המחברים מודים ויליאם Nance (אוניברסיטת מישיגן) לעזרה בגיבוש פרוטוקולי צמיחת biofilm וג&#39;ון בטיסטה (Fluxion, סן פרנסיסקו, קליפורניה) לקבלת ייעוץ בנושאים טכנולוגיים הנוגעים למערכת Bioflux. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיות לבריאות (NIH: R21DE018820 לAHR) ואוניברסיטת מישיגן קרנות הזנק לAHR

פרוטוקול אוסף הרוק המתואר כאן נסקר על ידי אוניברסיטת מישיגן Institutional Review Board לניסויים בבני אדם. הערה: לגבי ביקורות מוסדיות לעבודת הסובייקט אנושית מסוג זה, צריכים להיות זכו הסדרים והרשאות מראש מהמוסד המארח. בפרט, תלוי במוסד, IRB או אישור אתיקה ייתכן שיצטרך לחפש ואושר לפני אוסף רוק ממתנדבים אנושיים יכול להמשיך. כסיוע להכנת בקשה, ניתן למצוא אלגוריתם / תרשים NIH שימושי כאן: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 1. הכנת נקווה הרוק לשימוש כצמיחה בינונית לסביבה שמקורן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגייס&gt; 5 אנשים על תרומת רוק. אל תיקח את כל מידע מזהה, להבטיח שאין individuals יתרום רוק אם הם חולים, או לקחו אנטיביוטיקה דרך הפה ב -3 החודשים האחרונים, או שצרכו מזון או נוזלים, למעט מים, בשעת 2 ​​הקודמת לפני התרומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף רוק ב 50 צינורות פלסטיק מיליליטר. בריכת הרוק שנאסף בכוס פלסטיק, להשאיר אותו על קרח. אין להשתמש בזכוכית כמו פולימרים ברוק ידבק משטחי זכוכית הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 2.5 מ&quot;מ ממניות 100x. (צילומים קפוא בaliquots שימוש היחיד ב -20 מעלות צלזיוס). מערבבים במשך 10 דקות בכוס פלסטיק על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר חומר חלקיקים, צנטריפוגות הרוק נקווה למשך 30 דקות ב 17,500 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הרוק עם 3 כרכים של DH 2 O לתת רבע רוק מרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר רוק באמצעות 0.22 מיקרומטר polyethersulfone (PES), מסנן מחייב חלבון נמוך. השתמש במסנן עם שטח פנים גדול, או להשתמש במספר קטן מסנני אזור. שמור רוק במיכל פלסטיק על קרח תוך סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את הרוק נקווה ב -80 &#160; מעלות צלזיוס בצינורות פלסטיק 50 מיליליטר צורך עד לגדול חיידקים. כל צינור פלסטיק מיועד לשימוש אחד בלבד וצריך להכיל לא יותר מ 35 מיליליטר ככל טוב microfluidic מחזיק מרבי של 1.2 מיליליטר (1.2 מיליליטר x 24 בארות = 28.8 מיליליטר) ומרחב נחוץ בצינור אחד כמו רוק מתרחב במהלך הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש, להפשיר את הרוק נקווה בטמפרטורת חדר. מופשר פעם, מסנן לעקר (0.22 מיקרומטר polyethersulfone, מסנן חלבון נמוך מחייב כדי להסיר כל משקעים) פעם נוספת. </li></ol> 2. הכנת נקווה הרוק לשימוש כבידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגייס&gt; 5 אנשים על תרומת רוק. אל תיקח את כל מידע מזהה, להבטיח שאין אנשים יתרמו רוק אם הם חולים, לקחו אנטיביוטיקה דרך הפה ב -3 החודשים האחרונים, או שצרך מזון או נוזלים, למעט מים, בשעה 2 הקודמת לפני התרומה. לאסוף samples מעל 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף רוק בצינורות פלסטיק 50 מיליליטר בטמפרטורת חדר וברכת הרוק שנאסף בכוס פלסטיק בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל רוק במאגר עם גליצרול כיתה מגיב כללית autoclaved להניב מניות עם יחס סופי של גליצרול 25%, 75% רוק המכיל תא [CCS]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא רוק ב -80 מעלות צלזיוס aliquots שימוש יחיד 3 מיליליטר עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הצורך לחסן את מערכת microfluidic, aliquots מופשר בטמפרטורת חדר ונסער בעדינות על vortexer במשך 5 שניות לפני שpipetted למערכת microfluidic כמתואר בשלב 3 של הפרוטוקול, להלן. </li></ol> 3. צמיחה של Biofilms Multi-מינים שבעל פה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול מראש CFS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה ראשונה ערוצי microfluidic Bioflux עם CFS. הוספה של CFS 100 μl לכל נקודת מכירה היטב. tha &quot;B1-B24&quot; שימוש בתוכנת שליטת Bioflux, בחר זרימה &quot;ידנית&quot; ולהגדיר מערוציםt הוא לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, שנקבע גזירה ל1.0 דִין / cm² ולהתחיל זרימה למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר כדי להבטיח חלוקה הומוגנית של CFS לאורך הערוץ. ודא שיש נוזלים בכל ערוץ כניסה כדי לוודא שCFS זרם דרך כל הערוצים באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון / Pretreat CFS שנותר בבארות לשקע ולהעביר לבארות הכניסה. נפח כולל של 100 μl זה ישמש כדי לאזן נגד הלחץ שמופעל על הבידוד מהשקע בקיר גם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הִתחַסְנוּת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל נקודת מכירה היטב, להוסיף הבידוד של CCS 100 μl. מניחים את צלחת microfluidic על צלחת החום (הטמפרטורה שנקבעה על 37 מעלות צלזיוס), המדריך לבוחר בתוכנת השליטה, והזרימה להגדיר מבארות שקע לבארות הכניסה (כלומר, להפוך) ברמה של 1.0 דִין / cm² בדיוק 6 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את צלחת microfluidic על 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות, כדי לאפשרלדבקות וצמיחה של החיידקים בבידוד ראשוניים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמיחת לילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש ערוצים מחוסן, לשאוב את הבידוד פסולת מכל אחת מהבארות לשקע. הוסף עד נפח כולל של 1 מיליליטר של CFS לכל אחת מבארות הכניסה (ניתן לעשות זאת על גבי CFS הקיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את צלחת microfluidic על 37 מעלות צלזיוס, בחר ידני ולהגדיר את התכנית לפעול בדִין 0.2 / cm² במשך 20 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה מוקדמת כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את כל הנוזל מהבארות הכניסה ויציאה ולהוסיף של PBS 100 μl (pH 7.4) לכל אחד מבארות הכניסה. לזרום במשך 20 דקות ב 0.2 דִין / סמ&quot;ר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף תערובת כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים כדאיות תא להפוך את תערובת של כתם 100 μl לכל ערוץ להיות מוכתמת. באופן ספציפי, להוסיף 3 μl של 9 SYTO ו -3 μl של יודיד propidium לכל מיליליטר של PBS באמצעות ערכת צביעת כדאיות תא מסחרית כגון LIVE / DEAD. זה יוצרתערובת כתמים המכילה 10 מיקרומטר SYTO 9 ו -60 יודיד propidium מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS שנותר מהבארות הכניסה ולאחר מכן להוסיף את התערובת של כתם כדאיות תא 100 μl לכל כניסה גם. הגדר לזרום על 0.2 דִין / 2 סנטימטר ולהפעיל את הפתרון מכניסה לפורקן 45 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף הודעה מכתימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הכתם שנותר בכל אחת מבארות הכניסה ולהוסיף של PBS 100 μl לכל כניסה גם. הגדר לזרום על 0.2 דִין / cm² ולהפעיל את פתרון PBS מכניסה לשקעים עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר כדי להסיר כל כתם עודף. </li></ol></li></ol> 4. אוסף תמונה, 3D Rendering, וניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוך (CLSM) כדי לאסוף נתוני תמונת biofilm ממערכת microfluidic. ודא שCLSM הוא מסוגל לעמוד במשקל של צלחת Bioflux, אשר יכול להגיע ל -150 גר &#39;. הערה: בהתחשב באגורהnsions של ערוצי microfluidic, את הצורך ברגישות להבחין מבנה biofilm, והדרישות לגילוי אותות הקרינה בעוצמה משתנה, כך שיתאים לCLSM עם עדשת 40X 1.25 NA אובייקטיבי או אחד עם איכות דומה אופטית, הגדלה, וצמצם מספרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות לתקנן את שערי לכידת פליטה עם רווח לקזז נשמרו קבועות. ודא שעוצמת הלייזר אינה עולה על 25% כפי שזה יכול לגרום לצילום הלבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר קבצי CLSM מeica L אני קוסם סוג ile F (LIF) לשת (nvironment E icroscopy M עט O) סוג קובץ. זה מאפשר בקלות רבה יותר של גישה ותאימות בין תוכנות. השתמש בתוכנה זמינה מסחרי כגון, Imaris להמיר קבצים מסוג זה. </li></ol> Rendering 3D עבור תמונות / דמויות <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהומרה לפורמט שת, להשתמש בתוכנה זמינה מסחרי כגון Imaris כדי להבהיר את התמונותב3D. לבצע את זה באמצעות שילוב של &quot;Easy3D&quot; ואפשרויות &quot;לעלות&quot;. הערה: שים לב לאות רקע וthresholding צריך להיעשות. פונקצית ההיסטוגרמה בImaris ניתן להשתמש כדי להשיג את טווח אוסף וזה חייב להישמר קבוע בין תמונות להיות מנותחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור תמונות באמצעות הפונקציה &quot;תמונת המצב&quot; ולהפוך את שיקול דעת לרזולוציה של תמונה לפני שמירת סוגי קבצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב תמונות לדמויות באמצעות תוכנה לעריכת תמונות כגון CorelDraw או Adobe Illustrator. </li></ol> ניתוח תמונת 3D עבור גרפים וטבלאות <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זמין באופן חופשי ImageJ 23 וסטטמ&quot;מ / COMSTAT2 38 לניתוח תמונה. הורד את החבילות מhttp://rsb.info.nih.gov/ij/ וhttp://comstat.dk/, בהתאמה. התקין את עדכון Java האחרון. הערה: JAVA פלטפורמת תוכנה צריכה להיות מותקן PRIOr לשימוש בתוכנת ניתוח תמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ImageJ עם תוסף COMSTAT2 לייבא קבצים שתו עבור כל תמונת biofilm במצב &quot;hyperstack&quot; ותצוגה עם &quot;ערוצים לפצל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לנתח שני ערוצים (אדום / propidium יודיד / ערוץ מת יצור 0, / ערוץ LIVE להיות ירוק / SYTO-9 1) באמצעות הפונקציה &quot;היסטוגרמה&quot; של ImageJ. פונקציה זו מציגה את המספר הכולל של פיקסלים של קבצים שתו 8 סיביות (כפי שמוצגים &quot;ספירה&quot;) בכל עוצמת צבע 0-255 (כפי שמוצגים &quot;ערך&quot;), עם 0 פיקסלים להיות ללא אות (ברקע) ו- 255 ישות פיקסלים עם הרוויה אות מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים לתוכנת גיליונות אלקטרוניים ולתקן את כל ערכי האות על ידי שקלול כל פיקסל על ידי עוצמת האות המקבילה. זו מבוצעת על ידי הכפלת המספר הכולל בעוצמת אות שניתנה על ידי הערך המספרי של 8 ביט (0-255) של שעוצמת האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסכם את כל הערכים המשוקללים, 0-255, לשני הערוצים עבור כל תמונת biofilm נתפסה. קח את סכום הערכים המשוקללים לשני הערוצים כדי לקבוע את האות כוללת אחוזים משני ערוצים. לעשות את זה כדי לקבוע את היחס או אחוזים ביחס אדום ואות ירוק אחוזים (כלומר אחוזים &quot;מתים&quot; ואחוזים &quot;LIVE&quot; לכל טיפול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוחים סטטיסטיים, למשל באמצעות מבחן t שני זנב שונה לשונות בלתי שוויוניות. ערכים של p &lt;0.05 נחשבים משמעותיים ואלה הערכים של p &lt;0.01 נחשבים משמעותיים ביותר. </li></ol></li></ol> 5. תאי הקציר Biofilm לניתוח תרבות עצמאי <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הרוק בילה ושאינו בשימוש מבארות כניסה ויציאה. לשטוף את הבארות עם 1 מיליליטר מים מזוקקים סטריליים שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מים מזוקקים סטריליים 100 μl לבארות כניסה ו, באמצעות ממשק שליטת תוכנה, להעביר אתמים מזוקקים סטריליים קדימה דרך הערוצים ב&gt; 8.0 דִין / 2 סנטימטר (קצב זרימה&gt; 745 μl / hr, גזירה של 800 שניות -1) במשך 5 דקות לפחות. חזור בכיוון ההפוך במשך לפחות 5 דקות ולאחר מכן לחזור על קדימה ולהפוך את תהליך שלב כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק על ידי אור או על ידי מיקרוסקופ epifluorescence (אם תאים היו מוכתמים / כותרת) להסרה יסודית biofilm (איור 2). לאסוף את תא ההשעיה 100 μl ולאחסן ב -80 ° C לניתוח התרבות עצמאית. ניתוח עלות-תועלת של הרכב קהילה יכול להיות מושגים באמצעות שימוש בpyrosequencing חיידקים בקידוד תג FLX amplicon (bTEFAP) באמצעות הגישה המתוארת בet al Nance. 20 </li></ol>

<ol><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+as+complex+differentiated+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).</li>
<li>Wimpenny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metropolis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+physiology%22%5BJournal%5D)">Microbial metropolis.</a> Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).</li>
<li>Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+ruin%3A+the+formation+of+disease-associated+oral+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms.</a> Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Cate, J. M., Zaura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+numerous+microbial+species+in+oral+biofilms%3A+how+could+antibacterial+therapy+be+effective%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+dental+research%22%5BJournal%5D)">The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective.</a> Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).</li>
<li>Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+and+collective+recalcitrance+of+microbial+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+physiology%22%5BJournal%5D)">The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities.</a> Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).</li>
<li>Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag">http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag</a> (2011).</li>
<li>Smith, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+H+%22Microbial+behavior%2C+%27in+vivo%27+and+%27in+vitro%22">Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro</a>. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).</li>
<li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+microbial+aspects+of+periodontal+biofilm+communities%2C+development+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment.</a> Periodontology. 42, 7-12 (2000).</li>
<li>McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%3A+In+vitro+biofilm+models%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview.</a> Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).</li>
<li>Baehni, P. C., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-plaque+agents+in+the+prevention+of+biofilm-associated+oral+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases.</a> Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).</li>
<li>Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+oral+microbial+communities+of+wild-type+and+toll-like+receptor+2-deficient+mice+using+a+454+GS+FLX+Titanium+pyrosequencer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+microbiology%22%5BJournal%5D)">The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer.</a> BMC microbiology. 10, 101(2010).</li>
<li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).</li>
<li>Auschill, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+two+antimicrobial+agents+on+early+in+situ+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+periodontology%22%5BJournal%5D)">Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation.</a> Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).</li>
<li>Coenye, T., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+model+systems+to+study+microbial+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.</a> Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+biofilms+in+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+journal%22%5BJournal%5D)">Role of biofilms in antimicrobial resistance.</a> ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).</li>
<li>Wimpenny, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+dental+research%22%5BJournal%5D)">The validity of models.</a> Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).</li>
<li>Umland, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-validated+essential+genes+identified+in+Acinetobacter+baumannii+by+using+human+ascites+overlap+poorly+with+essential+genes+detected+on+laboratory+media%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media.</a> 3 (4), (2012).</li>
<li>Nance, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+microfluidic+dental+plaque+biofilm+system+to+visualize+and+quantify+the+effect+of+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+approaches+for+multidimensional+biological+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Visualization approaches for multidimensional biological image data.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+an+alcohol-free+CPC-containing+mouthwash+against+oral+multispecies+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+dentistry%22%5BJournal%5D)">Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms.</a> The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).</li>
<li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).</li>
<li>Kim, J., Park, H. D., Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+approaches+to+bacterial+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation.</a> Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).</li>
<li>Mosier, A. P., Cady, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+bacterial+surface+interactions+using+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science+progress%22%5BJournal%5D)">Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems.</a> Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).</li>
<li>Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multispecies+oral+bacterial+community+in+a+saliva-conditioned+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).</li>
<li>Cuadra-Saenz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinducer-2+influences+interactions+amongst+pioneer+colonizing+streptococci+in+oral+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms.</a> Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).</li>
<li>Rickard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinducer+2%3A+a+concentration-dependent+signal+for+mutualistic+bacterial+biofilm+growth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth).</a> Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).</li>
<li>Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+penetration+and+efficacy+in+an+in+vitro+oral+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).</li>
<li>Diggle, M. A., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+sequence+typing+at+the+speed+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light.</a> Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).</li>
<li>Hiyari, S., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+diagnostics%3A+molecular+analysis+of+oral+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+hygiene+%3A+JDH+%2F+American+Dental+Hygienists%27+Association%22%5BJournal%5D)">Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms.</a> Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).</li>
<li>Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilms%3A+emerging+concepts+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology.</a> Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).</li>
<li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+ecology+in+the+age+of+genomics+and+metagenomics%3A+concepts%2C+tools%2C+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances.</a> Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).</li>
<li>Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li>
<li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews%29%5BTitle%5D)+AND+%22MMBR%22%5BJournal%5D)">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li>
<li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li>
<li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+dentistry+Spec+No+12B-17B%22%5BJournal%5D)">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li>
<li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li>
</ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

נייר שיטות זה מדגיש הנדרש להקמת השלבים הבסיסיים ולהפעיל מערכת microfluidic באופן שיאפשר לפיתוח biofilms רב-מינים אוראליים נגזר מרוק אנושי ונקווה וגדל ב- 25% רוק אנושי ויקווה-מעוקר מסנן. מקבלות גישות לאפיין את biofilm אך יש לזכור כי גישות המתוארות אלה הן טכנולוגיות לשינוי ונוספות כ?...

<html> Biofilms הם ארכיטקטוני קהילות מורכבות של חיידקים המצטברות על משטחי 1. קהילות אלה מכילים בדרך כלל מינים רבים הפועלים באינטראקציה אחד עם השני בתוך biofilm 2. biofilms האוראלי, רובד השיניים להיות ביותר מבחינה ויזואלית הבולט, הוא בעיה מתמשכת בבני אדם ותוצאות הפיתוח בלתי מבוקרות שלהם בדור של קהילות רב-מינים טקסונומית מגוונות 3. חיידקי המרכיב של קהילות המגוונות אלה יכולים להיות עד 1,000 פעמים יותר עמידות לאנטיביוטיקה מאשר עמיתיהם משתנה חופשיים (פלנקטון) 4-6. כישלון לטיפול ביישובים אלה אוראליים biofilm, אשר יכול לגרום לעששת ומחלת חניכיים, הביא נטל משמעותי על בריאות ציבור: למעלה מ -500 מיליון ביקורים במשרד רופא השיניים בשנה בארה&quot;ב, וכ -108 מליארד דולרים לטיפול באו למנוע חניכיים מחלה ועששת 7. תוכן &quot;&gt;&quot; בעוד מיקרוביולוגים רבים תומכים בלימוד התנהגות של חיידקים בתנאים טבעיים, כמה מהם לעשות זאת. סיבה לכך הוא המורל שלהם להתגבר על הקשיים מתפוגג ללא הרף על ידי הקלות אטרקטיביות של עבודה עם תרבויות מעבדה. &quot;-Smith 8. נכון לעכשיו, מחקר biofilm אוראלי מתבצע תוך שימוש במגוון של in vivo ובגישות חוץ גופית, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משל 9,10. במבחנה גישות לעתים קרובות משתמש במערכות biofilm מודל שהנן קלים יחסית להגדיר אבל ייתכן חוסר קליני / רלוונטי בעולם האמיתי 10,11. בvivo גישות בדרך כלל להסתמך על מערכות מודל חיה שעלול להתרבות היבטים מסוימים של סביבת הפה האנושית, אבל שוב סובלים ממגבלות בשל הבדלים באנטומיה, פיזיולוגיה, מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה בין חיות ובני האדם 12, 13. יש לציין כי biofilms האוראלייכול להיות גם שפותח על משטחי אמייל שנערכו בסטנט בתוך הפה של מתנדבים אנושיים, אבל גישה זו היא כיום יחסית יקרה ועתירת עבודה 14,15. סופו של דבר, סוכנים או טכנולוגיות לשיפור בריאות פה רומן נבדקים בבני אדם בתנאי ניסוי קליניים מבוקרים 11. נכון לעכשיו, דרך פעולה לעתים קרובות נעשה שימוש לזיהוי והערכת סוכני בריאות פה חדשים היא לבצע מחקרי המעבדה ראשון להבחין ביעילות פוטנציאלית, ולאחר מכן לבצע מחקרים בבעלי חיים ו&quot; שדה ניסויים &quot;שמעסיקים רופאים להעריך את ההצלחה של הטכנולוגיה 9, 16,17. למרבה הצער, מחקרי מעבדה נוטים להסתמך על מערכות מודל שמעסיקות את טביעת רגל גדולה, הם מבחינה טכנולוגית מאתגרים לשימוש, ולעתים קרובות מכיל פשוטים קהילות של אחד או לכל היותר כמה מינים לגזור עולם אמיתי פוטנציאלי כלומר 10,18. בהתחשב בכך שbiofilms רובד שיניים מכיל מינים וצורה מרובים בcomplלשעבר זורם סביבת רוק, פיתוח biofilms המכיל אחד או כמה מינים בתקשורת מלאכותית סביר כדי ליצור קהילות שמתנהגות באופן דומה לאלה בתרחיש של עולם אמיתי 10,19. כדי לטפל בזמן, העלות, דרישות הכשרה, ואת אופי הנציג הירוד של מערכות biofilm מודל מעבדה בהשוואה לסביבה בעולם האמיתי, לאחרונה פיתחו מערכת biofilm שמקורן הסביבה 20 (איור 1) תפוקה וגבוהה. יתרונות המערכת מהשימוש ברוק תא ללא במאגר אנושי (CFS) כמו רוק בינוני ולא מטופל ונקווה אדם בקטריאלי המכיל תא (CCS) כבידוד. באופן ייחודי, המערכת משלבת גם טכנולוגית microfluidic, מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal, וטכנולוגיה ניתוח מגוון חיידקי תרבות עצמאית. לפיכך, מערכת המודל הוא רוק שמקורן הסביבה (באמצעות כבידוד לגדול biofilms רבי מינים ב 37 ° C בזורם מעוקר מסנןרוק) וbiofilms האוראלי מכילים מינים (כולל Streptococcus, Neisseria, Veillonella, ומיני Porphyromonas) בנציג שכיחותם של אלה שנמצאו ברובד supragingival המוקדם 20. כאשר בהתחשב בכך שעבודה זו מתארת ​​את השימוש במערכת המודל חדש שפותחה, תשומת לב מיוחדת יש לתת למיזוג של מיקרופלואידיקה מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM), וטכנולוגיות ניתוח גיוון תרבות עצמאית. האיחוד של טכנולוגיות אלה על ידי קבוצת המחקר שלנו היה מכוון ולא רק מוסיף יכולת תפוקה גבוהה למערכת המודל החדש שפותחה, אלא גם מאפשר לי שאלות שיש לשאול שלא יכולות להיות בקלות לטפל לפני עם מערכות אחרות. ראשית, יש CLSM יתרונות ברורים על פני מיקרוסקופיה המסורתית שכן היא מאפשרת לניתוח תלת-ממדי של biofilms. לעתים קרובות שלא מעריכים, זה חשוב מאוד כbiofilms הוא שנינות הטרוגניתכבוד h להרכב מינים ומיקום המרחבי, כמו גם את התנאים הפיסיולוגיים שהוטל במקומות שונים במרחבי biofilm 6,21. בתיאום עם תוכנה תלת ממדי טיוח ותוכנת ניתוח תמונה, ארכיטקטורת biofilm, יחסים מרחביים בין מיני רכיב, והרג מיקרוביאלית מידה ניתן לנתח 22-24. יכולות כאלה אינן אפשריות באמצעות אור רגיל שמועבר או מיקרוסקופיה epifluorescence. בשלב הבא, מיקרופלואידיקה זכתה לתשומת לב מיוחדת בתחום מיקרוביולוגיה כפי שהיא מאפשרת המחקר של biofilms בתנאים מבוקרים היטב (זרימה, טמפרטורה, pH, וכו &#39;), ורק דורשת כמויות קטנות של 25-27 הנוזלי. כנקודת השוואה, גידול biofilm אוראלי ברוק אנושי בתוך מערכת מודל תא זרימה (מערכת שנחשבת למודל התווך למחקרים רבים biofilm אוראליים לטעון) במשך 20 שעות בספיקה וגזירה דומות לזה שהושגבמערכת microfluidic דורש לפחות 200 מיליליטר, בניגוד ל -800 μl במכשיר microfluidic 28-31. לפיכך, מערכת biofilm מודל microfluidic מאפשרת העיון בחומר מוגבל כמות בתנאים מוגדרים. לבסוף, טכנולוגית pyrosequencing כבר מותאמת בעשור האחרון לדורשת רק כמויות קטנות של חומר לבצע ניתוח קהילה ומספיק תכליתי כדי לשלוט עומק של רצף כדי לקבל את הזהות של מיני biofilm אפילו נדירים. השימוש בטכנולוגיה זו, כגון pyrosequencing חיידקים בקידוד תג FLX amplicon (bTEFAP), אפשר לשאלות רלוונטיות הנוגעות לאקולוגיה של biofilms לטפל 32,33. שאלות מסוג זה חדורים קשיים בעבר כאשר pyrosequencing לא היה זמין בגלל הזמן והעלויות הנדרשות ליצירת ספריות פלסמיד ונדרשו להפיק נתונים 33,34 צעדים טכנולוגיים ואנליטיות המורכבים. כמובן, יתרון גדול עם ap התרבות העצמאיתגישות, כגון pyrosequencing, היא שמיני חיידקים שלא ניתן לגדל בבידוד בתוך תקשורת מעבדה הקונבנציונלית (מינים ברי קיימא כלומר אבל אינם ראויים לעיבוד חקלאי) ניתן לגדל וזיהו בתוך מערכת המודל והשפע היחסי שלהם בקהילה לכמת 35, 36 . כדי להוסיף נקודת מבט, מוקדם ככל 1963, זיגמונד Socransky מאוחר ההערכה היא כי כ -50% מהחיידקים בחומר המבודדים מנקיק החניכיים הפה האנושי לא יכולים להיות מתורבת באמצעות תנאי גידול מעבדה 37. מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את הגישה לפיתוח biofilms רב-מינים אוראליים במערכת microfluidic זמינה מסחרי (Bioflux) תחת: נציג תנאים (i) של חלל הפה האנושי ו( ii) עם הרכב מינים ושפע ש דומה לשלט supragingival. יתר על כן, שימוש בשתי תוכנות חופשית ומסחריות, אנו מדגישים biofilm איך בסיסיניתן לגזור אמצעי ארכיטקטורה מנתוני CLSM, עם דגש על גישות לכמת ביומסה biofilm, חספוס, ואת כדאיות (המבוסס על צביעה חי / מת). לבסוף, את הצעדים הנדרשים כדי לקצור חומר biofilm לניתוח גיוון ידי bTEFAP מתוארים.

<table><tbody><tr><td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Sorval ultracentrifuge&amp;nbsp; (SS-34 compatible)</td><td>Thermoscientific</td><td>Unit-dependent</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific SS-34 Rotor&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>28-020</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td><td>Thermo&amp;nbsp; Scientific Inc</td><td>23-290-065</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td><td>VWR</td><td>73520-986&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>NC0542269</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux microfluidic system</td><td>Fluxion</td><td>Bioflux 200 system</td><td></td></tr><tr><td>Bioflux 24-channel plate</td><td>Fluxion</td><td>910-0004</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Lecia</td><td>SPE or eqivalent system</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence Microscope</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Pyrosequencing facilities</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Temperature Freezer -80&amp;nbsp;&amp;deg;C</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Tips (20, 200, and 1,000&amp;nbsp;&amp;#956;l)</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 &amp;#956;l)</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bioflux dedicated software</td><td>Bioflux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SPE</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSTAT/COMSTAT 2</td><td>Freeware (http://www.comstat.dk/)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

יש תפוקה גבוהה כמה במערכות חוץ גופית שתקלנה על הפיתוח של biofilms רב-מינים המכילים מינים רבים מזוהים בדרך כלל בתוך in vivo biofilms האוראלי. יתר על כן, מערכת המשתמשת ברוק אנושי טבעי כמקור התזונתי, במקום תקשורת המלאכותית, במיוחד רצויה על מנת לתמוך בביטוי של מאפיינים סלולריים וbiofilm ספציפי המחקים את in vivo הקהילות. אנו מתארים שיטה לפיתוח רב-מינים biofilms האוראלי כי הם דומים, ביחס להרכב מינים, לsupragingival רובד שיניים, בתנאים דומים לחלל הפה האנושי. באופן ספציפי, מאמר שיטות זה יתאר כיצד מערכת microfluidic זמינה מסחרי יכולה להיות מותאם כדי להקל על הפיתוח של biofilms האוראלי רב-מינים שמקורם וגדלה בתוך רוק נקווה. יתר על כן, תיאור של איך המערכת יכול לשמש בשילוב עם confocaמיקרוסקופ סריקת לייזר l לייצר שחזורי biofilm 3-D עבור ניתוחי כדאיות אדריכליים ויוצג. בהתחשב במגוון הרחב של מיקרו-אורגניזמים הגדלים בתוך biofilms במערכת microfluidic (כולל Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, וPorphyromonas), פרוטוקול יהיה גם הציג מתאר כיצד לקצור את תאי biofilm לתת-תרבות נוספת או מיצוי DNA וניתוח. גבולות הן את מערכת biofilm microfluidic ומנתח את הנתונים הנוכחיים מדינה-of-the-האמנות יטופלו. סופו של דבר, הוא חזה שמאמר זה יספק טכניקה בסיסית שתשפר את המחקר של biofilms האוראלי ולסייע בפיתוח של טכנולוגיות נוספות שיכול להיות משולבת עם פלטפורמת microfluidic.

3D Rendering של Biofilms נציגי תוצאות מוצגות באיור 3. כלי שימושי בתוכנת Imaris הוא האפשרות לבחון כל פרוסה של ערימת biofilm נאסף ולשלב אותם כדי ליצור שחזורים תלת-ממדיים. בנוסף, ניתן להוסיף אפקטי הצללה מלאכותיים כדי לסייע מבח...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms at JoVE.com

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.5K Views.  The University of Michigan.  מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות. 

Video: Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Biochemistry

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

ביופילמים אוראלי על חומרים שונים עבור שתלים דנטליים

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Medicine

<meta charset="utf8"></head><body>מודל CF ניתן להתאמה לבדיקות אנטי-מיקרוביאליות וניתוח דינמיקה מיקרוביאלית

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

שימוש בתפוקה גבוהה

Summary

Explore More Videos