ברצוננו להודות מקורות המימון שלנו: המכון בקליפורניה הרגנרציה לרפואה קלינית הדרכה עמית גרנט (), הקרן הלאומית למדע (MW), פרס איירין Perstein (TCM), הקולג&#39; האמריקאי של המנתחים (TCM), האגודה האמריקאית לרפואת ילדים כירורגי ( TCM), ואת מצעד הפרוטות (TCM).

1. הכנת pipettes Injection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את חולץ פיפטה כזה הפרדת פיפטה זכוכית מתרחשת תוך 15 שניות (ראו הוראות היצרן לגבי כיול). פיפטה יהיה להתחדד שבו הוא מפריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קצה פיפטה כך את המרחק מתחילת להתחדד לסוף פיפטה הוא 1.04cm כדי 1.05cm. אורכו של פיפטה עומדת ביחס הפוך בקוטר של פתח פיפטה. שים לב כי קבלת פיפטה יותר גם התוצאות טיפ חלש כי הוא רגיש יותר שבירה במהלך ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצעד הבא בקבלת פיפטה היא ליצור שיפוע חלקה על ידי חידוד טיפ על גלגל השחזה יהלום. בזמן חיתוך פיפטה לגודל המתאים, פיפטה הפסקות תכופות עם שפוע טבעי בקצהו אשר חייב להיות בשימוש בעת הצבת פיפטה על ההגה. במהלך תהליך זה, חשוב בעדינות שאר פיפטה על ההגה חידוד ומדי פעם להעריך מחדש כדי לוודא פיפטה עדיין לגעת בהגה (כמו שפוע הופך חלק יותר, זה יהיה לאבד קשר עם ההגה השחזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שפוע חלקה, קצה פיפטה חייב להיות מחודד (איור 1). הגבהה של פיפטה כך זה כבר לא נוגע גלגל השחזה, לסובב אותו עם כיוון השעון על 10-50 מעלות, במקום לחזור פיפטה על ההגה השחזה מסתובבת עבור ~ 10 שניות. למשוך את פיפטה מן ההגה חידוד ועכשיו לבחון את קצה. שלב זה בדרך כלל יש צורך לחזור עם כמה התאמות קטנות כדי ליצור קצה חד. אם פיפטה ממוקם בקצה שלה במשך זמן רב מדי, הוא סיכוי גבוה יותר לפתח משטח אחיד (איור 1). לאחר השלמת צד אחד, אתה יכול להמשיך לחדד את הקצה השני על ידי חזרה על השלבים שלעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטוש בלתי מחיק למתוח קו ההיקפי כל 4mm המוצא שבו להתחדד של פיפטה מתחיל. לצבע אלה מתאימות 5uL של נפח. </li></ol> 2. ברחם להשתלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת החומר להזרקה (תאים לדוגמא, וירוס, וכו &#39;) אתה יכול להגדיר עבור הזריקה. אנו משתמשים microinjector מחוברים אוויר דחוס עם ההגדרות הבאות: (הגדרות לחץ: קלט 60-80 psi, למלא 40 psi, להזריק 8-12 psi, 0 psi איזון, החזק 0 psi; זמן הזרקת 100 אלפיות השנייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקר את פיפטה הזרקה, לנקות אותו פעמיים עם EtOH 70% ואחריו פעמיים עם סטרילי 1X PBS. כאשר קצה פיפטה הוא שביר מאוד, אנחנו לא ממליצים מעוקר pipettes ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריקות יכול להיעשות באמצעות 2.5x-3.5X loupes הגדלה או מיקרוסקופ לנתח. הכנת שטח נוהל שלך בשמיכה מחממת, תאורה, מכשירי ניתוח הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בהריון (אנו מנצלים isoflurane וחמצן שיישלח באמצעות יחידת זרימה רציפה הרדמה). הנח את העכבר על כרית חימום במצב להדביק פרקדן וכל איבר עם קלטת כדי לאבטח את העכבר במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ פרווה. ואז, כפפות כירורגיות סטריליות, מכין את הבטן עם 10% povidone-יוד ואחריו אלכוהול, להזריק כגון כאבים כמו עצירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך 1cm בבטן התחתונה (ההיבט נחות ביותר של החתך צריך להיות כ 1cm מעולה introitus). לחתוך את העור ואת fascia. היזהר שלא לפצוע את אברי הבטן (המעיים ושלפוחית ​​השתן) אשר מיד מתחת לשכבה דקה של fascia. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת צמר גפן, בעדינות למתוח את fascia ולספק את הרחם הרה להולדת דרך החתך. ספירת המספר הכולל של העוברים על ידי הראשון לזהות את השחלות ימין ועל שמאל כדי לוודא שאתה לדמיין את הרחם כולו. מניחים את הרחם בחזרה בחלל הבטן לפני שתמשיך כך עוברים נשארים חמים בעת להתכונן זריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את העוצמה המתאימה של חומר במספר העוברים אתה מתכוון להזריק. בזמן מילוי את המחט עם מדגם שלך, חשוב לשמור על קצה פיפטה טבלו להימנע aspirating מדגם לתוך צינורות microinjector. מאז הם בדרך כלל תאים בנפח קטן, אנחנו בדרך כלל למקם אותם microfuge קטן (לשעבר: 0.5mL) צינור או ישירות על פיסת Parafilm להיות מסוגל למלא את המחט בלי לשבור את קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחזיק כל העובר ולזהות את החלק של העובר בכוונתך להזריק (כבד למשל, חלל הצפק, רגל, וכו &#39;). עם האגודל לאצבע המורה, אתה חייב לייצב את העובר בתוך חלל מי השפיר, כך שהוא אינו מסתובב בעת ביצוע ההזרקה. חשוב להחזיק את העובר מספיק חזק כדי לייצב אותו בעדינות עדיין מספיק כדי למנוע פגיעה בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף את פיפטה דרך הרחם, amnion, עור העובר, אל איבר המטרה. אם פיפטה היא חדה, היא צריכה לעבור בקלות דרך רקמות אלו. אם קצה פיפטה הוא משעמם, אתה wi<html> האהלה הודעה הרחם והקרומים השפיר יהיה. להזריק את נפח הרצויה לתוך העובר כל אחד. זה הכרחי כי התנועות שלך להיות יציב בתקופת ההחדרה, הזרקה, ונסיגה של פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בנפח הרצוי מוזרק, למשוך את פיפטה בזהירות. אם נעשה כראוי, החומר לא אמור לדלוף החוצה מחלל הרחם מי שפיר או. אם חור גדול נוצר amnion, אשר ניתן לזהות על ידי דליפה של מי שפיר, אז הישרדות היא בסכנה. לבסוף, ללימודים שכוללות קצירת לאחר הלידה, עוברים כל חייב לקבל זריקות מושלם מבחינה טכנית, שכן אין שום דרך להבחין בעוברים הזריק uninjected לאחר הלידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה מבצע זריקות לתוך הכבד העוברי, אתה עלול מדי פעם לראות דם קצה פיפטה לאחר מסוגר, זה מאשר שאתה במצב הנכון לא אמור להשפיע על ההישרדות. אם ביצוע התוך צפקי זריקות, במטרה מעט מתחת בכבד העובר. זריקות לשריר, ייתכן עמדת העובר כדי לזהות את הירך עצם הירך לבין להזריק את השריר הכואב. לבסוף, זריקות תוך חדרי, קל לראות את התפרים העטרה לכוון את פיפטה ליעד המתאים. זריקות אלו, טפטפות בקוטר מעט גדול יותר נדרשים כדי לחדור את הגולגולת בלי לשבור את פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, בזהירות המקום הרחם חזרה לתוך חלל הבטן. ודא הוא אינו מעוות על עצמו או סביב אספקת הדם שלה. ספק 1mL של סטרילית 1X PBS ב חלל הצפק של האם להחליף את כל הנוזלים שאבדו במהלך ההליך. סגירת החתך עם תפר 2 שכבות קלועה 5-0 נספגים (לשעבר: Vicryl). קודם לסגור את fascia מבלי לפצוע את המעי או שלפוחית ​​השתן הבסיסית, ולאחר מכן סגור את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, שלאחר הליך תרופות יכול להיות מנוהל על שיכוך כאבים. חזור כל נקבה מוזרק לכלוב יחיד משלו במקום את הכלוב על שמיכה מחממת. צג את העכבר עד שהוא זקוף. שים מצע בכלוב והמקום העכבר באזור שקט של המתקן העכבר איפה שזה לא צריך להיות מופרע (כלומר ללא ניקוי הכלוב) עד מספר ימים לאחר הלידה. צמצום כל הלחץ נוספים החיה יקטין את הסיכויים של צירים מוקדמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהשלמת את הזריקות, נקי פיפטה שלך פעמיים עם סטרילי 1X PBS ו EtOH פעם אחת עם 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקבות מוזרק יש לשים לב יומי כדי להבטיח שהם מחלים ההליך ללא קושי. החתך צריך להיות פיקוח על סימני נפיחות ודלקת, הפרדה הפצע, אחרים של זיהום. משככי כאבים לאחר הניתוח יכול להינתן לפי הצורך. </li></ol> 3. נציג תוצאות: ההישרדות של עוברים מוזרק לאספקה ​​לטווח הוא הגורם המגביל העיקרי להצלחה עם טכניקה זו. בהתאם הזריקו את החומר ואת המתח של העכבר בשימוש, שיעורי ההישרדות יכול להשתנות. באופן כללי, זריקות של תאים hematopoietic לתוך wild-type עכברים ב E14 צריך להביא לפחות 50% חיים שנולדו הגורים. שיעור גבוה יותר של הישרדות אפשריים בהתאם גם את ההיבטים הטכניים של הזריקה, כמו גם את המאפיינים של עכברים להיות מוזרק. מזעור הטראומה הממברנות הרחם מי שפיר הוא ההיבט הטכני החשוב ביותר של פרוטוקול זה. שארפ, טפטפות בקוטר קטן תגרום טראומה מינימלית הרחם במהלך ההזרקה. אנחנו לא ממליצים על שימוש במחטים זריקה רגילה כמו ברמה של טרום מפוברק מחטים גדול מדי יגרום חור גדול הרחם. זכוכית בעבודת יד pipettes הזרקת הם רק מחטים בקוטר קטן יכול להיות מנוצל עבור זריקות ב ברחם. טכניקה ניתוחית זהירה וקפדנית, כולל טיפול עדין של הרחם הרדמה קצר היא קריטית גם עבור תוצאות אופטימליות. המאפיינים הספציפיים של העכברים הנמען כגון רקע גנטי, גיל ההריון, והגודל החול יכול להשפיע גם על הישרדות. זנים מסוימים של עכברים רגישים יותר צירים מוקדמים אובדן הריון בהתאם הרקע הגנטי שלהם. טראנסגנטי 15 חיות עם מומים או שרירים ניווניות יכול להיות בעל יכולת לקויה לספק עוברים נרתיקית לאחר שעברו פיום בטן קו האמצע. 8 אלה נשים בהריון עשויים לדרוש מסירה על ידי ניתוח קיסרי סעיף. מצאנו גם כי גיל ההריון בזמן הזריקה יכולה להשפיע על הכדאיות. עוברים כי הם מתחת לגיל 12 יום עובריים יש שיעור נמוך יותר של הישרדות מאשר עוברים יותר. לבסוף, מצאנו כי בגדלים אשפה גדול (&gt; 10 עוברים) נוטים להיות בעלי שיעור גבוה יותר של מות העובר לאחר ההזרקה. שימו לב לשני ההיבטים הטכניים של הטכניקה הזו ואת המאפיינים הספציפיים של העכברים להיות מוזרק יכולים למקסם ההישרדות של עוברים מוזרק. ve_content &quot;&gt; כאשר שיטות אלה מבוצעות כראוי, אפשר לצפות כי כל העוברים נחשפים לחומר המוזרק. בדומה להגדרה לאחר הלידה, לעומת זאת, ההפצה המוצלחת של תאים או נגיפים ברחם לא תמיד התוצאה engraftment תורם התא או גן ביטוי, בהתאמה. engraftment בתאי גזע, למשל, תלויה במספר גורמים כגון המינון ואת המקור של התאים המושתלים. כמו כן, ההצלחה של התמרה ויראלית היא, בין השאר, נקבע לפי סוג של וקטור ויראלי בשימוש. צריך להבין את הגורמים הרבים הישרדות השפעה הגור, engraftment הסלולר, ו transduction ויראלי כדי להשיג הצלחה עם פרוטוקול זה. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. דיאגרמה המתארת ​​נכונה חידוד של pipettes הזרקה (שלב 1.4)

<ol>
	<li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow.">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li><li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+(SCIDXI).">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li><li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers.">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li><li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li><li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation.">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li><li>Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchimerism+and+tolerance+after+in+utero+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice.</a> J Surg Res. 77, 1-5 (1998).</li><li>Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chimerism+threshold+predicts+sustained+engraftment+and+NK-cell+tolerance+in+prenatal+allogeneic+chimeras.">Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras.</a> Blood. 112, 5245-5253 (2008).</li><li>Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+bone+marrow+and+fetal+liver+cells+after+in+utero+transplantation+in+MDX+mice.">Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice.</a> J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).</li><li>Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+chimerism+following+in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+murine+models+of+hemoglobinopathy.">Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy.</a> Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).</li><li>Bouchard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+in+cardiac+and+skeletal+muscle+following+fetal+administration+of+adenoviral+or+adeno-associated+viral+vectors+in+mice.">Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice.</a> J Gene Med. 5, 941-950 (2003).</li><li>Meza, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+pyruvate+kinase+deficiency+in+mice+by+gene+therapy+using+the+human+isoenzyme.">Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme.</a> Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).</li><li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+liver+and+muscle+after+in+utero+injection+of+lentiviral+vectors+with+different+pseudotypes.">Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes.</a> Mol Ther. 6, 349-358 (2002).</li><li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors.">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li><li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice.">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li><li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+at+the+maternal-fetal+interface:+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression.">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li><li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells.">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li><li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector.">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li><li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice.">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li><li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer.">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מעל 50 שנים, בילינגהם, ברנט, ו מךוואר בשימוש ברחם השתלה בעכברים כדי לגרום סובלנות החיסונית חלבונים זרים. 16 מאז, כמה וריאציות של טכניקה זו שימשו כדי לענות על שאלות באימונולוגיה וביולוגיה בתאי גזע. פרוטוקול מפורט כאן היא א?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble</td>
<td>71900-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments Company</td>
<td>Model P-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>IM-300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette sharpener</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments Company</td>
<td>Model BV-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a mouse model of in utero transplantation

השתלת בתאי גזע ווירוסים ברחם יש פוטנציאל עצום בטיפול בהפרעות מולדים בעובר אנושי. לדוגמה, השתלה ברחם (IUT) של בתאי גזע hematopoietic שימש בהצלחה לטיפול בחולים עם כשל חיסוני חמור 1,2. משולב בתנאים אחרים, לעומת זאת, IUT כבר ניסו ללא הצלחה. 3 בהתחשב אלה תוצאות מעורבות, בזמינות מודל לא אנושיים יעיל ללמוד את sequelae הביולוגי של השתלת תא גזע ו ריפוי גנטי הוא קריטי כדי לקדם את התחום. אנו ואחרים השתמשו במודל עכבר של IUT ללמוד הגורמים המשפיעים engraftment מוצלח של ברחם התאים המושתלים גזע hematopoietic הן wild-type 4-7 עכברים ואנשים עם מחלות גנטיות. 8,9 סביבת העובר גם מציע יתרונות ניכרים עבור ההצלחה של בריפוי גנטי ברחם. לדוגמה, משלוח של 10 adenoviral, adeno הקשורים נגיפית 10, retroviral 11, 12,13 ו וקטורים lentiviral לתוך העובר הביא התמרה של איברים מרובים רחוקים הזריקה במבט לטווח ארוך גן. ברחם ריפוי גנטי ולכן עשוי להיחשב כאסטרטגיה טיפול אפשרי להפרעות גן יחיד, כגון ניוון שרירים או סיסטיק פיברוזיס. יתרון נוסף של IUT פוטנציאל הוא היכולת לגרום סובלנות החיסון אנטיגן ספציפי. כפי שראינו אצל עכברים עם המופיליה, את ההקדמה של פקטור IX מוקדם בתוצאות פיתוח סובלנות חלבון זה. 14 בנוסף השימוש בו בחקירת טיפולים פוטנציאל אנושי, המודל של העכבר IUT יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור שאלות בסיסיות בביולוגיה של התא התפתחותיים גזע. לדוגמה, ניתן להעביר מולקולות קטנות שונות כדי לעורר או לעכב ביטוי גנים ספציפיים בשלבים הריונית מוגדרת ולטפל מסלולים התפתחותיים. ההשפעה של שינויים אלה ניתן להעריך את timepoints שונים לאחר ההשתלה הראשונית. יתר על כן, אפשר להשתיל pluripotent או שושלת ובתאים ספציפיים לסביבה העובר ללמוד בתאי גזע בידול בסביבה לארח לא מוקרן ו בשלוות נפש. במודל עכבר של IUT סיפקה כבר תובנות רבות בתחומי אימונולוגיה, ביולוגיה של התא התפתחותיים גזע. בפרוטוקול וידאו מבוסס זה, אנו מתארים גישה צעד אחר צעד לביצוע IUT בעוברים העכבר מתאר את הצעדים ביקורתית בעיות פוטנציאליות של טכניקה זו.

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model of in Utero Transplantation at JoVE.com

A Mouse Model of in Utero Transplantation

המודל של העכבר<em&gt; בתוך הרחם</em&gt; השתלת הוא כלי רב צדדי, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את יישומים קליניים פוטנציאל של השתלת תא גזע ו ריפוי גנטי בעובר. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה כללית ביצוע הטכניקה הזו

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

a-mouse-model-of-in-utero-transplantation

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

19.3K Views.  University of California. המודל של העכבר בתוך הרחם השתלת הוא כלי רב צדדי, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את יישומים קליניים פוטנציאל של השתלת תא גזע ו ריפוי גנטי בעובר. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה כללית ביצוע הטכניקה הזו

Video: A Mouse Model of in Utero Transplantation

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

השתלה של הריאה Valve שימוש במודל עכבר של Heterotopic לב והשתלות

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

השתלת קרנית עכברית: דגם לחקר הצורה נפוצה ביותר של Solid השתלות איברים

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

השתלת לתוך כרית עכבר השחלות שומן

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

בטכניקה שרוול במודל של עכברים של אבי העורקים השתלת - סרט הדרכה

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

העכבר מודל עבור השתלת לבלב בטכניקה השינוי הצמיד

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

מיקרוסקופית Intravital ו אינדוקציה פקיק ב התנוך של עכבר חסר שיער

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization and for minimizing organ damage resulting from prolonged extracorporal circulation. The goal of this paper was to demonstrate a fully functional and clinically relevant model of cardiopulmonary bypass in a mouse. We report on the device design, perfusion circuit optimization, and microsurgical techniques. This model is an acute model, which is not compatible with survival due to the need for multiple blood drawings. Because of the range of tools available for mice (e.g., markers, knockouts, etc.), this model will facilitate investigation into the molecular mechanisms of organ damage and the effect of cardiopulmonary bypass in relation to other comorbidities.

This paper describes how to perform cardiopulmonary bypass in mice. This novel model will facilitate the investigation of the molecular mechanisms involved in organ damage.

לב-ריאה במודל של עכברים: גישה מוזרה

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for acute as well as end-stage lung diseases. With the increase in clinical demand and prolonged use of ECMO, procedural optimization and prevention of multi-organ damage are of critical importance. The aim of this protocol is to present a detailed technique of veno-venous ECMO in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This protocol demonstrates the technical design of the ECMO and surgical steps. This murine ECMO model will facilitate the study of pathophysiology related to ECMO (e.g., inflammation,bleeding and thromboembolic events). Due to the abundance of genetically modified mice, the molecular mechanisms involved in ECMO-related complications can also be dissected.

Here we present a protocol describing the technique of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This murine model of ECMO can be effectively implemented in experimental studies of acute and end-stage lung diseases.

ממברנה בעיות ורידים-Veno חמצון בעכבר

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for ...