אנו מודים למאט Parsek באוניברסיטת וושינגטון (סיאטל, וושינגטון) למתן פ aeruginosa וא זני coli ורוג&#39;ר נוקס באוניברסיטת קנטרברי (ניו זילנד) למתן גישה לתוכנת זרמים. עבודה זו נתמכה על ידי R01AI081983 מענק מהמכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. ההדמיה confocal בוצעה במתקן נורת &#39;ווסטרן הביולוגי ההדמיה (BIF).

התקנת תא 1. זרימה והרכבה הערה:. השתמש תא זרימת microfluidic כניסה כפולה למתואר בשיר et al, 2014 14 לגדול biofilms. תא זרימה זה מסוגל ליצור מעברי צבע כימיים חלקים מוגדרים היטב. עיצוב תא הזרימה מוצג באיור 1 וזרימת ייצור תאים תוארו בעבר בשיר et al., 2014 14. השיטות שלנו כאן פירוט על ידי שימוש P. aeruginosa וא coli כדי ליצור biofilms, אבל מינים אחרים עשויים להיות מתאימים יותר. אנחנו השתמשנו P. aeruginosa PAO1- GFP, אשר constitutively מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כאורגניזם מודל לפיתוח biofilm. בנוסף, השתמשנו E. coli DH5α כדי ליצור biofilms מעורבים-מינים עם פ aeruginosa. P. aeruginosa וא coli זנים גדלו על צלחות אגר LB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את polydimethylsiloxane באמצעות תא זרימה (PDMS) הקשור לcoverslip זכוכית באמצעות טיפול פלזמה חמצן כפי שתואר ב -14. הממדים של חדר תא הזרימה הם 23 מ&quot;מ × 13 מ&quot;מ × 0.24 מ&quot;מ (אורך × רוחב × עומק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שונה מדיום גידול FAB 15. להתבונן צמיחת biofilm תחת שיפוע תזונתי בתוך תא הזרימה, להציג שונה FAB בינוני 15 עם גלוקוז 0.6 מיקרומטר בכניסה אחת ולהציג את מדיום FAB ללא כל מקור פחמן דרך פתח האחר. מסנן לעקר (גודל נקבובית = 0.2 מיקרומטר) מניית גלוקוז הפתרון (60 מ&quot;מ) לפני הוספתו למדיום FAB. גם חיטוי בינוני FAB עם מחזור 1 (נוזל, 15 דקות, 121 מעלות צלזיוס, 17 psi) לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מערכת הזרימה. לפני החיסון, חיטוי את כל נתיב הזרימה (בקבוקים בינוניים, צינורות, מלכודות בועה, תאי זרימה) באמצעות מחזור 1, פרט לשסתומי פלסטיק שלושה-כיווני (חד פעמי ומעוקר מראש) הממוקמים במעלה הזרם של תא הזרימה. (שסתומים שלוש דרכים המשמשים להזרקת התא גulture, נותב וmicrobeads ניאון.) כדי למנוע זיהום בזמן ההרכבה, לכסות את כל פתחי צינורות ומחבר ברדיד אלומיניום או שקיות החיטוי לפני מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מערכת הזרימה. להרכיב את הרכיבים של מערכת תא זרימה בזהירות (ראה וידאו להרכבת מערכת זרימה) ולספק מדיום גידול לתא הזרימה באמצעות משאבת peristaltic שדווקא שולטת בקצב הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבית תאי חיסון על ידי העברת מושבה של P. aeruginosa או E. coli מצלחות LB עד 3 מיליליטר של מרק LB ולנער את התרבות O / N ב 225 סל&quot;ד ו -37 מעלות צלזיוס. לדלל את O / תרביות תאי N ב 1 מיליליטר מים המעוקרים לOD סופי 600 = 0.01 כבידוד. (תרבות ולדלל את החיידקים בזרימה למינרית כדי למנוע זיהום.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויים עם biofilms מעורבים-מינים, לדלל שתי תרבויות חיידקים ליחס של 1: 1 ב 1 מיליליטר עם OD שווה 600 = 0.01 עבור כל חיידק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תא הזרימה. הזרק 1 מיליליטר של הבידוד לכניסת תא זרימה משסתום שלוש הדרך. לאחר ההזרקה, להשהות את הזרימה עבור שעה 1 כדי לאפשר לתאי חיידקים לצרף את מכסה הזכוכית. (ודא שתא הזרימה ממוקם בצד coverslip למטה כדי לאפשר לתאים מושעים להתיישב על coverslip.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לחדש את הזרימה ולשאוב את מדיום הגידול לתא הזרימה בקצב קבוע של 0.03 מיליליטר / דקה עבור כל כניסה במשך 3 ימים. </li></ol> 2. אפיון Biofilm פיתוח בתגובה לGradients התזונתי באמצעות מיקרוסקופיה confocal הערה: פ aeruginosa ניתן הדמיה עם GFP constitutively-הביע, אבל E. coli בbiofilms מעורב-מינים חייב להיות צילם על ידי counterstaining. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב biofilms 3 הימים באמצעות מיקרוסקופ confocal. לקבלת תוצאות הנציג, להתבונן biofilms באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 63X. לפני ההדמיה, סימןתא זרימת כניסה הכפול לעם רשת בצד מכסה הזכוכית. (המטרה של רשת זו היא לאפשר לניסוי כדי לאתר את אזורי ההדמיה בתוך תא תא זרימה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לcounterstain, לדלל 10 μl של כתם תא-permeant אדום ניאון חומצות גרעין, כגון כתם ירוק ניאון גרעין חומצה כגון STYO 62, פתרון מניות (1 מ&quot;מ) ב990 μl מעוקר מים ואז מזריק את הכתם בדילול באמצעות מזרק לתוך לאט תא תא זרימה משלוש דרך השסתום במעלה הזרם. שמור את תא הזרימה קופא על שמריו ובחושך במשך 30 דקות, ולאחר מכן לחדש את הזרימה כדי לשטוף את הכתם מאוגד במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה confocal. הפעל את לייזר 488 ננומטר ארגון לעירור ופליטת איסוף ערוצים לGFP (500-535 ננומטר) וכתם חומצות גרעין (לכתם חומצה ירוק ניאון גרעין, 650-750 ננומטר). התאם רווחים וקיזוז בשני הערוצים יש תמונות בהירות ונקיות. xyz בחר ומצב הדמיה בו זמנית. השתמש בכפתור z-השליטה לIDENתצדיק את התחתית והחלק העליון של biofilm בתחום. הגדר את z-הצעד לרמה של 0.5 מיקרומטר לרכישת מחסנית תמונה 3-D. (כדי להבטיח איכות תמונה גבוהה, להשתמש ממוצע שורה של ארבע לרכישת תמונה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למפות את הדפוסים המרחבי של פיתוח biofilm בתוך תא הזרימה, biofilms תמונה בשלוש או יותר אורך (x) מרחקים לאורך כניסת תא זרימה, ובשלוש רוחבי (y) ממקם יחסית לשיפוע התזונתי שהוטל, כפי שמוצג באיור 1 . </li></ol> 3. אפיון הפנימי מומסת תחבורה על ידי זריקות של הקונסרבטיבי פלורסנט Tracer הערה: נותב ניאון שמרני, כגון Cy5, ניתן להשתמש בו כדי לאפיין את דפוסי תחבורה מומסת בתוך biofilm. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר Cy5 (Mono-reactive NHS אסתר) במים לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מיליליטר כפתרון מניות. אחסן את פתרון מניות Cy5 ב-20 ° C במקפיא. הערה: כCy5 הוא אור-sensitive, חנות, לדלל ולהזריק פתרונות Cy5 בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקות של נותב הניאון, לקחת ערימת 3-D תמונה של biofilm 3 הימים עם מיקרוסקופיה confocal (עם מטרת 63X). (אזורים רחבים של מושבות biofilm הם אידיאליים עבור תצפיות בזמן סדרה של תחבורת צבע.) כמו כן לבחור z-מטוס עם מושבות מופרדות היטב להדמיה (כפי שמוצג באיור 5 א &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ניסוי הזרקת Cy5, לדלל 2 μl של פתרון מניות Cy5 ב998 μl מעוקר מים להניב פתרון הזרקה יש ריכוז Cy5 של 20 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה כדי להשהות את הזרימה ולהזריק את פתרון Cy5 לזרם של תא הזרימה באמצעות מזרק דרך שסתום 3-הדרך. (זה חשוב כדי למנוע בועות אוויר מלהיכנס לנתיב הזרימה תוך הזרקה. צריכה להישמר מלכודות בועה פתוחות במהלך ההזרקה בחזרה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקת פתרון Cy5, לסגור את מלכודות הבועה, להתאים את שסתום 3-בדרך, והפעל מחדש אתלשאוב כדי לספק את פתרון Cy5 מוזרק לתוך תא הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב הדמיה confocal לxyt. הפעל ערוצי Cy5 וGFP תחת מצב הדמיה בו זמנית. התאם את הגדרות confocal על עוצמת Cy5 (עוצמת לייזר, להרוויח וקיזוז), כדי למנוע להרוות אותות, שהוא קריטי לכימות. (החלטה זמנית גבוהה עדיפה להמחשת חדירת צבע. עם זאת, סריקה מהירה מקטינה את איכות תמונה.) בחר את מהירות סריקה נכונה וממוצע קו כדי לאזן את הזמן ברזולוציה של הדמיה ואיכות התמונה. לפרוטוקול זה משתמש בממוצע שורה של ארבע ומסגרת שיעור של 0.15 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדש את הזרימה לספק Cy5 לתוך תא הזרימה (עדיין בקצב זרימה של 0.03 מיליליטר / דקה). במקביל יתחיל הדמיה confocal זמן סדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת חדירת Cy5 ידי רדיאלית ממוצע עוצמת Cy5 בתוך מושבה biofilm עגולה 2-D. בממוצע, ראשון לזהות את קצה אשכול biofilm, לאחר מכן ליצור מפת מרחק לסעיף 2-D של האשכול, ובסופו דפוסי רדיאלי הממוצע של עוצמות Cy5 כדי ליצור עקומת חדירה (ראה איור 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לממש את המחשוב צעד 3.8, להשתמש BioSPA (ניתוח תבנית Biofilm מרחבי) חבילת תוכנה (, חבילת תוכנה שלא פורסם ומדריך לזמין על פי בקשה) או תוכניות ניתוח תמונה אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש בBioSPA, לייבא ראשון תמונה שנקבעה לBioSPA. לאחר מכן, בחר סף ראוי לערוצי GFP וCy5 כדי להפוך את התמונות בינארי. בתפריט ניתוח / חישוב, בחר מתקדם ניתוח ולאחר מכן ניתוח דיפוזיה. השתמש בערוץ ה- GFP להגדיר את הקצה של אשכול ולהשתמש בכלי המצולע כדי לבחור אשכול אחד כמו האזור של העניין (ROI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה כפולה על אשכול biofilm נבחר לבצע ניתוח דיפוזיה. שמור את תוצאות ניתוח דיפוזיה ולכייל עוצמת Cy5 לריכוז Cy5 באמצעות עקומת כיול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור עקומת כיול ריכוז Cy5, למדוד עוצמות Cy5 על conce Cy5שיפוע ntration תחת מיקרוסקופ confocal. (עוצמת Cy5 וריכוז יש קשר ליניארי.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. אפיון שדה הזרימה סביב ידי מעקב פלורסנט חלקיקים הערה: חלקיקי פלורסנט, כגון microbeads פלורסנט, יכול לשמש כדי לאפיין את שדה הזרימה סביב biofilms. שדה זרימה סביב biofilms ניתן לחשב מהתצפיות בזמן שורה של תפקידי חלקיקים באמצעות תוכנת velocimetry מעקב אחר חלקיקים. התוצאות מוצגות כאן התקבלו עם זרמי 2.02 תוכנת חבילת 16 (להורדת תוכנה והמדריך למשתמש זמין <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">בhttp://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml).</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את microbeads הניאון (קוטר ~ מיקרומטר 1) במים מעוקרים לריכוז סופי מוצק של 0.2% ונפח סופי של 0.5 מיליליטר. מערבולת לוודא כי microbeadsהם התפזרו גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק ולספק את microbeads פלורסנט המדולל לתוך תא הזרימה בעקבות הליכים מצעדים 3.3-3.5. כדי לאפשר מעקב מדויק של מסלול החלקיקים, השתמש קצב זרימה נמוך יחסית (0.01 מיליליטר / שעה לתוצאות מעקב חלקיקים במאמר זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור הגדרות confocal לxyt מצב כדי לעקוב אחר תנועת חלקיקים בz-פרוסה אחת ולקחת תמונות בזמן סדרה. (במסגרת שיעור של 1 הרץ שימש לתוצאות הנציג שמוצגים במאמר זה.) הזרקת חלקיקים חזרו ותמונה במקומות שונים z לייצר תזרים שדה 3-D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום תהליך בזמן הסדרה תמונות confocal על ידי הפחתת אות הקרינה רקע (אות בתמונה נרכשה הראשונה של סט התמונה) באמצעות ImageJ (להורדת תוכנה ומדריך לנגיש <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">בhttp://imagej.nih.gov/ij/)</a> או תוכניות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בImageJ, לפתוח את התמונה הראשונה של קבוצת תמונה ולאחר מכן לייבא את סט התמונה. במסגרת הליך / תמונה Calculator, לחסר את התמונה הראשונה מסט התמונה. שמור את סט דימוי מעובד מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את זרימת וקטורים, תמונות confocal זמן סדרת יבוא בזרמים 2.02. תחת &quot;תצוגת תהליך פתוחה&quot;, לבחור ולבצע &quot;זהה את החלקיקים&quot;. השתמש סף ראוי לזהות חלקיקים. השתמש 0.5 ו -5 מיקרומטר כספי מינימום וקוטר מרבי ל1 מיקרומטר חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, תחת &quot;תצוגת תהליך פתוחה&quot;, לבחור ולבצע &quot;צינור ניתוח PTV&quot; כדי ליצור נתיבי חלקיקים. בדקו את נתיבי חלקיקים כדי לראות אם הם מייצגים תנועת חלקיקים. לבסוף, בחר ולבצע &quot;צור שדה מהירות&quot; כדי ליצור מפת זרימת וקטור. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li><li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease.">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms.">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+A+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li><li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure.">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).</li><li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear:+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology.">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li><li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk/biofilm+interface.">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Convection+around+biofilms.">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorption+sites+in+biofilms.">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms.">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li><li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers.">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li><li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells.">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel.">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms.">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li><li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm.">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li><li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs.">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport.">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li><li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge.">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions.">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin.">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li><li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection.">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנחנו הוכיחו חבילה של שיטות כדי לאפיין שלוש אינטראקציות biofilm-סביבה חשובות: תגובת biofilm הדרגתי כימי, השפעות של צמיחת biofilm על זרימת מייקרו-הסביבה שמסביב, וההטרוגניות biofilm כתוצאה ממגבלות תחבורה פנימיות. אנחנו הראיתי לראשונה את השימוש ...

מיקרואורגניזמים לצרף למשטחים וbiofilms טופס - אגרגטים תא סגורים במטריצה ​​תאית-פולימר 1. Biofilms להתנהג בצורה שונה מאוד מתאי חיידקים בודדים, כי יש לי biofilms ההטרוגניות המרחבית דרמטית כתוצאה משילוב של מגבלות תחבורה מומסת הפנימיות ווריאציות מרחבית בחילוף חומרים תאיים 2,3. ריכוזי חמצן וחומרים מזינים להקטין באופן דרסטי בממשק שבין biofilm והסביבה נוזל ומתמעט נוסף בתוך בbiofilm 2. וריאציות מרחבית בנשימת biofilm וסינתזה של חלבון יכולות להתרחש גם כתגובה לחמצן מקומי וזמינות חומרי מזון 2. בסביבות מימית ואדמה, רוב החיידקים שוכנים בbiofilms. biofilms הטבעי לבצע תהליכים חשובים biogeochemical כולל רכיבה על אופניים פחמן וחנקן והפחתת מתכות 4,5. מבחינה קלינית, היווצרות biofilm היא responsידיהם לריאות ממושכות וזיהומים בדרכי שתן 6. הזיהומים הקשורים biofilm הם בעייתיים מאוד, כי יש לי תאים בbiofilms גבוהה מאוד התנגדות לאנטיביוטיקה בהשוואה לעמיתיהם הפלנקטון 6. בגלל biofilms חשוב בהגדרות שונות, כמות משמעותית של מחקר התמקדה בהבנת הגורמים הסביבתיים השולטים פעילויות biofilm וההטרוגניות המרחבית בbiofilms ומייקרו-הסביבה שמסביב. מחקרים קודמים מצאו כי פיתוח biofilm מוסדר מאוד על ידי מספר הגורמים סביבתיים: biofilms לפתח מורפולוגיות שונות תחת תנאי זרימה שונים; חמצן וbiofilm השפעת זמינות חומרי מזון מורפולוגיה; ומאמץ גזירה הידרודינמית משפיע על הקובץ המצורף של תאי פלנקטון למשטחים והניתוק של תאים מbiofilms 7-9. יתר על כן, זרימת מצב חיצוני משפיע על המשלוח של int מצעיםo ובתוך biofilms 10. הצמיחה של biofilms גם משנה מקיפה תנאים פיזיים וכימיים. לדוגמא, צמיחת biofilm מובילה לדלדול המקומי של חמצן וחומרים מזינים 2; biofilms לצבור תרכובות אורגניות ואורגניות מהסביבה 11; ואשכולות biofilm להסיט חיכוך זרימה ומשטח עליית 12,13. בגלל biofilms אינטראקציה עם סביבתם סביבה בדרכים מורכבות מאוד, זה קריטי כדי להשיג מידע על מאפייני biofilm ותנאים סביבתיים בו-זמנית, וגישות רב-תחומיות צריכים לשמש כדי לאפיין באופן מקיף אינטראקציות biofilm-סביבה. כאן אנו מציגים סדרה של שיטות משולבות לאפיון דפוסים מרחביים בהתפתחותם של חיידקים בתוך מונו-מינים וbiofilms כפולים מינים תחת שיפוע תזונתי שהוטל, ולצפות בשינוי של כימי המקומית ומייקרו-סביבת נוזל וכתוצאה מכך. אנו אשוחרח &#39;מתאר את השימוש של זרימת microfluidic תא כניסה כפולה לפותח לאחרונה להתבונן צמיחת biofilm תחת מילויים כימיים מוגדרים היטב. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש בתא זרימת microfluidic זה להתבונן הצמיחה של שני מינים של חיידקים, Pseudomonas aeruginosa וEscherichia coli, בbiofilms תחת מגוון של תנאים תזונתיים. אנו מראים כיצד בהדמיה באתרו של התפשטות נותב ניאון למושבות biofilm ניתן להשתמש כדי להעריך כמותית דפוסי התחבורה מומסת בbiofilms. לבסוף, אנו מראים כיצד velocimetry מעקב חלקיקים המיקרוסקופי, שבוצע תחת מיקרוסקופ confocal, יכול לשמש כדי לקבל שדה זרימה מקומי סביב biofilms גדל.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Pump Tubing 0.50&amp;nbsp;mm OVC, Orange/Yellow</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock</td><td>Smiths Medical&amp;nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Pyrex Medium Bottle, 1&amp;nbsp;L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>C-FLEX Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>1 ml TB Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Polymer Tubing</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td><td>Clay Adams</td><td>427564</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>HACH</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Syringe filters - sterile (0.2 &amp;mu;m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Monobasic potassium phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Magnisium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Calcium sulfate dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Zinc sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium molybdate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>TCS SP2 Confocal Microscopy</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15100</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>Streams 2.02</td><td>University of Cantebury</td><td></td><td>Image Processing</td></tr></tbody></table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

Biofilms קהילות חיידקים מצורף משטח שיש לי מבנים מורכבים ולייצר heterogeneities מרחבי משמעותי. פיתוח biofilm מוסדר בחום על ידי הזרימה סביב והסביבה תזונתית. צמיחת biofilm גם מגדילה את ההטרוגניות של מייקרו-הסביבה המקומית על ידי יצירת שדות זרימה מורכבות ודפוסי תחבורה מומסת. כדי לחקור את הפיתוח של ההטרוגניות בbiofilms ואינטראקציות בין biofilms ומיקרו-בית הגידול המקומי שלהם, שגדלנו biofilms מונו-מינים של Pseudomonas aeruginosa וbiofilms כפולים מינים של P. coli aeruginosa וEscherichia תחת הדרגתיים תזונתי בתא זרימת microfluidic. אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים ליצירת שיפועים מזינים בתוך תא הזרימה ולגידול והדמית פיתוח biofilm בתנאים אלה. אנחנו גם פרוטוקולים הנוכחיים לסדרה של שיטות אופטיות לכמת תבניות המרחביות במבנה biofilm, לזרום distributions על biofilms, ותחבורה המונית סביב ובתוך מושבות biofilm. שיטות אלו תומכות חקירות מקיפות של הפיתוח המשותף של ההטרוגניות biofilm ובית גידול.

תא זרימת כניסה הכפולה לmicrofluidic מאפשר תצפית של צמיחת biofilm תחת שיפוע כימי מוגדר היטב שהוקם על ידי ערבוב של שני פתרונות בתוך תא הזרימה. השיפוע הכימי וכתוצאה מכך נצפה בעבר על ידי הזרקת צבע ומאופיין בפירוט על ידי et al שיר. 14. הדרגתיים ריכוז חלק נוצרו בכיוון הרוחבי, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity at JoVE.com

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Views.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

Video: Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

ניטור מרחבי הפרדה Surface מיישבים אוכלוסיות מיקרוביאליות

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Genetics

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Environment

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Immunology and Infection

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Biology

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

מערכות מודל רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

A Bead Movement Based Computational Framework for 3-Dimensional Analysis of Biofilm Material Heterogeneity

Differences in the material properties of bacterial biofilms have been observed in biofilms of different bacterial species, within the same species under different growth conditions and after treatment with matrix modifying molecules. To better quantitate the material properties of 3D biofilms, an experimental and computational workflow was developed and applied to examine differences between Enterococcus faecalis, Salmonella enterica serotype Typhimurium and Escherichia coli biofilms as well as the role of the amyloid curli in confirming rigidity to Enterobacteriaceae biofilms. The spatio-temporal dynamics of 1 &#181;m carboxylate beads in biofilms were tracked in 20 &#181;m 3D biofilms over 20 minutes. The 4D image stacks were processed using the Mosaic plugin in ImageJ to produce 3D trajectory data of bead movement. This trajectory data was analyzed with a newly developed Bead Evaluator toolbox, where movement data, including trajectory lifespans, bead velocities, cell densities along trajectories, and bounding box information were computed and stored in csv-files. This paper presents the workflow from experimental setup and image recording to bead trajectory computation and analysis. The structure of curli-containing biofilms resulted in more stable bead interactions and less bead movement than in curli-mutant and Enterococcal biofilms. Bead movement did not appear strongly dependent on cell density when measuring the bead velocity and trajectory bounding box volume, supporting the hypothesis that other material properties of the biofilms control the bead dynamics. This technique is widely applicable to quantitating differences in biofilms of different matrix compositions as well as biofilms before and after matrix-modifying treatments.

We describe a method for analyzing and quantifying the movement pattern of 1 &#181;m carboxylate beads through heterogeneous bacterial biofilms. Comparison of the movement patterns can be used to quantitate differences in material properties of biofilms.

Differences in the material properties of bacterial biofilms have been observed in biofilms of different bacterial species, within the same species under ...

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video