الكتاب أشكر وليام نانس (جامعة ميشيغان) للمساعدة في صياغة بروتوكولات نمو بيوفيلم وجون باتيستا (الجريان، وسان فرانسيسكو، CA) للحصول على المشورة بشأن المسائل التكنولوجية المتعلقة بنظام Bioflux. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH: R21DE018820 إلى AHR) وجامعة ميشيغان الأموال بدء لAHR

وقد استعرض بروتوكول جمع اللعاب الموصوفة هنا من قبل جامعة ميشيغان مجلس المراجعة المؤسسية للبحوث موضوع الإنسان. ملاحظة: وفيما يتعلق استعراض المؤسسية لعمل موضوع الإنسان من هذا النوع، يجب أن حصل على الترتيبات وأذونات مسبقة من المؤسسة المضيفة. على وجه الخصوص، وهذا يتوقف على المؤسسة، IRB أو الموافقة الأخلاق قد تحتاج إلى سعى والموافقة عليها قبل جمع اللعاب من متطوعين من البشر يمكن المضي قدما. كعامل مساعد في إعداد التطبيق، مفيد NIH خوارزمية / الرسم البياني يمكن الاطلاع هنا: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 1. إعداد مجمع اللعاب لاستخدامها كعامل متوسطة النمو وثيق للبيئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توظيف&gt; 5 أفراد للتبرع اللعاب. لا تأخذ أي معلومات تحديد وضمان عدم وجود individuسوف المرض التبرع اللعاب إذا كانت مريضة، أو اتخذت المضادات الحيوية عن طريق الفم في 3 أشهر الماضية، أو قد استهلكت الطعام أو السائل، مع استثناء من المياه، في ساعة 2 السابقة قبل التبرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع اللعاب في 50 مل أنابيب بلاستيكية. تجميع اللعاب التي تم جمعها في كوب من البلاستيك، وابقائها على الجليد. لا تستخدم الزجاج كما البوليمرات في اللعاب سوف تلتزم الواجهات الزجاجية الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Dithiothreitol (DTT) إلى تركيز النهائي من 2.5 ملم من الأسهم 100X. (يتم تجميد أسهم في مأخوذة تستخدم مرة واحدة في -20 ° C). يحرك المزيج لمدة 10 دقيقة في كوب بلاستيكي على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إزالة الجسيمات، الطرد المركزي لعاب المجمعة لمدة 30 دقيقة في 17،500 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع اللعاب مع 3 أحجام درهم 2 O لإعطاء ربع اللعاب المركزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية تعقيم اللعاب باستخدام 0.22 ميكرون polyethersulfone (PES)، فلتر ملزمة منخفض البروتين. استخدام فلتر مع مساحة كبيرة، أو استخدام عدة مرشحات منطقة صغيرة. إبقاء اللعاب فيحاوية بلاستيكية على الجليد في حين التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد اللعاب المجمعة في -80 &#160; ° C في 50 مل أنابيب بلاستيكية لحين الحاجة إليها لتنمو البكتيريا. كل أنبوب من البلاستيك للاستخدام واحد فقط، ويجب أن يحتوي على ما لا يزيد عن 35 مل كما يحمل كل بئر ميكروفلويديك بحد أقصى 1.2 مل (1.2 مل × 24 = 28.8 الآبار مل)، وهناك حاجة إلى الفضاء في كل أنبوب مع توسع اللعاب أثناء التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخدامها، ذوبان الجليد لعاب المجمعة في درجة حرارة الغرفة. إذابة مرة واحدة، وتصفية تعقيم مرة أخرى (0.22 ميكرون polyethersulfone، وانخفاض البروتين مرشح ملزم لإزالة أي رواسب). </li></ol> 2. إعداد مجمع اللعاب لاستخدامها كعامل اللقاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توظيف&gt; 5 أفراد للتبرع اللعاب. لا تأخذ أي معلومات تحديد وضمان لن الأفراد التبرع اللعاب إذا كانت مريضة، اتخذت المضادات الحيوية عن طريق الفم في 3 أشهر الماضية، أو قد استهلكت الطعام أو السائل، مع استثناء من المياه، في ساعة 2 السابقة قبل التبرع. جمع ساmples أكثر من 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع اللعاب في 50 مل أنابيب البلاستيك في درجة حرارة الغرفة وتجميع اللعاب التي تم جمعها في كوب بلاستيكي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع اللعاب المجمعة مع الجلسرين تعقيمها كاشف الصف العام أن تسفر عن الأسهم مع نسبة النهائية من 25٪ الجلسرين، و 75٪ اللعاب التي تحتوي على خلية [CCS]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد اللعاب في -80 درجة مئوية في 3 مل مأخوذة تستخدم مرة واحدة لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الحاجة لتطعيم النظام ميكروفلويديك، وإذابة aliquots في درجة حرارة الغرفة وتحريكها بلطف على vortexer لمدة 5 ثانية قبل أن pipetted في النظام ميكروفلويديك كما هو موضح في الخطوة 3 من البروتوكول، أدناه. </li></ol> 3. نمو الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عن طريق الفم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجنة الأمن الغذائي ما قبل المعالجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أول معطف القنوات ميكروفلويديك Bioflux مع CFS. إضافة 100 ميكرولتر من CFS إلى كل منفذ جيدا. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة Bioflux، حدد &quot;اليدوي&quot; وتعيين التدفق من قنوات &quot;B1-B24&quot; ثاتي هي لاستخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد ذلك، وضع القص إلى 1.0 داين / سم ² والبدء في تدفق لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لضمان توزيع متجانس للجنة الأمن الغذائي العالمي في جميع أنحاء القناة. ضمان وجود السائل في كل قناة مدخل للتحقق من أن لجنة الأمن الغذائي تدفقت من خلال جميع القنوات بالتساوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل / يمهد للمعالجة CFS أن يبقى في الآبار منفذ ونقل إلى الآبار مدخل. وهذا الحجم الكلي 100 ميكرولتر يخدم لتحقيق التوازن ضد الضغوط التي تطبق على اللقاح من مأخذ جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل منفذ بشكل جيد، وإضافة 100 ميكرولتر من CCS اللقاح. وضع لوحة ميكروفلويديك على لوحة الحرارة (درجة الحرارة وضعت في 37 ° C)، دليل حدد ضمن برنامج حاسوبي لمراقبة وضبط تدفق من الآبار منفذ إلى آبار مدخل (أي عكس) في 1.0 داين / سم ² بالضبط 6 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة ميكروفلويديك عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة للسماح لللتمسك الأولي ونمو البكتيريا في قيحة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النمو بين عشية وضحاها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقنوات تلقيح المستخدمة، نضح قيحة النفايات من كل من الآبار منفذ. تضيف ما يصل الى 1 مل الحجم الكلي للجنة الأمن الغذائي العالمي في كل من الآبار مدخل (يمكن القيام به على رأس القائمة CFS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة ميكروفلويديك في 37 ° C، حدد الدليل ووضع برنامج للتشغيل عند 0.2 داين / سم ² لمدة 20 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار prewash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح كل السوائل من مدخل ومخرج الآبار وإضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى كل من الآبار مدخل. تدفق لمدة 20 دقيقة عند 0.2 داين / سم ². </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار بالإضافة الخليط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبقاء الخلية تلطيخ جعل 100 ميكرولتر من الخليط وصمة عار لكل قناة لتكون ملطخة. على وجه التحديد، إضافة 3 ميكرولتر من SYTO 9 و 3 ميكرولتر من يوديد propidium لكل مل من PBS باستخدام التجارية بقاء الخلية تلطيخ عدة مثل لايف / الميت. وهذا يولدخليط تلطيخ تحتوي على 10 ميكرومتر SYTO 9 و 60 ميكرومتر يوديد propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PBS المتبقية من الآبار مدخل وثم إضافة 100 ميكرولتر من بقاء الخلية الخليط وصمة عار على كل مدخل جيدا. تعيين في التدفق عند 0.2 داين / سم 2 وتشغيل حل من مدخل إلى مخرج لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ما بعد تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وصمة عار المتبقية في كل من الآبار مدخل وإضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على كل مدخل جيدا. تعيين في التدفق عند 0.2 داين / سم ² وتشغيل حل PBS من مدخل إلى مخرج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي بقع الزائدة. </li></ol></li></ol> 4. جمع صورة، 3D التقديم، وتحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقلوب متحد البؤر المسح بالليزر المجهر (CLSM) لجمع بيانات الصورة بيوفيلم من نظام ميكروفلويديك. تأكد من أن CLSM غير قادرة على تحمل وزن لوحة Bioflux، والتي يمكن أن تصل إلى 150 غرام. ملاحظة: نظرا للالدايمnsions من القنوات ميكروفلويديك، والحاجة إلى حساسية لتمييز هيكل بيوفيلم، ومتطلبات للكشف عن إشارة مضان بدرجات متفاوتة من الشدة، تناسب CLSM مع 40X 1.25 NA عدسة موضوعية أو واحد مع نوعية مماثلة البصرية، التكبير، والفتحة العددية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توحيد بوابات التقاط الانبعاثات مع زيادة وتعويض القياسات التي تبقى ثابتة. تأكد من أن قوة الليزر لا تتجاوز 25٪ وهذا يمكن أن يؤدي في الصورة تبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل ملفات CLSM من L eica أنا بركه F نوع إيل (LIF) لOME (يا قلم M icroscopy E nvironment) نوع الملف. وهذا يسمح لمزيد من سهولة الوصول والتوافق بين البرامج. استخدام البرمجيات المتاحة تجاريا مثل، IMARIS لتحويل الملفات إلى هذا النوع. </li></ol> التقديم 3D للصور / أرقام <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تحويلها إلى تنسيق OME، استخدام البرمجيات المتاحة تجاريا مثل IMARIS لجعل الصورفي 3D. تنفيذ هذه باستخدام مزيج من &quot;Easy3D&quot; و &quot;فق&quot; الخيارات. وينبغي بذل الاهتمام إشارة الخلفية والعتبة: ملاحظة. وظيفة الرسم البياني في IMARIS يمكن استخدامها للحصول على مجموعة جمع وهذا ينبغي أن يبقى ثابتا بين الصور التي يجري تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الصور باستخدام وظيفة &quot;لقطة&quot; وجعل النظر بعناية في دقة الصورة قبل حفظ أنواع الملفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الصور في صورة أرقام باستخدام برامج تحرير مثل الطلاء أو أدوبي المصور. </li></ol> تحليل صورة 3D للالرسوم البيانية والجداول <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام متاحة بحرية يماغيج 23 و COMSTAT / COMSTAT2 38 لتحليل الصور. تحميل حزم من http://rsb.info.nih.gov/ij/ وhttp://comstat.dk/، على التوالي. لديك تحديث جافا أحدث تثبيت. ملاحظة: سيتم JAVA منصة برمجيات تحتاج إلى تثبيت PRIOr لاستخدام برنامج تحليل الصور. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج يماغيج مع COMSTAT2 المساعد لاستيراد ملفات OME لكل صورة بيوفيلم في وضع &quot;hyperstack&quot; وعرض مع &quot;قنوات تقسيم&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فردي تحليل القناتين (أحمر / propidium-يوديد / الميتة كائن قناة 0 والأخضر / SYTO-9 / يجري بث مباشر قناة 1) باستخدام &quot;المدرج&quot; وظيفة من يماغيج. تسرد هذه الوظيفة العدد الإجمالي للبكسل من الملفات OME 8 بت (كما هو موضح &quot;العد&quot;) في كل شدة اللون من 0 إلى 255 (كما هو موضح &quot;قيمة&quot;)، مع 0 كونها بكسل مع عدم وجود إشارة (خلفية) و 255 كائن بكسل مع كامل التشبع الإشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات وتوحيد كل القيم إشارة من ترجيح كل بكسل من شدة إشارة المقابلة. يتم تنفيذ هذا عن طريق ضرب العدد الإجمالي في كثافة إشارة التي قدمها العددية قيمة 8 بت (0-255) من أن كثافة إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باختصار كل القيم المرجحة، 0-255، سواء بالنسبة لقنوات لكل صورة بيوفيلم القبض عليه. خذ مجموع القيم المرجحة لكل من القنوات لتحديد إشارة الإجمالية في المئة من أي قناة. نفعل ذلك لتحديد نسبة النسبية أو في المئة في المئة الأحمر وإشارة خضراء (أي في المئة &quot;ميتة&quot; والمئة &quot;الحقيقية&quot; لكل معاملة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التحليلات الإحصائية، على سبيل المثال باستخدام الذيل اثنين-T-اختبار الطالب المعدلة لعدم المساواة التباين. تعتبر قيم p &lt;0.05 كبيرة وتعتبر تلك قيم p &lt;0.01 كبيرة للغاية. </li></ol></li></ol> 5. خلايا حصاد بيوفيلم لتحليل الثقافة مستقل <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع اللعاب المستهلك وغير المستخدمة من مدخل ومخرج الآبار. غسل الآبار مع 1 مل من الماء المقطر المعقم ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى آبار مدخل و، وذلك باستخدام واجهة التحكم البرمجيات، وتمريرالماء المقطر المعقم إلى الأمام من خلال القنوات في&gt; 8.0 داين / سم 2 (معدل التدفق&gt; 745 ميكرولتر / ساعة، والقص من 800 ثانية -1) لمدة 5 دقائق على الأقل. كرر في الاتجاه المعاكس لمدة 5 دقائق على الأقل ثم كرر إلى الأمام وخطوة عملية الغسيل العكسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من الضوء أو عن طريق المجهر epifluorescence (إذا كانت ملطخة خلايا / المسمى) لإزالة بيوفيلم شاملة (الشكل 2). جمع 100 ميكرولتر الخلية تعليق وتخزينها في -80 ° C لتحليل ثقافة مستقلة. لا يمكن أن يتحقق تحليل فعالة من حيث التكلفة لتكوين المجتمع من خلال استخدام البكتيريا ترميز العلامة FLX amplicon سلسلة البايرو (bTEFAP) باستخدام النهج المبين في نانس وآخرون 20 </li></ol>

<ol>
	<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).</li><li>Wimpenny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metropolis.">Microbial metropolis.</a> Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).</li><li>Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+ruin:+the+formation+of+disease-associated+oral+biofilms.">The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms.</a> Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Cate, J. M., Zaura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+numerous+microbial+species+in+oral+biofilms:+how+could+antibacterial+therapy+be+effective.">The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective.</a> Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).</li><li>Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+collective+recalcitrance+of+microbial+biofilm+communities.">The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities.</a> Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , (2011).</li><li>Smith, H., Smith, H., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. , 1-29 (1964).</li><li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+microbial+aspects+of+periodontal+biofilm+communities,+development+and+treatment.">Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment.</a> Periodontology. 42, 7-12 (2000).</li><li>McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+In+vitro+biofilm+models:+an+overview.">Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview.</a> Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).</li><li>Baehni, P. C., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-plaque+agents+in+the+prevention+of+biofilm-associated+oral+diseases.">Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases.</a> Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).</li><li>Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+oral+microbial+communities+of+wild-type+and+toll-like+receptor+2-deficient+mice+using+a+454+GS+FLX+Titanium+pyrosequencer.">The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer.</a> BMC microbiology. 10, 101 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel.">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).</li><li>Auschill, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+two+antimicrobial+agents+on+early+in+situ+biofilm+formation.">Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation.</a> Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).</li><li>Coenye, T., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+model+systems+to+study+microbial+biofilm+formation.">In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.</a> Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+biofilms+in+antimicrobial+resistance.">Role of biofilms in antimicrobial resistance.</a> ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).</li><li>Wimpenny, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+validity+of+models.">The validity of models.</a> Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).</li><li>Umland, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-validated+essential+genes+identified+in+Acinetobacter+baumannii+by+using+human+ascites+overlap+poorly+with+essential+genes+detected+on+laboratory+media.">In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media.</a> 3 (4), (2012).</li><li>Nance, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+dental+plaque+biofilm+system+to+visualize+and+quantify+the+effect+of+antimicrobials.">A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).</li><li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li><li>Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+approaches+for+multidimensional+biological+image+data.">Visualization approaches for multidimensional biological image data.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+an+alcohol-free+CPC-containing+mouthwash+against+oral+multispecies+biofilms.">Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms.</a> The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology.">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).</li><li>Kim, J., Park, H. D., Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+to+bacterial+biofilm+formation.">Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation.</a> Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).</li><li>Mosier, A. P., Cady, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+bacterial+surface+interactions+using+microfluidic+systems.">Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems.</a> Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).</li><li>Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multispecies+oral+bacterial+community+in+a+saliva-conditioned+flow+cell.">Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).</li><li>Cuadra-Saenz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer-2+influences+interactions+amongst+pioneer+colonizing+streptococci+in+oral+biofilms.">Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms.</a> Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).</li><li>Rickard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer+2:+a+concentration-dependent+signal+for+mutualistic+bacterial+biofilm+growth).">Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth).</a> Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).</li><li>Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+penetration+and+efficacy+in+an+in+vitro+oral+biofilm+model.">Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).</li><li>Diggle, M. A., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+sequence+typing+at+the+speed+of+light.">Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light.</a> Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).</li><li>Hiyari, S., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+diagnostics:+molecular+analysis+of+oral+biofilms.">Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms.</a> Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).</li><li>Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+biofilms:+emerging+concepts+in+microbial+ecology.">Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology.</a> Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+in+the+age+of+genomics+and+metagenomics:+concepts,+tools,+and+recent+advances.">Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances.</a> Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).</li><li>Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

وتبرز هذه الورقة طرق الخطوات الأساسية اللازمة لإعداد وتشغيل نظام ميكروفلويديك بطريقة للسماح لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عن طريق الفم المستمدة من لعاب الإنسان المجمعة والتي تزرع في فلتر تعقيم 25٪ المجمعة لعاب الإنسان. يتم إعطاء النهج لتوصيف بيوفيلم ولكن ي?...

<html> الأغشية الحيوية هي معماريا المجتمعات المعقدة من البكتيريا التي يتم تجميعها على الأسطح 1. يتضمن هذه المجتمعات عادة عديد من الأنواع التي تتفاعل فيما بينها ضمن بيوفيلم 2. الأغشية الحيوية عن طريق الفم، والأكثر واضحة بصريا كونها لوحة الأسنان، هي مشكلة مستمرة في البشر ونتائجها التنمية العشوائية في توليد المجتمعات متعددة الأنواع المتنوعة تصنيفيا 3. البكتيريا المكونة لهذه المجتمعات المتنوعة يمكن أن تصل إلى 1،000 مرات أكثر مقاومة للميكروبات مما هم التعويم الحر (البلانكتون) نظرائهم 4-6. الفشل في علاج هذه المجتمعات بيوفيلم عن طريق الفم، والذي يمكن أن يسبب تسوس الأسنان وأمراض اللثة، وقد نتج عن ذلك عبء جسيم للصحة العامة: أكثر من 500 مليون مرة إلى مكتب طبيب الأسنان سنويا في الولايات المتحدة، وبنحو 108 مليار دولار لعلاج أو منع اللثة المرض وتسوس الأسنان 7. المحتوى &quot;&gt;&quot; في حين تدافع العديد من علماء الأحياء المجهرية دراسة السلوك الميكروبي تحت الظروف الطبيعية، وقليل منهم القيام بذلك. وذلك لأن معنوياتهم للتغلب على الصعوبات التي استنزفت باستمرار من قبل سهولة جذابة للعمل مع الثقافات المختبر. &quot;-Smith 8. في الوقت الحاضر، وأجرى أبحاثا بيوفيلم عن طريق الفم باستخدام مجموعة متنوعة من المجراة في النهج المختبر، ولكل منها مزاياها وعيوبها 9،10. في المختبر النهج غالبا ما تستخدم أنظمة بيوفيلم نموذج التي هي سهلة نسبيا لاقامة ولكنها قد تفتقر السريرية / أهمية في العالم الحقيقي 10،11. في الجسم الحي تعتمد النهج عادة على نظم نموذج حيواني التي قد تتكاثر بعض جوانب البيئة عن طريق الفم الإنسان، ولكن مرة أخرى تعاني من القيود بسبب الاختلافات في علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة بين الحيوانات والبشر 12، 13. وتجدر الإشارة إلى أن الأغشية الحيوية عن طريق الفميمكن أيضا أن تكون وضعت على الأسطح المينا الذي عقد في دعامة داخل أفواه متطوعين من البشر، ولكن هذا النهج هو حاليا مكلفة نسبيا و14،15 كثيفة العمالة. في نهاية المطاف، ويتم اختبار وكلاء أو التقنيات لتحسين الرعاية الصحية عن طريق الفم رواية في البشر في ظل ظروف التجارب السريرية التي تسيطر عليها (11). في الوقت الحاضر، وهي طريقة عمل غالبا ما تستخدم لتحديد وتقييم وكلاء الرعاية الصحية عن طريق الفم الجديد هو لأداء أول الدراسات المختبرية لتبين فعالية المحتملة، ثم قم بإجراء دراسات على الحيوانات و &quot;التجارب الميدانية&quot; التي توظف أطباء لتقييم مدى نجاح هذه التكنولوجيا 9، 16،17. للأسف، الدراسات المختبرية تميل إلى الاعتماد على أنظمة نموذج التي تشغل بصمة كبيرة، تمثل تحديا تقنيا للاستخدام، وغالبا ما تحتوي على المجتمعات مبسطة من واحد أو أكثر في عدد قليل من الأنواع لاستخلاص المحتملين في العالم الحقيقي يعني 10،18. وبالنظر إلى أن الأغشية الحيوية لوحة الأسنان تحتوي على أنواع متعددة، والنموذج في مجمعات للالسابق تتدفق الوسط اللعاب، وتطوير الأغشية الحيوية التي تحتوي على واحد أو عدد قليل من الأنواع في وسائل الإعلام الاصطناعي من غير المرجح أن تولد المجتمعات التي تتصرف بطريقة مشابهة لتلك التي في سيناريو العالم الحقيقي 10،19. لمعالجة الوقت والتكلفة، ومتطلبات التدريب، وطبيعة تمثيلية رديئة من أنظمة بيوفيلم نموذج المختبر بالمقارنة مع البيئة في العالم الحقيقي، وضعنا مؤخرا إنتاجية عالية ونظام بيوفيلم ثيق للبيئة 20 (الشكل 1). فوائد النظام من استخدام اللعاب خالية من الخلايا المجمعة البشري (CFS) كما تجمع البكتيريا اللعاب التي تحتوي على الخلايا البشرية المتوسطة وغير المعالجة (CCS) بمثابة اللقاح. فريد، والنظام أيضا يجمع بين تكنولوجيا ميكروفلويديك، وهو متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر، والتنوع البكتيري تكنولوجيا التحليل ثقافة مستقلة. وهكذا، فإن نظام النموذج هو ثيق للبيئة (باستخدام اللعاب بمثابة اللقاح لتنمو الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في 37 ° C في فلتر تعقيم تتدفقاللعاب) والأغشية الحيوية عن طريق الفم تحتوي على الأنواع (بما في ذلك العقدية، النيسرية، الفيونيلة، والأنواع Porphyromonas) في ممثل وفرة من تلك التي وجدت في وقت مبكر وحة فوق لثوي 20. عندما اعتبر أن هذا العمل يصف استخدام نظام نموذجي وضعت حديثا، ويجب إيلاء اهتمام خاص لدمج ومتحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر (CLSM) على microfluidics، وتقنيات تحليل التنوع ثقافة مستقلة. وكان اتحاد هذه التقنيات من قبل مجموعة بحثنا عن قصد وليس فقط يضيف القدرة الإنتاجية العالية لنظام نموذجي وضعت حديثا، ولكن يسمح أيضا طرح الأسئلة التي لا يمكن معالجتها بسهولة من قبل مع النظم الأخرى. أولا، CLSM ديه مزايا واضحة على المجهري التقليدي لأنها تسمح لتحليل ثلاثي الأبعاد من الأغشية الحيوية. في كثير من الأحيان محل تقدير، وهذا مهم للغاية كما الأغشية الحيوية هي خفة دم غير متجانسةح يتعلق تكوين الأنواع وموقف المكاني فضلا عن الظروف الفسيولوجية التي يجري فرضها في مواقع مكانية مختلفة داخل بيوفيلم 6،21. بالتنسيق مع برنامج ثلاثي الأبعاد تقديم وصورة برامج التحليل، والهندسة المعمارية بيوفيلم، والعلاقات المكانية بين الأنواع المكونة، ومدى قتل المضادة للجراثيم يمكن تحليلها 22-24. هذه القدرات ليست ممكنة باستخدام معيار الضوء المرسل أو المجهري epifluorescence. وبعد ذلك، قد حصل على microfluidics اهتماما خاصا في مجال علم الأحياء المجهرية، لأنها تتيح دراسة الأغشية الحيوية تحت ظروف محكومة بعناية (التدفق، ودرجة الحرارة، ودرجة الحموضة، الخ) ويتطلب سوى كميات صغيرة من السائل 25-27. كنقطة المقارنة، وتزايد على بيوفيلم عن طريق الفم في اللعاب البشري ضمن نظام نموذج خلية تدفق (النظام الذي يعتبر يمكن القول إن النموذج الدعامة الأساسية للعديد من الدراسات بيوفيلم عن طريق الفم) لمدة 20 ساعة بمعدل تدفق مماثل والقص كما ان يتحققفي نظام ميكروفلويديك يتطلب لا يقل عن 200 مل، في مقابل 800 ميكرولتر في الجهاز ميكروفلويديك 28-31. وهكذا، فإن النظام النموذجي بيوفيلم ميكروفلويديك تمكن الدراسة من المواد محدودة الكمية في ظل ظروف محددة. وأخيرا، فقد تم تحسين التكنولوجيا سلسلة البايرو في العقد الماضي للا تتطلب سوى كميات صغيرة من المواد لإجراء تحليل المجتمع وهي متعددة بما فيه الكفاية للسيطرة على عمق التسلسل للحصول على هوية الأنواع بيوفيلم حتى النادرة. استخدام هذه التكنولوجيا، مثل البكتيريا ترميز العلامة FLX amplicon سلسلة البايرو (bTEFAP)، وقد سمح لطرح الأسئلة ذات الصلة بشأن البيئة من الأغشية الحيوية التي ينبغي معالجتها 32،33. مثل هذه الأسئلة التى تصطبغ صعوبات في الماضي عندما كانت سلسلة البايرو غير متوفر بسبب الوقت والتكاليف اللازمة لإنشاء مكتبات البلازميد والخطوات التكنولوجية والتحليلية المعقدة اللازمة لاستخلاص البيانات 33،34. وبطبيعة الحال، وهي ميزة كبيرة مع ثقافة مستقلة ا ف بمقاربات، مثل سلسلة البايرو، هو أن الأنواع البكتيرية التي لا يمكن زراعتها في عزلة داخل وسائل الإعلام مختبر التقليدي (الأنواع أي قابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة) يمكن زراعتها والتعرف داخل منظومة نموذج والوفرة النسبية في المجتمع كميا 35، 36 . لإضافة المنظور، في وقت مبكر من عام 1963، قدرت في وقت متأخر سيغموند Socransky أن ما يقرب من 50٪ من البكتيريا في المواد معزولة عن طريق الفم اللثة شق البشري لا يمكن زرع باستخدام ظروف النمو مختبر 37. والهدف من هذه الورقة هو طرق لوصف النهج لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عن طريق الفم في ميكروفلويديك (Bioflux) النظام المتوفرة تجاريا تحت: (ط) الظروف ممثل تجويف الفم البشري و (ii) مع تكوين الأنواع ووفرتها أن غير قابلة للمقارنة لوحة فوق اللثة. وعلاوة على ذلك، باستخدام كل البرامج مجانية والتجاري، نسلط الضوء بيوفيلم كيف الأساسييمكن أن تستمد التدابير الهندسة المعمارية من البيانات CLSM، مع التركيز على النهج لقياس الكتلة الحيوية بيوفيلم، خشونة، وقدرتها على البقاء (على أساس لايف / تلطيخ الميت). وأخيرا، تم وصفها الخطوات المطلوبة لحصاد المواد بيوفيلم لتحليل التنوع كتبها bTEFAP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
			<td style="width:224px;">AVAILABLE FROM COMPANY</td>
			<td style="width:203px;">CATALOG NUMBER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

وهناك عدد قليل الإنتاجية العالية في أنظمة المختبر التي تسهل تطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحتوي على العديد من الأنواع الكشف عن عادة داخل الجسم الحي في الأغشية الحيوية عن طريق الفم. وعلاوة على ذلك، وهو النظام الذي يستخدم اللعاب البشري الطبيعي كمصدر المغذيات، بدلا من وسائل الإعلام الاصطناعي، أمر مرغوب فيه ولا سيما من أجل دعم التعبير عن الخصائص الخلوية وبيوفيلم محددة التي تحاكي المجتمعات في الجسم الحي. نحن تصف طريقة لتطوير أنواع متعددة الأغشية الحيوية عن طريق الفم التي هي قابلة للمقارنة، فيما يتعلق تكوين الأنواع، إلى فوق اللثة لوحة الأسنان، في ظل ظروف مماثلة لتجويف الفم البشري. على وجه التحديد، وهذه المادة طرق يصف كيف يمكن تكييف نظام ميكروفلويديك المتاحة تجاريا لتسهيل تطوير أنواع متعددة الأغشية الحيوية عن طريق الفم المستمدة من ونمت داخل اللعاب المجمعة. وعلاوة على ذلك، وصفا لكيفية النظام يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع confocaل يزر المسح المجهر لتوليد 3-D إعادة البناء بيوفيلم للتحليلات المعمارية وقدرتها على البقاء وستعرض. ونظرا لتنوع واسع من الكائنات الحية الدقيقة التي تنمو داخل الأغشية الحيوية في النظام ميكروفلويديك (بما في ذلك العقدية، النيسرية، الفيونيلة، Gemella، وPorphyromonas)، كما سيتم عرض بروتوكول تصف كيفية حصاد الخلايا بيوفيلم لمزيد من ثقافة فرعية أو استخراج الحمض النووي والتحليل. سيتم تناولها حدود كل من نظام بيوفيلم ميكروفلويديك والتحليلات الحالية بيانات للدولة من بين الفن. في نهاية المطاف، ومن المتوقع أن هذه المادة سوف توفر تقنية خط الأساس التي من شأنها تحسين دراسة الأغشية الحيوية عن طريق الفم ومساعدة في تطوير تكنولوجيات الإضافية التي يمكن أن تكون متكاملة مع منصة ميكروفلويديك.

3D التقديم من الأغشية الحيوية وتظهر نتائج ممثلة في الشكل (3). وهناك أداة مفيدة في مجال البرمجيات IMARIS هي الخيار لفحص كل شريحة من المكدس بيوفيلم التي تم جمعها، والجمع بينهما لخلق إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. وبال...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms at JoVE.com

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

والهدف من هذه الورقة هو طرق لوصف استخدام نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحتوي على الأنواع التي تم تحديدها عادة في الإنسان لوحة الأسنان فوق اللثة. طرق لوصف العمارة بيوفيلم، قابلية بيوفيلم، ونهجا لحصاد بيوفيلم عن التحليلات التي تعتمد على الثقافة أو ثقافة مستقلة وتسليط الضوء عليها.

استخدام إنتاجية عالية<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.4K Views.  The University of Michigan.  والهدف من هذه الورقة هو طرق لوصف استخدام نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحتوي على الأنواع التي تم تحديدها عادة في الإنسان لوحة الأسنان فوق اللثة. طرق لوصف العمارة بيوفيلم، قابلية بيوفيلم، ونهجا لحصاد بيوفيل?...

Video: Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

ميكروفلويديك الأجهزة لإعادة تأسيس المكروية ورم<em&gt; في المختبر</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

عالية الإنتاجية ميكروفلويديك السريع وانخفاض تكلفة النماذج طرق التعبئة والتغليف

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

التحليل المنهجي لل<em&gt; في المختبر</em&gt; الخليوي المتداول باستخدام نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

الاستخدام الأمثل "روبوت مناولة السائل" إجراء "عالية الإنتاجية إلى الأمام الكيميائية الوراثة شاشة" التمويل نبات

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

نظام ميكروبيوريكتور لإنتاج IgG1 النموذجي في الخلايا شو الآلي استخدام الفائق

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

تعريف عالي الإنتاجية للمقاومة لـ Pseudomonas syringae pv. الطماطم في الطماطم باستخدام الشتلات الفيضانات أساي

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...