Name: a guide to generating and using hipsc derived npcs for the study of neurological diseases
Uploaded: 2015-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases at JoVE.com

Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation - Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

1. hiPSC בידול לתאים עצבי אב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ולהתרחב hiPSCs בתאי גזע עוברי אנושיים תקשורת (הס) (טבלת 1) שיתוף תרבותי על פיברובלסטים עכבר עובריים שכבת מזין עד מושבות גדולות (אבל subconfluent) מוכנות לבידול עצבי באמצעות גוף embryoid (EB) ביניים (MEF) (איור 2). תנאי תרבות hiPSC שגרה מתוארים גם במקומות אחרים 16,17; בקצרה, לגדול hiPSCs בתקשורת הס על שכבת מזין MEF עד מחוברות, מעבר אז אנזימים עם collagenase (1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMEM) ולהרחיב כ 1: 3 בכל 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למ&quot;ל להכין צלחות פולי-L-ornithine / laminin מצופים, צלחות מעילים עם 10 גר &#39;/ פולי-L-ornithine במים סטריליים על משטחי פלסטיק (50 גר&#39; / מיליליטר למשטחי זכוכית) ולדגור על RT עבור 3-24 שעות. לשטוף לפחות פעם אחת עם מים סטריליים ולאחר מכן מעיל עם 5G / מיליליטר Laminin בPBS סטרילי ב RT עבור 3-24 שעות. הערה: אם עטוף בפלסטיק, צלחות יכולות להיותלאחסן עד שישה חודשים ב -20 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, אנזימים להרים hiPSCs subconfluent (בדרך כלל גדל על MEFs, או hiPSCs גדל בתקשורת מוגדרת כגון 18 TeSR על Matrigel) ממושבות גדולות כמו הצלחת באמצעות 1mg / ml Collagenase IV בDMEM / F12. הערה: בעקבות 1-2 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, מושבות מרחף בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות מושבות hiPSC (על ידי שיקוע, לא צנטריפוגה) 1-2x עם DMEM / F12, גלול ב2ml / היטב N2 תקשורת / B27 (טבלת 1) והעברה למאכלים שאינם חסיד 6 היטב (לשלב 3-בארות לתוך 1 &quot;טוב) 19. הערה: לילה, מושבות תהווה אשכולות כדוריים צפים מכונה &quot;גופי embryoid&quot; (EBS). מצפה מוות תאי משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, צלחות הטיה ולאפשר EBS להתיישב. מוציא בזהירות את התקשורת לשטוף פעם אחת עם DMEM / F12 כדי להסיר שאריות. להאכיל עם N2 / B27 תקשורת בתוספת מעכבים כפולים הסמאד (0.1M LDN193189 ו10M SB431542) 12 </sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימי 3-7, neuralization יתרחש בהקשר של עיכוב הסמאד כפול; לבדוק שEBS הם עגול, אבל לא פיברוזיס. להאכיל את EBS בכל יום שני בתקשורת N2 / B27 בתוספת 0.1M LDN193189 ו10M SB431542. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימי 7-14, הבא ציפוי של EBS לפולי-L-ornithine / Laminin צלחות מצופים, לבדוק באמצעות מיקרוסקופ brightfield שרוזטות העצבית מתחילה להופיע תוך מספר ימים (מאופיין כאשכולות עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס; איור 1). תמשיך להאכיל את EBS חסיד בכל יום שני בתקשורת N2 / B27 בתוספת 0.1M LDN193189, 10M SB431542 ו -1 g / ml laminin. </li></ol> 2. קציר של עצבי רוזטות הערה: אנו ממליצים שרוזטות העצבית לקצור enzymatically באמצעות העצבי רוזט הבחירה מגיב 20 או מגיב בחירה דומה. למרות רוזטות העצבית ניתן לאסוף באופן ידני לתוך 6-גם צלחת מצופה פולי-L-ornithine / Laminin, thiהמתודולוגיה של לוקחת הכשרה מקיפה להורים, ו, תלוי במיומנות למשתמש, עשוי לדרוש עגול של חיטוט ביום 20 להעשרה נוספת לNPCs ורוקן סוגים שאינם עצביים תא שני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחירה האנזימטית של רוזטות העצבית ביום 14, תקשורת לשאוב מEBS דבק ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב בחירת שושנה עצבי לכל גם לצלחת 6-היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם pipetman P1000, להסיר בעדינות אנזים מכל טוב. הוסף 1 מיליליטר של DMEM / F12 לכל גם לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם P1000, לאסוף 1 מיליליטר של DMEM / F12 ובמהירות לגרש DMEM / F12 בחזרה לתוך הבאר, ובכך לנתק את רוזטות מהצלחת. לאסוף את רוזטות לתוך צינור בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 1 מיליליטר נוסף של DMEM / F12 ובמהירות לגרש לאותו גם לנתק רוזטות שנותרה. (אל triturate. נסה לא לשבור את אגרגטים שושנה). לאסוף את רוזטות העצבית לתוך הצינור בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 במידת צורך. אם רוזטות לא לנתק בקלות, להוסיף מומחדש אנזים וחזור על התהליך (שלבים 2.1-2.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב לשטוף, ומחדש להשעות רוזטות ב 2 מיליליטר של תקשורת NPC (טבלת 1). תאי העברה (1: 1) לפולי-L-ornithine / Laminin מצופים 6 צלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימי 15-21, רוזטות העצבית תרחיב; רוזטות להאכיל בכל יום שני בתקשורת NPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את האיכות של רוזטות העצבית ולהבטיח שתאים כמו פיברובלסטים-שטוחים אינם מתרחבים בתוך התרבות. הערה: אם אינה רוזטות להתמיד, תרבות NPC יכולה לפעמים להציל ידי מסיק ידני, בחירה רק את הטוב ביותר של רוזטות הרימו לתוך Accutase. לנתק את 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. גלולה, לשטוף וצלחת בתקשורת NPC על 24 גם צלחת מצופה פולי-L-ornithine / Laminin. </li></ol> 3. הרחבת תאים עצבי אב הערה: ניתן לגדל hiPSC NPCs משני Matrigel- או פולי-L-ornithine / Laminin צלחות מצופים. אנחנו בדרך כלל להשתמש Matrigel-צלחות כפי שהם יכולים להיות מוכנים במהירות רבה יותר ובעלות נמוכה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחות Matrigel מצופים, במהירות להפשיר וresuspend aliquot הקפוא 1mg של Matrigel ב 24 מיליליטר DMEM / F12 קר ולהפיץ באופן מיידי 2 מיליליטר היטב כל אחד משני לוחות שישה-היטב. דגירה במשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: Matrigel צריך רק להישאף, לא שטף, מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל NPCs בכל יום שני ולשמור על צפיפות גבוהה מאוד, או שהם באופן ספונטני יבדילו לתאי עצב. הערה: NPCs למרות מבוסס יותר הם בדרך כלל לפצל 1: 4 בכל שבוע, NPCs מעבר נמוך מאוד ניתן לפצל 1: 2 לעתים רחוקות ככל אחת לשבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפצל, תקשורת לשאוב ראשונה ולהוסיף 1 מיליליטר Accutase החם (1X) לכל טוב של 6-גם צלחת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר תאים מנותקים לתוך צינור המכיל 15 מיליליטר DMEM / F12 עם לחץ מכאני קטן ככל האפשר. אל לכייל תאים ואילו באנזים. תאים גלולה ידי spinning XG ב 1000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב לשטוף, מחדש להשעות NPCs ב~ 1 מיליליטר מדיה NPC בכל טוב המקורי של 6-גם. הערה: צפה שליש לו גם מחוברות של צלחת 6-גם 5-10 מיליון תאים; זה יכול להיות מאושר על ידי ספירת aliquot 10L של תאים באמצעות hematocytometer מחדש ציפוי קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מחדש השעיה, NPCs מחדש הצלחת כNPCs, תאי עצב או neurospheres. כדי לשמור על NPCs, צלחת כ-1-2 מיליון תאים לכל טוב של 6-גם צלחת. היעילות של היווצרות neurosphere יכולה להשתנות בין ניסויים ושורות תאים, אך בדרך כלל מתרחשת הכי טוב אם בין 200,000 ו 1,000,000 תאי זרע לכל טוב של 6-גם צלחת לא חסיד; אם התקבצות של neurospheres מתרחשת, להפחית את מספר תאי זרע. להבדיל לתאי עצב, צלחת כ -200,000 תאים לכל טוב של 6-גם צלחת, החלפת מדיה NPC עם תקשורת Neuron. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunohistochemically לאמת כל שורת NPC הוקמה. Expan מרגע שחומר תאי מספיק כברNPCs טוליפ אין, תווית עם נוגדנים לnestin וSox2. קווי Validated NPC גם צריכים להיות מובחנים לתוך הנוירונים למשך 4-6 שבועות, ושכותרתו עם נוגדנים לIII טובולין וMAP2AB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים בparaformaldehyde 4% PBS ב 4C במשך 10 דקות. Permeabilize NPCs ב RT במשך 15 דקות ב1.0% Triton בPBS, ולאחר מכן לחסום ב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני ב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton, הלילה בשעה 4C. הערה: אנו ממליצים הנוגדנים הבאים: העז נגד Sox2, 1: 200; Nestin עכבר אנטי-אנושי, 1: 200; אנטי-βIII טובולין ארנב, 1: 500; עכבר אנטי-βIII טובולין, 1: 500; העכבר אנטי-MAP2AB, 1: 200. (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף עם PBS, דגירה תאי נוגדנים משני עם הנוגדנים משני מצומדות המתאימים לעז, עכבר או ארנבת ב 1: 300, בב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton במשך 1-2 שעות בRT. כדי להמחיש גרעינים, תאי כתם עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) ולאחר מכן לעלות עם Vectashield. </li></ol></li></ol> 4. NPC התמרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש spinfection (צנטריפוגה של צלחות תרבית תאים בנוכחות הווירוס XG ב 1000 עבור שעה 1) כדי להגדיל את אחוז תאי transfected 21. תקשורת לשאוב ולהחליף עם ביטוי היתר הרלוונטי (או שליטה) lentiviruses (או רטרווירוסים), titered לריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים) (בדרך כלל 1-10), בדילול מלא בתקשורת NPC. השתמש בכל טוב של 6-גם צלחת 1.5 מיליליטר נפח (או נפח מדורגים בהתאם לסוגים אחרים של צלחות תרבית רקמה). ספין XG ב 1000 ו -37 ºC עבור שעה 1 בצנטריפוגה צלחת. הערה: באופן אידיאלי, transduce NPCs עם lentiviral או וקטורי retroviral בתוך 1-2 ימים של פיצול. בין אם באמצעות וירוסים מסחריים או-הכין מעבדה, זה יכול להיות מועיל לtiter כראוי קבוצות של וירוס מראש על ידי דילול סדרתי. (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית celמות lular, להחליף תקשורת בתוך 8 שעות של spinfection. הערה: שילוב ויראלי וביטוי transgene צריכה להתגלות בתוך 24 שעות על ידי הקרינה גן הכתב. (אם הווירוס חסר כתב ניאון, זה קשה יותר להעריך; transfection המוצלח ביותר יכול להיות מאומת על ידי immunoblot, אימונוהיסטוכימיה או qPCR למוצרי ביטוי יתר.) ביטוי מלא עשוי להימשך 3-7 ימים; spinfections חוזר ונשנה עם וירוס נוסף עשוי להידרש להגדיל את האחוז של תאי transfected. spinfections החוזר יכול להתרחש מדי יום, אך לא צריך להיות כל כך תכוף. באופן אידיאלי, אם באמצעות כתב ניאון,&gt; 80% של תאים צריכים להיות מסומנים. </li></ol> 5. neurosphere ההגירה Assay הערה: טופס neurospheres באופן ספונטני, בעקבות הניתוק האנזימטית של NPCs (על ידי אופן זהה לזה המשמש בהרחבת NPC - הצעדים 3.3-3.6), אם תאים בתרבית השעיה בתקשורת NPC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לגדול לנתקNPCs ד בתקשורת NPC במשך 48 שעות בצלחות nonadherent כדי ליצור neurospheres. (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגירת neurosphere, להכין צלחות Matrigel טריות באמצעות תקשורת NPC קרה, ולא DMEM, בצלחת 96-היטב, 1-2 שעות לפני neurosphere קטיף. לא לשאוב Matrigel מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שפורסם במקור עבור neurospheres מקורן בתאי הגזע עוברי 22, לבחור באופן ידני neurospheres נגזרת NPC תחת מיקרוסקופ, לאחר שטיפת פעם בתקשורת NPC כדי להסיר פסולת הסלולר. העבר את neurosphere אחד היטב בכל צלחת 96-היטב Matrigel מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.5 מ&quot;ג נוסף Matrigel, בדילול מלא בתקשורת NPC הקרה, לneurospheres בכל צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני במרכז כל neurosphere הבודד באמצע גם באמצעות קצה pipet. הערה: חשוב לבחור neurospheres בגודל דומה, על מנת לצמצם את השונות בתוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הגירה להתרחש במשך 48 שעות ולאחר מכן לתקן תאי wה- i paraformaldehyde 4% וכתם עם סמני immunohistochemical הרצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הגירת רדיאלי היא שיקבע, neurospheres תצלום בהם לחלוטין באמצעות מטרת 4x מיקרוסקופ. תכלול כל neurospheres פנייה קצה טוב או neurosphere שני מהניתוח. הערה: אם הגירה מתרחשת למשך זמן ארוך יותר מ -48 שעות, הגירת רדיאלי וכתוצאה מכך צפויה להיות גדולה מדי לתמונה באמצעות אובייקטיבי 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הגירה ממוצעת מכל neurosphere באמצעות תוכנת NIH ImageJ (איור 5). ניתן לעשות זאת באמצעות כל אחת משיטות הניתוח המפורטות להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירת מחוגי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להתחקות הקצה של התאים הרחוקים הנודד באמצעות כלי הבחירה חופשית ולאחר מכן להשתמש באמצעי הפונקציה (Ctrl + M) כדי לחשב את השטח של הצורה וכתוצאה מכך. לפני מדידת השטח לוודא שהשטח מסומן בחלון מדידות סט נמצא תחת הלשונית לנתח. השתמש בערך של מדידת השטח והמשוואה עבור שטחיו של מעגל (= πr 2) כדי לקבוע את הרדיוס (חיצוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר קצה neurosphere המקורי, למדוד את השטח ולחשב את הרדיוס (הפנימי) באותה הדרך. לחשב את הגירת רדיאלי הכוללת כהפרש בין הרדיוסים החיצוניים ופנימיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגירה סלולרית הגדולה ביותר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המרחק שעבר מחמשת התאים הרחוקים מקצה neurosphere הפנימי באמצעות כלי בחירת קו הישר ואחריו מדוד הפונקציה (Ctrl + M). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Brennand, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+differences+in+hiPSC+NPCs+derived+from+patients+with+schizophrenia.">Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. , (2014).</li><li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development.">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).</li><li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).</li><li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+heat+shock+factor+1+in+neuronal+response+to+fetal+environmental+risks+and+its+relevance+to+brain+disorders.">Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders.</a> Neuron. 82, 560-572 (2014).</li><li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+neuronal+differentiation+and+mitochondrial+dysfunction+in+hair+follicle-derived+induced+pluripotent+stem+cells+of+schizophrenia+patients.">Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients.</a> Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).</li><li>Paulsen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+oxygen+metabolism+associated+to+neurogenesis+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+a+schizophrenic+patient.">Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).</li><li>Yu, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+hippocampal+neurogenesis+using+human+pluripotent+stem+cells.">Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).</li><li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li><li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders.">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. , (2014).</li><li>Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+pf+Inflammation+and+Tumor+Microenvironment+in+the+Development+of+Gastrointestinal+Cancers:+What+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Can+Do.">Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do.</a> Current stem cell research &amp; therapy. , (2014).</li><li>An, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Correction+of+Huntington's+Disease+Phenotypes+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143, 527-539 (2010).</li><li>Sareen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+7+and+19+trisomy+in+cultured+human+neural+progenitor+cells.">Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells.</a> PLoS One. 4, e7630 (2009).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Cowan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts.">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li><li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells.">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460, 1127-1131 (2009).</li><li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+model+spinocerebellar+ataxia+type+2+in+vitro.">Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro.</a> Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Delaloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+coordinates+proliferation+and+migration+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors.">MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors.</a> Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li><li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).</li><li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo.">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

יש לנו תארנו שיטות שבאמצעותו להבחין hiPSCs לNPCs, סוג תא עצבי שבחלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC נשמרת ושעשויה לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה 8, 11. בנוסף, כפי שפורטנו, NPCs הוא אוכלוסייה עצבית וחסונה replicative וtransduced בקלות, שא?...

מחקרי ביטוי גנים של תאי עצב הבדיל במבחנה מתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSCs) על ידינו 1 ואחרים מצביעים על כך שתאי עצב 2,3 hiPSC דומים רקמת מוח עוברית ולא למבוגרים. נכון לעכשיו, מודלים מבוססי hiPSC עשויים להיות מתאימים יותר ללימוד נטייה ל, ולא תכונות מאוחרות של, מחלה נוירולוגית. יש לנו דיווח בעבר כי חלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה נשמרת בתאי סכיזופרניה הנגזר hiPSC העצביים אב (NPCs), מצביע על כך שNPCs עשוי להיות סוג תא שימושי לחקר המסלולים המולקולריים תורם לסכיזופרניה 1 . אנחנו ואחרים דיווחנו הגירה חריגה, סטרס חמצונים מוגברים ומיני חמצן תגובתי, רגישות ללחצים סביבתיים תת-סף ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה בסכיזופרניה hiPSC NPCs 1,4-6, כמו גם ירידת ג העצביonnectivity ותפקוד הסינפטי בנוירונים hiPSC סכיזופרניה 5,7-10. אם הגורמים המולקולריים תרמו להגירה חריגה ו / או סטרס חמצונים בסכיזופרניה hiPSC NPCs גם בבסיס הקישוריות העצבית המופחתת בתאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה, NPCs יכול להיות אוכלוסייה עצבית חזקה וreplicative מאוד שבה לחקור את המנגנונים אחראים למחלה. יתר על כן, כי אחד יכול במהירות לייצר מספר רב של תאים ולא צריך לחכות שבועות או חודשים להבשלה עצבית, מבחני מבוססי NPC מתאימים למחקר של קבוצות גדולות יותר של משתתפים והם נוחים יותר להקרנת תפוקה גבוהה. אנו מאמינים כי hiPSC NPCs יכול לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה, כפי שכבר הוכיח בהפרעות מגוונות כמו מחלת סכיזופרניה 1 והנטינגטון 11. להבדיל מNPCs hiPSCs, עצבי ראשוני בduction מושגת על ידי עיכוב כפול הסמאד (0.1mm LDN193189 ו10mm SB431542) 12. על ידי להכעיס BMP וTGF איתות עם מולקולות קטנות אלה, האנדודרם ומפרט mesoderm חסום, האצת בידול עצבי ומובילים להיווצרות של שושנות עצביות גלויות בתוך השבוע של ציפוי אחד. דפוסים עצביים מתרחש בשלב מוקדם בתהליך הזה, ככל הנראה בתקופת היווצרות שושנה עצבית ומייד לאחר מכן. בהיעדר רמזים אחרים, התאים עצביים האלה פרימיטיביים להניח גורל כמו המוח הקדמי-קדמי 13. מייד לאחר היווצרות שושנה עצבית, ומתמשך לאורך הרחבת NPC, NPCs המוח הקדמי בתרבית עם FGF2 8,14. יש להם פוטנציאל שושלת כפול ויכול להיות מובחן לאוכלוסיות עצביות של 70-80% נוירונים III טובולין-חיוביים וחלבון חומצי (GFAP) האסטרוציטים 20-30% גליה fibrillary -positive (איור 1). רוב הנוירונים hiPSC המוח הקדמי הם VGLUT1 חיובי, ולכן הם ככל הנראה glutamatergic, למרות שכ -30% מתאי העצב הם GAD67-חיובי (GABAergic) 8. NPCs הוא passaged באופן שיגרתי יותר מעשר פעמים במבחנה, תוך שמירה על פרופילי בידול עקביים, וללא צבירת חריגות קריוטיפ. קבוצות דיווחו NPCs passaging יותר מ -40 פעמים 15, לעומת זאת, אנו מוצאים כי מעבר לעשרה קטעים, NPCs להראות גדל נטייה לבידול astrocyte. NPCs גם לסבול הקפאה-מפשיר מרובה ויכול לעבור לגדול כneurospheres פשוט על ידי culturing בצלחות שאינן חסיד. NPCs הם transduced ביעילות על ידי וקטורים ויראליים, המאפשר הערכה מהירה של התוצאות מולקולריות ותאיות של ההפרעות גנטיות, ובקלות להרחבה להניב מספיק חומר למחקרים ביוכימיים. יתר על כן, מכיוון שוקטורים ויראליים להתיר חזק על ביטוי ו / או מציאה של גנים של מחלות-רלוונטיות, בכל שליטה או neur חולה נגזרתאי אל, אחד יכול להשתמש בפלטפורמה זו על מנת לבחון את ההשפעה של רקע גנטי על המניפולציות הללו. למרות שאינו מתאים להסינפטי או מבחני מבוססי פעילות הדורשים תאים בוגרים, NPCs עשוי להיות חלופה מעשית עבור רבים ניתוחים מולקולריים או ביוכימי פשוטים של תאים עצביים המופקת מחולה.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>for HES media</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>for neural media</td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>Needs to be lot tested</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#17502-048</td><td>Needs to be lot tested</td></tr><tr><td>B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;#12587-010</td><td>Needs to be lot tested</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>Resuspend in PBS + 1% BSA</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>GDNF&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&amp;nbsp;#450-10</td><td>Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclic-AMP</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;#D0627</td><td>Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>#A0278</td><td>Resuspend in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>&amp;nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Millipore</td><td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, Natural Mouse 1 mg</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD</td><td>#354230</td><td>Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent</td></tr><tr><td>Tissue culture treated 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low attachment 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-Sox2&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc&amp;shy;17320</td><td>use at 1:200</td></tr><tr><td>mouse anti-human Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>use at 1:200</td></tr><tr><td>rabbit anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Covance</td><td>PRB&amp;shy;435P</td><td>use at 1:500</td></tr><tr><td>mouse anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Covance</td><td>MMS&amp;shy;435P</td><td>use at 1:500</td></tr><tr><td>mouse anti-MAP2AB</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td>use at 1:200</td></tr><tr><td>Plate centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide to generating and using hipsc derived npcs for the study of neurological diseases

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

ניתן לזהות רוזטות העצבית מורפולוגית, באמצעות מיקרוסקופ brightfield, לפי המראה האופייני שלהם כמקבצים עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס (איור 1). למרות NPCs הם בדרך כלל בתרבית בצפיפות תאים גבוהה מאוד, הבא passaging מייד, מעט סומה בצורת הפירמידה ומבנה neurite דו קוטבי ה?...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases at JoVE.com

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Research

JoVE Journal

Medicine

18.2K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Video: A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Developmental Biology

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

הזרקה מערכתית של תאי גזע / אב עצביים בעכברים עם EAE כרוני

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Immunology and Infection

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Neuroscience

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides reliable analysis of neuronal morphology together with quantitative measurements of modifications on neurite length and synaptic protein localization and abundance upon treatment with small molecule compounds. In addition to the application of the presented method in neurite outgrowth studies, neurotoxicity assessment can be performed to assess, distinguish and rank commercial chemical compounds based on their potential developmental neurotoxicity effect.
Even though cell lines are nowadays widely used in compound screening assays in neuroscience, they often differ genetically and phenotypically from their tissue origin. Primary cells, on the other hand, maintain important markers and functions observed in vivo. Therefore, due to the translation potential and physiological relevance that these cells could offer neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment can considerably benefit from using human neural progenitor cells (hNPCs) as the primary human cell model.
The presented method herein can be utilized to screen for the ability of compounds to induce neurite outgrowth and neurotoxicity by taking advantage of the human neural progenitor cell-derived neurons, a cell model closely representing human biology.&#34;

The presented protocol describes a method for a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment of small molecule compounds.

Neurite Outgrowth שיטת והערכה רעילות נוירועם האדם העצבי תא מחולל נוירונים

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Differentiation of Porcine Induced Pluripotent Stem Cells (piPSCs) into Neural Progenitor Cells (NPCs)

iPSC-derived neurons are attractive in vitro models to study neurogenesis and early phenotypic changes in mental illness, mainly when most animal models used in pre-clinical research, such as rodents, are not able to meet the criteria to translate the findings to the clinic. Non-human primates, canines, and porcine are considered more adequate models for biomedical research and drug development purposes, mainly due to their physiological, genetic, and anatomical similarities to humans. The swine model has gained particular interest in translational neuroscience, enabling safety and allotransplantation testing. Herein the generation of porcine iPSCs is described along with its further differentiation into neural progenitor cells (NPCs). The generated cells expressed NPC markers Nestin and GFAP, confirmed by RT-qPCR, and were positive for Nestin, b-Tubulin III, and Vimentin by immunofluorescence. These results show the evidence for the generation of NPC-like cells after in vitro induction with chemical inhibitors from a large animal model, an interesting and adequate model for regenerative and translational medicine research.

Differentiation of Porcine Induced Pluripotent Stem Cells piPSCs into Neural Progenitor Cells NPCs

This protocol describes a method for chemical differentiation and culture of neural progenitor cells derived from porcine induced pluripotent stem cells (piPSCs).

iPSC-derived neurons are attractive in vitro models to study neurogenesis and early phenotypic changes in mental illness, mainly when most animal models ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other therapeutic strategies, there is currently no cure available for the injured or diseased brain. Cell replacement appears as a promising therapeutic strategy for neurodegenerative conditions. To this day, neural stem cells (NSCs) have been successfully generated from fetal tissues, human embryonic cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPSC). A process of dedifferentiation was initiated by activation of the novel human GPI-linked glycoprotein, which leads to generation of pluripotent stem cells. These blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) differentiate in vitro into cells with a neural phenotype as shown by brightfield and immunofluorescence microscopy. Ultrastructural analysis of these cells by means of electron microscopy confirms their primitive structure as well as neuronal-like morphology and subcellular characteristics.

We present a genetically modified-free (GM-free) method to obtain cells with a neuronal phenotype from reprogrammed peripheral blood cells. Activation of a signaling pathway linked to novel human GPI-linked protein reveals an efficient GM-free method for obtaining human pluripotent stem cells.

דור ללא GM של תאים עצביים שמקורם בדם

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first advent, protocols have been continuously optimized and are now widely used in research and drug development. However, the very long duration of these conventional differentiation and maturation protocols and the increasing demand for high-quality hiPSCs and their neural derivatives raise the need for the adoption, optimization, and standardization of these protocols to large-scale production. This work presents a fast and efficient protocol for the differentiation of genetically modified, doxycycline-inducible neurogenin 2 (iNGN2)-expressing hiPSCs into neurons using a benchtop three-dimensional (3D) suspension bioreactor.
In brief, single-cell suspensions of iNGN2-hiPSCs were allowed to form aggregates within 24 h, and neuronal lineage commitment was induced by the addition of doxycycline. Aggregates were dissociated after 2 days of induction and cells were either cryopreserved or replated for terminal maturation. The generated iNGN2 neurons expressed classical neuronal markers early on and formed complex neuritic networks within 1 week after replating, indicating an increasing maturity of neuronal cultures. In summary, a detailed step-by-step protocol for the fast generation of hiPSC-derived neurons in a 3D environment is provided that holds great potential as a starting point for disease modeling, phenotypic high-throughput drug screenings, and large-scale toxicity testing.

This article describes a protocol for the generation of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a benchtop 3D suspension bioreactor.

ייצור נוירוגנין אנושי 2-Inducible Neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...