש חימם על 37 ° C. </li></ol> 3. DNA או הזרקת תאים תחת סטראו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את פיפטה הזכוכית מהחלק האחורי עם מזרק המילטון ולנער את פיפטה כדי להסיר בועות בקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פיפטה על בעל microinjection; להגדיר את הלחץ החזק ל50 (DNA) או 30 (תאים) hPa, ולחץ ההזרקה 150 ל( DNA) ל300 (תאים) hPa. קבע את זמן הזרקה ל0.2 שניות (DNA) או 0.5 שניות (תאים). הגדרות אלה עשויות להשתנות מעט בהתאם לסוג של microinjector ופיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העובר לתחתית סיליקון דרך שק החלמון בלי לגעת בעובר התקין. צפה באזור של הלב ולפתוח את השק רק מעל אזור זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 סיכות סביב העובר כדי למנוע כל תנועה במהלך הזרקת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micromanipulator (למצב ידני), slowlמיקום Y קצה פיפטה בזווית של ° 45 מעל קרום הלב, בדיוק מעל האזור של הלב שהוא להיות מוזרקים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את פיפטה לתוך האזור של עניין ולעורר את הזריקה. קח את פיפטה מהר ככל האפשר. ודא הלב פועם כהלכה לאחר הזרקת ה-DNA / תא. </li></ol> 4. עובר, לב מבודד, וexplant תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות עוברי E9.5 ב25% בינוניים M2 ו75% בסרום עכברים, השלימו עם פניצילין / סטרפטומיצין, מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס וחומצן עם 40% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מדיום תרבות מיליליטר בשפופרת זכוכית 25 מיליליטר, בעדינות להוסיף את העובר, וחמצן עם 40% O 2 לפני הברגת הכובע על הצינור. דגירה עד 36 שעות על 37 מעלות צלזיוס בעוד סיבוב או טלטול (30 סיבובים / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת הזמן הרצויה (למשל 24hr), לנתח את לבם בזהירות עם מלקחיים בסדר, בלי לגעת בלבם, על ידי דה הראשוןcapitating העוברים; הלב הוא קל לבלו על ידי משייכתו החוצה באמצעות מערכת יצוא דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מבודדת לב עבור שעות נוספות 36-48 DMEM עם FCS 50% על הוספת Matrigel מצופה נקבעה ב12 גם צלחת. ראה דאייר ופטרסון (2013) לפרוטוקול משופר של לב תרבות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את כל explant של האזור של עניין. כדוגמא, לנתח את תעלת atrio-חדרית (AVC) ותרבותה ל48 ​​שעות על קולגן סוג 1 ג&#39;ל 16. </li></ol> 5. הזרקה מונחה אולטראסאונד שבלב n רחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה של מכשיר אולטרסאונד וmicroinjector: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת אולטרה סאונד ברזולוציה גבוהה עם מתמר 40 MHz והתקנת microinjection על מעקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את עוצמת הזריקה על microinjector ב69 NL לכל זריקה. ראה מדריך לmicroinjection של היצרן עבור תכנות microinjector. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת microiהתקנת njection והזרקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח micropipette זכוכית בmicroinjector. כדי להבטיח הזרקה, מעיל ראשון יעיל בצד הפנימי של פיפטה עם שמן מינרלים על ידי aspirating עד הנפח המקסימאלי. ואז להוציא את השמן שוב, ומשאיר 1-2 מ&quot;מ של שמן בתוך המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב injectate עד לעצמה המרבית. היזהר שלא לגעת במשטחים עם קצה המחט כמו זה יהיה להקהות את החוד ולעשות זריקה קשה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצב את קרן הרחם המכילה את העוברים במהלך הזרקה, השתמש בצלחת פטרי עם הותאם חור באמצע (2.5 ס&quot;מ קוטר), מכוסה על ידי קרום סיליקון דק עם שסע קטן לחתוך במרכז, ולמקם אותו מעל אתר החתך . לייצב את צלחת פטרי על שולחן הטיפול של עכבר על ידי מיקום 3-4 גושים של חימר מתחת לשולי הצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך הזרקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן של עכבר בהריון (בשלב העוברי הרצוי) לפני anestheSIA להסרת שיער. פנק את הבטן עם סוכן הסרת שיער כימי להסרת שיער שייר ולחטא עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בהריון עם החמצן / isoflurane באמצעות מסיכת הפנים. השתמש isoflurane 3-5% ב100% חמצן להרדמה ראשונית, ואחריו 1-1.5% במהלך השאר של ההליך. ודא שהעכבר הוא מורדם כראוי על ידי בעדינות צובט כפות ו / או בזנבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את עכבר פרקדן על שולחן הטיפול של עכבר (שנקבע לחום על 37 מעלות צלזיוס) ולכסות את העיניים עם חומר סיכה על מנת למנוע התייבשות של הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ג&#39;ל האלקטרודה על האלקטרודות וידביק את כפות לאלקטרודות כדי לפקח על קצב לב, קצב נשימה, ואק&quot;ג. מקם מדחום רקטלי כדי לפקח על טמפרטורת גוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא תחילה שהעכבר הוא בהריון על ידי הדמיה וסופר את העוברים על ידי אולטרסאונד. החל ג&#39;ל אולטרסאונד על הבטן ומקם את סריקת הראש מעל לשלפוחית ​​השתן. לשם עקביות, לדמיין את שלפוחית ​​השתן ראשון,ולספור עוברים בצד השמאל וקרן רחם תקין, החל מהעמדה של שלפוחית ​​השתן. ודא שלב עוברי מכה כרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם העכבר הוא בהריון, מקם את צלחת פטרי מעל אתר חתך העתיד עם חימר. לחץ על הצלחת מעט על הבטן, כך שהמנה היא במגע ישיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת ולעקר את הבטן שוב. ביצוע חתך קו האמצע הגחון 1.5-2 סנטימטר, כ 0.75-1 ס&quot;מ מעל הנרתיק, כדי לפתוח את הבטן והצפק. הימנע מפגיעה באיברים פנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Exteriorize השמאל או קרן רחם תקין עם מלקחיים, בעדינות למשוך אותו דרך קרום סיליקון של המנה, ולייצב את הצלחת על החימר שוב. למנוע נרחב מושכים או מניפולציה, שכן דבר עלול לגרום לדימום של כלי הרחם והמוות בטרם עת של האישה ו / או עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את העוברים שוב על מנת להבטיח רישומים נאותים של עוברים שהוזרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ג&#39;ל אולטרסאונד על uקרנות terine לתמונת הלב ועל מנת למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת העובר הראשון שהוזרק. בדקו מכות נורמליות של הלב העוברי ולשמור תיעוד של את כיוון הגולגולת, הזנב ושמאל וימין של העובר. במידת צורך, למקם מחדש את קרן הרחם מעט כדי להבטיח כיוון נכון. אם זה מוכיח קשה, על מנת להעביר את העובר הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את הרחם בזהירות עם מחט microinjection כדי למקם את המחט בזווית של ° 45 מעל העובר, מעט מחוץ לקרום הלב (איור 3). לתיוג של תאי epicardial, תמונת הלב בארבעה חדר תצוגה ולמקם את המחט כך שיצביע לכיוון חריץ atrio-חדרית (איור 3). אם הזווית צריכה להיות מותאמת, לשלוף את המחט, ולמקם מחדש. לא להתאים את הזווית עם המחט בתוך הרחם, שכן זה עלול לשבור את המחט. למנוע ניקוב רקמות אחרות, כגון גפיים או שליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את המחטעל קיר קרום הלב ולנקב אותו עם תנועה עדינה, אבל מהירה. באופן כללי, לא תהיה התנגדות מסוימת, אבל הזזת המחט מהר מדי עלולה לגרום לקצה המחט לנקב את הלב עצמו. טיפ צריך בסופו של דבר בחלל קרום הלב של גרוב atrio-חדרית. במקרה של דימום קרום הלב, תאי דם יהיו גלויים כתבנית כמו שלג לבנה. אם זה המקרה, להפסיק להזריק את העובר ולעבור לעובר אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק injectate. הזרק מקסימאלי 700 NL אל תוך חלל קרום הלב כדי למנוע השפעה שלילית על התפתחות לב. לפקח על ההזרקה הנכונה על ידי נפיחות קלה, זמנית של שק קרום הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, למשוך את המחט החוצה ולאשר כי injectate עדיין יכול להיפלט כדי להבטיח שהמחט לא הייתה סתומה על ידי ברי רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם מחדש את שולחן טיפול לתמונה ולהזריק את העובר הבא. שמור את מספר העוברים המוזרקים למקסימאליים 3-4 (בקרן רחם אחת) כדי למנועהרחיב את ההרדמה, כדי לאפשר לעוברי שליטה בקרן הרחם מתנגדת, וכדי להבטיח שההליך לא הפריע התפתחות עוברית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהזריק את המספר הרצוי של עוברים, להסיר ג&#39;ל אולטרסאונד העודף ומניח בעדינות את קרן הרחם בחזרה לתוך הבטן בתנוחה הנכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הבטן האימהית באמצעות שכבה אחת של תפר להצפק ואת שרירי בטן, ושכבה שנייה של תפר לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את העכבר עם המנה הראשונה של תרופות לשיכוך כאבים. השתמש בזריקה אחת של 0.05-0.1 דקות מ&quot;ג / קילוגרם עצירות 15 לפני סיום הרדמה ושלוש זריקות נוספות עם 12 מרווחי שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק את ההרדמה ולנטר את העכבר להתאוששות נאותה מההליך. בית העכבר בהריון בכלוב נפרד למשך הרצוי של מעקב. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li><li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials.">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li><li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li><li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells.">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li><li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken.">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells.">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+the+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal.">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li><li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse.">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

לשעבר פרוטוקולי ההזרקה תוך לב vivo שתוארו לעיל נועדו לשמור על תפקוד שריר הלב לפחות 48 שעות באמצע הבמה עוברים (E9.5-E11.5) עכבר. הזרקת גישות אלה מאפשרים להזרקה ממוקדת במרחב של ה-DNA או תאים. כמה דוגמאות שמוצגים איורים 1-3 לספק הוכחה של קונספט להתוויית vivo לשעב?...

לפני יותר מעשור, בתאי גזע עובריים אנושיים (HuESCs) כבר נגזרו מבלסטוציטים אנושי 1. מאז, תאים אלה הפכו את הנושא של תחום חשוב של מחקר המתייחס לשאלות שלא סופקו בביולוגיה התפתחותית אנושית. HuESCs לי יתר סיפק תקוות ברפואת רגנרטיבית. בשנים האחרונות, תאים אנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) כבר נוצרו מהתאים סומטיים מטופל ספציפי, המספקים מודלים של מחלה גנטית 2. רבים בפרוטוקולי מבחנה להתמיינות של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה כלפי שושלות תאים שונות, כוללים שושלות לב 3, כבר דיווח. התאים מובחנים לעתים קרובות phenotyped על ידי ניתוח של RNA וביטוי חלבון, immunostaining, ו / או בבדיקות תפקודיות מבחנה. עם זאת, נגזרים בתאי גזע pluripotent צריך להיות ממוקם בסביבה עוברית תקינה על מנת לבדוק אם הם רוכשים את cel מלאגורל ליטר של עמיתו העוברי שלהם ובין אם הם לשחזר את התפקוד vivo באמיתי בתגובה לאותות אזוריות. בעוד הנדסת רקמות היא מבטיח, זה עדיין לא מספק את כל הרמזים ידועים ובלתי ידועים של הראוי in vivo מתפתחים רקמה עוברית 4,5. תא תיוג עם צבעים או וקטורי רטרווירלי בעוברים, לרבות עוברי עכברים, הביא מידע חשוב באשר למקור העוברי של שושלות תאים במהלך התפתחות לב 6. לדוגמא, לצבוע הזרקה אל תוך חלל קרום הלב של עוברי עכברי vivo לשעבר, ואחריו תרבות במבחנה של לבבות בודדים, שימש לתווית תאי epicardial וצאצאיהם 7. עם זאת, צבע ותיוג תא רטרווירלי כבר מיושמים בעיקר לעוברי עכברים מוקדמים עם איברים עדיין מפותחים, או עוברי עופות, שהם יותר נגישים בקלות 8. יוצא מן הכלל הוא במוח, שהוא קל יותר למקד בדוארmbryos 9,10. גישה כזו טרם יושמה אל לב העכבר העוברי הפועם. כדי להשלים את התיוג ישיר עם צבעים או וירוס ולבצע שושלת התחקות בעוברי שלב מתקדמים יותר בעכבר ועכברים בוגרים, גישת תיוג תא כבר בשילוב עם ניתוח של עכברים הטרנסגניים באמצעות טכנולוגית Cre / לקס. גישת Cre / קס 11 עם זאת תכונות מסוימות מגבלות עקב הספציפיות spatiotemporal של אזורי רגולציה גנומית להשתמש בכונן ביטוי של recombinase, ואת היעילות של רקומבינציה Cre / קס 12. יתר על כן, גישה זו אינה מתייחסת באופן מלא על השאלות הספציפיות של רכישה מונעת נדידת תאים של גורל תא כפי שהוא יכול רק לתייג מבשר לאחר ההפעלה של אזור הרגולציה להשתמש בכונן ביטוי Cre. כמו כן, לא ניתן להחיל על עוברים אנושיים לסוגיות אתיות ברורות. בהתחשב במגבלות אלה, עיצבנו סדרה של p החדשrotocols להזרים מגוון של סוכני תיוג תא כגון צבעי ניאון, וירוס, מאפנני ביטוי גנים כגון shRNAs ווקטורי תיוג תא מבוסס ה-DNA, או בתאים בעובר של העכבר בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח באזורים ממוקדים של לב. זריקות ה-DNA / התא להשתמש סטראו ומכשיר microinjection פשוט בשילוב עם vivo לשעבר תרבות עובר עד 48 שעה, או לב מבודד או תרבות explant עוברית ל48-72 שעה. גם אנו מדווחים פרוטוקול microinjection תיווך אולטרסאונד בלב העוברי של עכברים ברחם. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפיתוח של עוברים 13 ומאפשרת מעקב ארוך טווח של injectates ו / או תאי שכותרתו. מצאנו כי גישות אלו לשמר את התפקוד של האיברים ולספק סביבה ייצוגית יותר מאשר בדיקה במבחנה של פוטנציאל של תאי גזע. הוא גם מספק את ההזדמנות כדי לעקוב אחר נדידהכותרתו של ו / או הזריק תאים כדי לפקח על גורלם. סופו של דבר, זה אמור להניב הבנה טובה יותר של דפוסים רקמה אזוריים ותהליכים ביולוגיים מרכזיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

בדיקת גורלם של תאי גזע עובריים או נגזרי pluripotent במבחנת פרוטוקולים הובילה לתוצאות שנויות במחלוקת, שאינו משקפים בהכרח in vivo את הפוטנציאל שלהם. רצוי, צריכים להיות ממוקמים בתאים אלה בסביבה עוברית תקינה על מנת לרכוש פנוטיפ מובהק שלהם. יתר על כן, שושלת תא התחקות מחקרים בעכבר לאחר סימון תאים עם צבעים או וקטורי רטרווירלי נשארה מוגבלת בעיקר לעוברי עכברים בשלב מוקדם עם איברים עדיין מפותחים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עיצבנו פרוטוקולי microinjection סטנדרטיים ותיווך אולטרסאונד כדי להזריק סוכנים שונים באזורים הממוקדים של הלב בעוברי עכברים בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של התפתחות. explant או עוברים עובריים בתרבית ואז או שמאלה כדי לפתח עוד יותר ברחם. סוכנים אלה כוללים צבעי ניאון, וירוס, shRNAs, או תאי גזע ובתאים שמקורם בתא. הגישות שלנו מאפשרות לשימור של פוnction של האיבר תוך מעקב הגירה וגורלם של תאים שכותרתו ו / או בזריקה. ניתן להאריך בטכנולוגיות אלה לאיברים אחרים ויהיה מועיל מאוד כדי לענות על שאלות ביולוגיות מרכזיות בביולוגיה של התפתחות.

שימוש בפרוטוקולי ההזרקה שתוארו לעיל, יכולים להיות מתויגים תאים ו / או מוזרק ללב העכבר העוברי. כהוכחה של מושג, כמה דוגמאות מוצגות בי פרוטוקול ההזרקה וvivo לשעבר explant AVC, לב מבודד, או תרבות עובר כולו אוחדו (איור 1). איור...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts at JoVE.com

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  Aix-Marseille University.  אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח. 

Video: Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

הפרדת אקטודרם עכבר העוברי פן וmesenchyme

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...