Gli autori ringraziano William Nance (Università del Michigan) per un aiuto nella formulazione dei protocolli di crescita biofilm e John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) per un parere su questioni tecnologiche relative al sistema Bioflux. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 di AHR) e University of Michigan fondi di start-up a AHR

Il protocollo di raccolta della saliva qui descritta è stata valutata da l&#39;Università del Michigan Institutional Review Board per soggetto umano di ricerca. NOTA: Per quanto riguarda le recensioni istituzionali per il lavoro umano soggetti di questo tipo, le modalità e le autorizzazioni precedenti dovrebbero essere raccolto dalla istituzione ospitante. In particolare, a seconda dell&#39;istituto, IRB o approvazione etica potrebbero aver bisogno di essere cercato e approvate prima raccolta di saliva da volontari umani può procedere. Come aiuto alla preparazione di una domanda, un utile NIH algoritmo / grafico può essere trovato qui: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 1. Preparazione del pool saliva per l&#39;uso come mezzo di crescita per l&#39;ambiente Germane <ol><li> Reclutare&gt; 5 individui per saliva donazione. Non prendere alcuna informazione di identificazione, assicurarsi che non individuals donerà saliva se sono malati, o hanno preso antibiotici per via orale negli ultimi 3 mesi, o hanno consumato cibi o liquidi, con l&#39;eccezione delle acque, nel precedente 2 ore prima della donazione. </li><li> Raccogliere saliva in 50 ml provette di plastica. Pool la saliva raccolta in un becher di plastica, mantenendolo in ghiaccio. Non utilizzare vetro come polimeri nella saliva aderiscono alle superfici di vetro interne. </li><li> Aggiungi Ditiotreitolo (DTT) per una concentrazione finale di 2,5 mm da uno stock 100x. (Archivio è congelato in monouso aliquote a -20 ° C). Agitare per 10 minuti in un becher di plastica su ghiaccio. </li><li> Al fine di rimuovere il particolato, centrifugare la saliva aggregate per 30 min a 17.500 x g. </li><li> Diluire la saliva con 3 volumi di dH 2 O invia un quarto saliva concentrato. </li><li> Filtro-sterilizzare saliva con 0,22 micron polietersulfone (PES), basso contenuto proteico del filtro vincolante. Usare filtro con grande superficie, o utilizzare più piccoli filtri dell&#39;area. Tenere saliva in uncontenitore di plastica sul ghiaccio mentre filtraggio. </li><li> Congelare la saliva in pool a -80 &#160; ° C in provette di plastica 50 ml fino doveva crescere batteri. Ogni tubo di plastica è solo per uso e dovrebbe contenere non più di 35 ml in ciascun pozzetto microfluidica contiene un massimo di 1,2 ml (1,2 ml x 24 pozzetti = 28,8 ml) e lo spazio è necessaria in ciascuna provetta come saliva espande durante il congelamento. </li><li> Per l&#39;uso, scongelare la saliva pool a temperatura ambiente. Una volta scongelato, il filtro-sterilizzare una volta di più (0,22 micron polietersulfone, proteine ​​a basso filtro legame per rimuovere eventuali precipitati). </li></ol> 2. Preparazione del pool saliva per l&#39;uso come un inoculo <ol><li> Reclutare&gt; 5 individui per saliva donazione. Non prendere alcuna informazione di identificazione, non accertare individui donare saliva se sono malati, hanno preso antibiotici per via orale negli ultimi 3 mesi, o che hanno consumato cibi o liquidi, con l&#39;eccezione delle acque, nel precedente 2 ore prima della donazione. Raccogliere samples oltre 30 min. </li><li> Raccogliere saliva in provette di plastica da 50 ml a temperatura ambiente e in comune la saliva raccolta in un becher di plastica a temperatura ambiente. </li><li> Diluire saliva in pool con autoclave glicerolo grado Reattivo per produrre un titolo con un rapporto finale del 25% glicerolo, il 75% saliva cella contenente [CCS]. </li><li> Congelare saliva a -80 ° C in 3 ml monouso aliquote fino al momento. </li><li> Quando necessario per inoculare il sistema microfluidica, aliquote sono scongelati a temperatura ambiente e agitati delicatamente su un vortex per 5 secondi prima di essere pipettati nel sistema microfluidica come descritto al punto 3 del protocollo, di seguito. </li></ol> 3. La crescita di biofilm orali Multi-specie <ol><li> Pretrattamento CFS <ol><li> Prima mano i canali microfluidica Bioflux con CFS. Aggiungere 100 ml di CFS per ogni presa bene. Utilizzando il software di controllo Bioflux, selezionare &quot;Manuale&quot; e impostare il flusso dai canali tha &quot;B1-B24&quot;t devono essere utilizzati. </li><li> Successivamente, impostare taglio a 1,0 dyne / cm e avviare il flusso per 2 minuti a temperatura ambiente per assicurare una distribuzione omogenea dei CFS tutto il canale. Assicurarsi che sia fluido in ogni canale di ingresso per verificare che la CFS scorreva attraverso tutti i canali in modo uniforme. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Rimuovere la soluzione / pretrattamenti CFS che rimane nei pozzetti di scarico e trasferire ai pozzi di ingresso. Questo volume totale di 100 microlitri servirà a bilanciare contro la pressione applicata alla inoculo dalla presa bene. </li></ol></li><li> Inoculazione <ol><li> Per ogni uscita bene, aggiungere 100 ml di CCS inoculo. Posizionare la piastra microfluidica sulla piastra termica (temperatura impostata a 37 ° C), selezionare manuale all&#39;interno del software di controllo, e al flusso di uscita dai pozzi ai pozzetti di ingresso (cioè, indietro) a 1,0 dyne / cm per esattamente 6 sec. </li><li> Incubare la piastra microfluidica a 37 ° C per 40 min per permettereper aderenza e la crescita dei batteri nel inoculo iniziale. </li></ol></li><li> Crescita Pernottamento <ol><li> Per i canali utilizzati inoculati, aspirare l&#39;inoculo rifiuti da ciascuno dei pozzetti di uscita. Aggiungere fino a 1 ml di volume totale di CFS in ciascuno dei pozzetti di aspirazione (può essere fatto in cima CFS esistente). </li><li> Incubare la piastra microfluidica a 37 ° C, selezionare manuale e impostare il programma per funzionare a 0,2 dyne / cm² per 20 ore. </li></ol></li><li> Stain prelavaggio <ol><li> Aspirare tutto il liquido dai pozzetti di ingresso e uscita e aggiungere 100 ml di PBS (pH 7.4) a ciascuno dei pozzetti di aspirazione. Flusso per 20 minuti a 0,2 dyne / cm². </li></ol></li><li> Stain Inoltre miscela <ol><li> Per la vitalità delle cellule colorazione fare 100 ml di miscela macchia per ogni canale da colorare. In particolare, aggiungere 3 ml di SYTO 9 e 3 ml di ioduro di propidio per ml di PBS utilizzando il kit di colorazione vitalità cellulare commerciale, come Live / Dead. Questo generauna miscela di colorazione contenente 10 mM SYTO 9 e 60 micron ioduro di propidio. </li><li> Aspirare il restante PBS dai pozzetti di aspirazione e quindi aggiungere 100 microlitri della miscela colorante vitalità cellulare a ciascun bocchettone. Impostare scorrere a 0,2 dyne / cm 2 ed eseguire la soluzione dall&#39;aspirazione alla mandata per 45 min a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavaggio post-colorazione <ol><li> Aspirare la macchia rimanente in ciascuno dei pozzetti di aspirazione e aggiungere 100 ml di soluzione salina in ogni ingresso bene. Situato a scorrere a 0,2 dyne / cm² ed eseguire la soluzione PBS da alla mandata per 20 minuti a temperatura ambiente per eliminare ogni macchia in eccesso. </li></ol></li></ol> 4. Immagine Collection, rendering 3D, e Image Analysis <ol><li> Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale invertita (CLSM) per raccogliere i dati di immagine biofilm dal sistema microfluidica. Assicurarsi che il CLSM è in grado di sopportare il peso del piatto Bioflux, che può raggiungere i 150 g. NOTA: Data la monetinansions dei canali microfluidica, la necessità di sensibilità di discernere la struttura biofilm, ei requisiti per rilevare il segnale di fluorescenza di varia intensità, adattano il CLSM con un 40X 1,25 NA lente dell&#39;obiettivo o uno con qualità simile ottica, ingrandimento, e apertura numerica. </li><li> Standardizzare le porte di cattura delle emissioni di guadagno e di offset misurazioni mantenuti costanti. Assicurarsi che la potenza del laser non superi il 25% in quanto ciò può causare fotometabolismo. </li><li> Convertire i file CLSM dalla L EICA I Mage F tipo ile (LIF) a OME (O pen M icroscopy mbiente) tipo di file. Questo consente una maggiore facilità di accesso e compatibilità tra programmi software. Utilizzare il software disponibile in commercio come, Imaris per convertire i file di questo tipo. </li></ol> Rendering 3D per le immagini / Figure <ol start="4"><li> Una volta convertito in formato OME, utilizzare un software disponibile in commercio come Imaris rendere le immaginiin 3D. Eseguire questo utilizzando una combinazione di opzioni &quot;superare&quot; &quot;Easy3D&quot; e. NOTA: Attenzione al segnale di fondo e soglia dovrebbe essere fatto. La funzione istogramma in Imaris può essere utilizzato per ottenere la gamma di raccolta e questo deve essere mantenuta costante tra immagini analizzati. </li><li> Salvare le immagini utilizzando la funzione &quot;snapshot&quot; e fare un attento esame di risoluzione prima di salvare i tipi di file. </li><li> Montare immagini in figure utilizzando immagine software di editing, come CorelDraw o Adobe Illustrator. </li></ol> Image Analysis 3D per Grafici e tabelle <ol start="7"><li> Utilizzare liberamente disponibile ImageJ 23 e COMSTAT / COMSTAT2 38 per l&#39;analisi delle immagini. Scaricare i pacchetti da http://rsb.info.nih.gov/ij/ e http://comstat.dk/ rispettivamente. Avere l&#39;aggiornamento più recente di Java installato. NOTA: Il JAVA piattaforma software dovrà essere installato prior per l&#39;uso del software di analisi di immagine. <ol><li> Utilizzare il software ImageJ con COMSTAT2 plugin per importare i file OME per ogni immagine biofilm in modalità &quot;HyperStack&quot; e vista con &quot;canali SPLIT&quot;. </li><li> Analizzare singolarmente i due canali (rosso / propidio-ioduro / morti canale da 0, / DIRETTA essendo canale verde / SYTO-9 1) utilizzando la funzione &quot;istogramma&quot; di ImageJ. Questa funzione riporta il numero totale di pixel di file OME 8 bit (indicate come &quot;count&quot;) ad ogni intensità di colore da 0 a 255 (indicato come &quot;valore&quot;), con 0 essendo pixel con assenza di segnale (fondo) e 255 dell&#39;essere pixel con saturazione del segnale completo. </li><li> Esportare i dati in un foglio di calcolo e di standardizzare tutti i valori dei segnali ponderando ogni pixel per l&#39;intensità del segnale corrispondente. Questa operazione viene eseguita moltiplicando il numero totale ad una data intensità di segnale dal valore numerico 8 bit (0-255) di tale intensità di segnale. </li><li> Sommare tutti i valori ponderati, 0-255, per entrambi i canali per ogni immagine catturata biofilm. Prendere la somma dei valori ponderati per entrambi i canali di determinare il segnale totale cento da uno dei due canali. Fate questo per determinare il relativo rapporto o cento rosso e il segnale verde per cento (vale a dire la percentuale di &quot;morto&quot; e cento &quot;LIVE&quot; per ogni trattamento). </li><li> Effettuare analisi statistiche, per esempio con due code T-test di Student modificato per varianza disuguale. Valori di p &lt;0,05 sono considerati significativi e quei valori di p &lt;0,01 sono considerati altamente significativo. </li></ol></li></ol> 5. La raccolta Biofilm Cells per l&#39;analisi Cultura-indipendente <ol start="1"><li> Rimuovere tutti saliva esaurito e inutilizzato da ingresso e di uscita pozzi. Lavare i pozzetti con 1 ml di acqua distillata sterile tre volte. </li><li> Aggiungere 100 ml di acqua distillata sterile per i pozzi di ingresso e, utilizzando l&#39;interfaccia di controllo del software, passare ilacqua distillata sterile in avanti attraverso i canali a&gt; 8,0 dyne / cm 2 (portata&gt; 745 ml / h, al taglio di 800 sec -1) per almeno 5 minuti. Ripetere in senso inverso per almeno 5 minuti e poi ripetere il processo in avanti e indietro fase di lavaggio. </li><li> Controllare dalla luce o al microscopio a epifluorescenza (se sono state colorate cellule / etichettato) per la rimozione biofilm spinto (Figura 2). Raccogliere il 100 microlitri di cellule-sospensioni e conservare a -80 ° C per l&#39;analisi della cultura indipendente. Un&#39;analisi economica di composizione della comunità può essere raggiunto attraverso l&#39;utilizzo di batteri tag con codifica FLX amplicone pyrosequencing (bTEFAP) utilizzando l&#39;approccio descritto in Nance et al. 20 </li></ol>

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<li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews%29%5BTitle%5D)+AND+%22MMBR%22%5BJournal%5D)">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li>
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<li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+dentistry+Spec+No+12B-17B%22%5BJournal%5D)">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li>
<li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li>
</ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

Questo documento mette in evidenza i metodi i passaggi di base necessari per configurare e gestire un sistema di microfluidica in modo da consentire lo sviluppo di biofilm orali multi-specie derivati ​​da pool saliva umana e coltivate in sterilizzata per filtrazione 25% pool saliva umana. Approcci per caratterizzare il biofilm sono date ma va ricordato che questi approcci descritti sono modificabili e tecnologie aggiuntive come, ad esempio, macchie o etichette possono essere introdotti. È un dato di esempio, si pot...

<html> I biofilm sono architettonicamente comunità complesse di batteri che sono raggruppati sulle superfici 1. Queste comunità in genere contengono numerose specie che interagiscono tra loro all&#39;interno del biofilm 2. Biofilm orali, il più visivamente evidente essendo la placca dentale, sono un problema persistente negli esseri umani e dei loro risultati di sviluppo incontrollato della generazione di tassonomicamente diverse comunità multi-specie 3. I batteri che compongono queste diverse comunità possono essere fino a 1.000 volte più resistenti agli antibiotici rispetto ai loro (planctonici) controparti free-floating 4-6. Il mancato trattamento di queste comunità biofilm orali, che possono causare carie e malattia parodontale, ha portato ad un notevole onere di salute pubblica: oltre 500 milioni di visite dal dentista all&#39;anno negli Stati Uniti, e uno di circa 108.000 milioni dollari per trattare o prevenire parodontale malattia e carie dentale 7. content &quot;&gt;&quot; Mentre molti microbiologi sostengono lo studio del comportamento microbica in condizioni naturali, alcuni di loro lo fanno. Questo perché la loro morale per superare le difficoltà è costantemente minato dalla facilità attraente di lavorare con culture di laboratorio. &quot;-Smith 8. Allo stato attuale, la ricerca biofilm orale è condotta utilizzando una varietà di in vivo e in vitro approcci, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi 9,10. In vitro avvicina spesso utilizzano sistemi biofilm modello che sono relativamente facili da impostare, ma possono mancare clinico / rilevanza nel mondo reale 10,11. In vivo approcci fanno affidamento sui sistemi modello animale che possono riprodurre alcuni aspetti dell&#39;ambiente orale umana, ma ancora una volta soffrire di limitazioni dovute a differenze di anatomia, fisiologia, microbiologia e immunologia tra animali ed esseri umani 12, 13. Va notato che biofilm oralipuò anche essere sviluppato su superfici smaltate detenuti in uno stent all&#39;interno delle bocche di volontari umani, ma questo approccio è attualmente relativamente costoso e 14,15 alta intensità di manodopera. In ultima analisi, nuovi agenti o tecnologie per migliorare l&#39;assistenza sanitaria per via orale sono testati sugli esseri umani in condizioni di studi clinici controllati 11. Allo stato attuale, un modus operandi spesso utilizzato per identificare e valutare nuovi agenti sanitari orali è quello di eseguire studi di laboratorio prima di discernere potenziale efficacia, e quindi eseguire studi sugli animali e le &quot;prove sul campo&quot;, che utilizzano i medici per valutare il successo della tecnologia 9, 16,17. Purtroppo, studi di laboratorio tendono a fare affidamento su sistemi modello che occupano una grande impronta, sono tecnologicamente difficile da usare, e spesso contengono semplificati comunità di uno o al massimo un paio di specie di trarre il potenziale del mondo reale che significa 10,18. Dato che biofilm di placca dentale contengono più specie e forma in un complex scorre ambiente salivare, sviluppando biofilm che contengono una o poche specie mezzi artificiale è improbabile generare comunità che si comportano in modo simile a quelle di un scenario reale 10,19. Per affrontare il tempo, costi, requisiti di formazione, e la rappresentatività dei poveri sistemi biofilm modelli di laboratorio rispetto per l&#39;ambiente del mondo reale, abbiamo recentemente sviluppato un elevato throughput e di biofilm germano ambientale 20 (Figura 1). I vantaggi del sistema l&#39;uso di pool saliva umana cell-free (CFS) come mezzo e non trattata pool saliva cellule contenenti batterica umana (CCS) come inoculo. Unicamente, il sistema combina la tecnologia microfluidica, un microscopio confocale a scansione laser, e la diversità batterica tecnologia cultura indipendente di analisi. Così, il sistema modello è attinente ambientale (utilizzando la saliva come inoculo di crescere biofilm multispecie a 37 ° C in sterilizzata per filtrazione, che scorresaliva) e biofilm orali contengono specie (tra cui Streptococcus, Neisseria, Veillonella, e specie Porphyromonas) in abbondanze rappresentante di quelle che si trovano nei primi mesi della placca sopragengivale 20. Quando si considera che questo lavoro descrive l&#39;utilizzo del modello di sistema di nuova concezione, particolare attenzione deve essere data alla fusione di un microscopio a scansione laser confocale (CLSM) microfluidica, e le tecnologie della cultura indipendente di analisi diversità. L&#39;unione di queste tecnologie da parte del nostro gruppo di ricerca è stato intenzionale e non solo aggiunge una capacità high-throughput per il sistema modello di nuova concezione, ma permette anche domande da porre che non potrebbero essere facilmente affrontati prima che con altri sistemi. In primo luogo, CLSM presenta evidenti vantaggi rispetto microscopia tradizionale in quanto consente l&#39;analisi tridimensionale di biofilm. Spesso incompreso, questo è estremamente importante in quanto biofilm sono wit eterogeneih rispetto alla composizione delle specie e posizione spaziale e le condizioni fisiologiche imposti in differenti posizioni spaziali all&#39;interno del biofilm 6,21. In concerto con software tridimensionale di rendering e immagini software di analisi, l&#39;architettura biofilm, relazioni spaziali tra le specie che lo compongono, e l&#39;estensione della soppressione antimicrobica possono essere analizzati 22-24. Tali capacità non sono possibili utilizzando standard di luce trasmessa o epifluorescenza. Successivamente, microfluidica ha raccolto un&#39;attenzione particolare nel campo della microbiologia quanto consente lo studio di biofilm in condizioni attentamente controllate (portata, temperatura, pH, ecc) e richiede solo piccoli volumi di liquido 25-27. Come punto di confronto, in crescita di biofilm orale nella saliva umana all&#39;interno di un sistema modello cella di flusso (un sistema che è probabilmente considerato il modello di pilastro per molti studi biofilm orale) per 20 ore ad una simile portata e taglio conseguito,in un sistema microfluidico richiede almeno 200 ml, rispetto a 800 microlitri nel dispositivo microfluidico 28-31. Così, un sistema modello biofilm microfluidico consente lo studio di materiale quantità limitata determinate condizioni. Infine, la tecnologia pirosequenziamento è stata ottimizzata nell&#39;ultimo decennio richiedere solo piccole quantità di materiale di eseguire un&#39;analisi comunità ed è sufficientemente versatile per controllare la profondità di sequenziamento per ottenere l&#39;identità di specie biofilm anche rare. L&#39;uso di questa tecnologia, come ad esempio batteri tag con codifica FLX amplicone pyrosequencing (bTEFAP), ha consentito di domande pertinenti riguardanti l&#39;ecologia di biofilm da affrontare 32,33. Queste domande imbevuti difficoltà in passato, quando pirosequenziamento non era disponibile a causa del tempo e dei costi necessari per creare librerie plasmidi e le misure tecnologiche e analitici complessi necessari per ricavare dati 33,34. Naturalmente, un grande vantaggio di cultura indipendente apapprocci, come pirosequenziamento, è che le specie batteriche che non possono essere coltivate isolatamente entro supporti laboratorio convenzionali (specie cioè vitali ma non coltivabili) possono essere coltivate ed identificati nel sistema modello e loro abbondanza relativa nella comunità quantificati 35, 36 . Per aggiungere prospettiva, già nel 1963 il ritardo Sigmund Socransky stima che circa il 50% dei batteri in materiale isolato dal gengivale orale umana non potrebbe essere coltivato utilizzando condizioni di crescita di laboratorio 37. L&#39;obiettivo di questo lavoro è quello di metodi descrivere l&#39;approccio per sviluppare orale biofilm multi-specie in un sistema disponibile in commercio microfluidica (Bioflux) in: (i) condizioni rappresentative della cavità orale umana e (ii) con una composizione e abbondanza delle specie che è paragonabile alla placca sopragengivale. Inoltre, utilizzando sia software freeware e commerciali, si evidenzia come biofilm di basemisure architettura possono essere derivate da dati CLSM, con un focus sugli approcci per quantificare biofilm biomassa, rugosità, e la vitalità (basati su Live / colorazione Morto). Infine, sono descritti i passaggi necessari per raccogliere materiale biofilm per l&#39;analisi della diversità, bTEFAP.

<table><tbody><tr><td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Sorval ultracentrifuge&amp;nbsp; (SS-34 compatible)</td><td>Thermoscientific</td><td>Unit-dependent</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific SS-34 Rotor&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>28-020</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td><td>Thermo&amp;nbsp; Scientific Inc</td><td>23-290-065</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td><td>VWR</td><td>73520-986&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>NC0542269</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux microfluidic system</td><td>Fluxion</td><td>Bioflux 200 system</td><td></td></tr><tr><td>Bioflux 24-channel plate</td><td>Fluxion</td><td>910-0004</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Lecia</td><td>SPE or eqivalent system</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence Microscope</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Pyrosequencing facilities</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Temperature Freezer -80&amp;nbsp;&amp;deg;C</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Tips (20, 200, and 1,000&amp;nbsp;&amp;#956;l)</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 &amp;#956;l)</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bioflux dedicated software</td><td>Bioflux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SPE</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSTAT/COMSTAT 2</td><td>Freeware (http://www.comstat.dk/)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

Ci sono pochi-throughput elevato in sistemi in vitro che facilitano lo sviluppo di biofilm multispecie che contengono numerose specie comunemente rilevati all&#39;interno di biofilm orali in vivo. Inoltre, un sistema che utilizza saliva umana naturale come fonte di nutrienti, invece di mezzi artificiali, è particolarmente auspicabile per sostenere l&#39;espressione di proprietà cellulari e specifici biofilm che imitano le comunità in vivo. Noi descriviamo un metodo per lo sviluppo di multispecie biofilm orali che sono paragonabili, rispetto alla composizione delle specie, per sopragengivale placca dentale, in condizioni analoghe a cavità orale umana. In particolare, questo articolo metodi descriverà come un sistema microfluidico disponibile in commercio può essere adattato per facilitare lo sviluppo di multispecie biofilm orali derivate da e coltivata all&#39;interno saliva pool. Inoltre, una descrizione di come il sistema può essere utilizzato in congiunzione con un confocalaser microscopio a scansione l per generare 3-D ricostruzioni biofilm per analisi di architettura e vitalità saranno presentati. Data la grande diversità dei microrganismi che si sviluppano all&#39;interno di biofilm nel sistema microfluidica (compreso Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, e Porphyromonas), un protocollo verrà presentato anche che descrive come raccogliere le cellule biofilm per ulteriori subcultura o l&#39;estrazione del DNA e l&#39;analisi. Verranno trattati i limiti sia del sistema biofilm microfluidica e le analisi attuali state-of-the-art di dati. In ultima analisi, è previsto che tale articolo fornisce una tecnica di base in grado di migliorare lo studio dei biofilm orali e contribuire allo sviluppo di tecnologie aggiuntive che possono essere integrate con la piattaforma microfluidica.

Rendering 3D di biofilm Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3. Uno strumento utile nel software Imaris è la possibilità di esaminare ogni fetta di stack biofilm raccolta e combinarli per creare ricostruzioni tridimensionali. Inoltre, gli effetti shadowing artificiali possono essere aggiunti per aiutare visivamente interpretare strutture tridimensionali. I biofilm resi possono essere orientati in qualsiasi direzione con diversi ingran...

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Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

L&#39;obiettivo di questo metodo è di descrivere l&#39;uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l&#39;architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati.

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.5K Views.  The University of Michigan.  L'obiettivo di questo metodo è di descrivere l'uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l'architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati. 

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Biochimica

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Bioingegneria

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Modello CF adattabile per test antimicrobici e analisi della dinamica microbica

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Sviluppo di un modello di biofilm di colonia polimicrobica per testare gli antimicrobici nella fibrosi cistica

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

Sviluppo di un modello di biofilm di colonia polimicrobica per testare gli antimicrobici nella fibrosi cistica

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

L'uso di un high-throughput

Riepilogo

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