Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation - Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

1. hiPSC בידול לתאים עצבי אב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ולהתרחב hiPSCs בתאי גזע עוברי אנושיים תקשורת (הס) (טבלת 1) שיתוף תרבותי על פיברובלסטים עכבר עובריים שכבת מזין עד מושבות גדולות (אבל subconfluent) מוכנות לבידול עצבי באמצעות גוף embryoid (EB) ביניים (MEF) (איור 2). תנאי תרבות hiPSC שגרה מתוארים גם במקומות אחרים 16,17; בקצרה, לגדול hiPSCs בתקשורת הס על שכבת מזין MEF עד מחוברות, מעבר אז אנזימים עם collagenase (1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMEM) ולהרחיב כ 1: 3 בכל 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למ&quot;ל להכין צלחות פולי-L-ornithine / laminin מצופים, צלחות מעילים עם 10 גר &#39;/ פולי-L-ornithine במים סטריליים על משטחי פלסטיק (50 גר&#39; / מיליליטר למשטחי זכוכית) ולדגור על RT עבור 3-24 שעות. לשטוף לפחות פעם אחת עם מים סטריליים ולאחר מכן מעיל עם 5G / מיליליטר Laminin בPBS סטרילי ב RT עבור 3-24 שעות. הערה: אם עטוף בפלסטיק, צלחות יכולות להיותלאחסן עד שישה חודשים ב -20 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, אנזימים להרים hiPSCs subconfluent (בדרך כלל גדל על MEFs, או hiPSCs גדל בתקשורת מוגדרת כגון 18 TeSR על Matrigel) ממושבות גדולות כמו הצלחת באמצעות 1mg / ml Collagenase IV בDMEM / F12. הערה: בעקבות 1-2 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, מושבות מרחף בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות מושבות hiPSC (על ידי שיקוע, לא צנטריפוגה) 1-2x עם DMEM / F12, גלול ב2ml / היטב N2 תקשורת / B27 (טבלת 1) והעברה למאכלים שאינם חסיד 6 היטב (לשלב 3-בארות לתוך 1 &quot;טוב) 19. הערה: לילה, מושבות תהווה אשכולות כדוריים צפים מכונה &quot;גופי embryoid&quot; (EBS). מצפה מוות תאי משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, צלחות הטיה ולאפשר EBS להתיישב. מוציא בזהירות את התקשורת לשטוף פעם אחת עם DMEM / F12 כדי להסיר שאריות. להאכיל עם N2 / B27 תקשורת בתוספת מעכבים כפולים הסמאד (0.1M LDN193189 ו10M SB431542) 12 </sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימי 3-7, neuralization יתרחש בהקשר של עיכוב הסמאד כפול; לבדוק שEBS הם עגול, אבל לא פיברוזיס. להאכיל את EBS בכל יום שני בתקשורת N2 / B27 בתוספת 0.1M LDN193189 ו10M SB431542. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימי 7-14, הבא ציפוי של EBS לפולי-L-ornithine / Laminin צלחות מצופים, לבדוק באמצעות מיקרוסקופ brightfield שרוזטות העצבית מתחילה להופיע תוך מספר ימים (מאופיין כאשכולות עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס; איור 1). תמשיך להאכיל את EBS חסיד בכל יום שני בתקשורת N2 / B27 בתוספת 0.1M LDN193189, 10M SB431542 ו -1 g / ml laminin. </li></ol> 2. קציר של עצבי רוזטות הערה: אנו ממליצים שרוזטות העצבית לקצור enzymatically באמצעות העצבי רוזט הבחירה מגיב 20 או מגיב בחירה דומה. למרות רוזטות העצבית ניתן לאסוף באופן ידני לתוך 6-גם צלחת מצופה פולי-L-ornithine / Laminin, thiהמתודולוגיה של לוקחת הכשרה מקיפה להורים, ו, תלוי במיומנות למשתמש, עשוי לדרוש עגול של חיטוט ביום 20 להעשרה נוספת לNPCs ורוקן סוגים שאינם עצביים תא שני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחירה האנזימטית של רוזטות העצבית ביום 14, תקשורת לשאוב מEBS דבק ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב בחירת שושנה עצבי לכל גם לצלחת 6-היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם pipetman P1000, להסיר בעדינות אנזים מכל טוב. הוסף 1 מיליליטר של DMEM / F12 לכל גם לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם P1000, לאסוף 1 מיליליטר של DMEM / F12 ובמהירות לגרש DMEM / F12 בחזרה לתוך הבאר, ובכך לנתק את רוזטות מהצלחת. לאסוף את רוזטות לתוך צינור בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 1 מיליליטר נוסף של DMEM / F12 ובמהירות לגרש לאותו גם לנתק רוזטות שנותרה. (אל triturate. נסה לא לשבור את אגרגטים שושנה). לאסוף את רוזטות העצבית לתוך הצינור בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 במידת צורך. אם רוזטות לא לנתק בקלות, להוסיף מומחדש אנזים וחזור על התהליך (שלבים 2.1-2.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב לשטוף, ומחדש להשעות רוזטות ב 2 מיליליטר של תקשורת NPC (טבלת 1). תאי העברה (1: 1) לפולי-L-ornithine / Laminin מצופים 6 צלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימי 15-21, רוזטות העצבית תרחיב; רוזטות להאכיל בכל יום שני בתקשורת NPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את האיכות של רוזטות העצבית ולהבטיח שתאים כמו פיברובלסטים-שטוחים אינם מתרחבים בתוך התרבות. הערה: אם אינה רוזטות להתמיד, תרבות NPC יכולה לפעמים להציל ידי מסיק ידני, בחירה רק את הטוב ביותר של רוזטות הרימו לתוך Accutase. לנתק את 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. גלולה, לשטוף וצלחת בתקשורת NPC על 24 גם צלחת מצופה פולי-L-ornithine / Laminin. </li></ol> 3. הרחבת תאים עצבי אב הערה: ניתן לגדל hiPSC NPCs משני Matrigel- או פולי-L-ornithine / Laminin צלחות מצופים. אנחנו בדרך כלל להשתמש Matrigel-צלחות כפי שהם יכולים להיות מוכנים במהירות רבה יותר ובעלות נמוכה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחות Matrigel מצופים, במהירות להפשיר וresuspend aliquot הקפוא 1mg של Matrigel ב 24 מיליליטר DMEM / F12 קר ולהפיץ באופן מיידי 2 מיליליטר היטב כל אחד משני לוחות שישה-היטב. דגירה במשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: Matrigel צריך רק להישאף, לא שטף, מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל NPCs בכל יום שני ולשמור על צפיפות גבוהה מאוד, או שהם באופן ספונטני יבדילו לתאי עצב. הערה: NPCs למרות מבוסס יותר הם בדרך כלל לפצל 1: 4 בכל שבוע, NPCs מעבר נמוך מאוד ניתן לפצל 1: 2 לעתים רחוקות ככל אחת לשבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפצל, תקשורת לשאוב ראשונה ולהוסיף 1 מיליליטר Accutase החם (1X) לכל טוב של 6-גם צלחת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר תאים מנותקים לתוך צינור המכיל 15 מיליליטר DMEM / F12 עם לחץ מכאני קטן ככל האפשר. אל לכייל תאים ואילו באנזים. תאים גלולה ידי spinning XG ב 1000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב לשטוף, מחדש להשעות NPCs ב~ 1 מיליליטר מדיה NPC בכל טוב המקורי של 6-גם. הערה: צפה שליש לו גם מחוברות של צלחת 6-גם 5-10 מיליון תאים; זה יכול להיות מאושר על ידי ספירת aliquot 10L של תאים באמצעות hematocytometer מחדש ציפוי קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מחדש השעיה, NPCs מחדש הצלחת כNPCs, תאי עצב או neurospheres. כדי לשמור על NPCs, צלחת כ-1-2 מיליון תאים לכל טוב של 6-גם צלחת. היעילות של היווצרות neurosphere יכולה להשתנות בין ניסויים ושורות תאים, אך בדרך כלל מתרחשת הכי טוב אם בין 200,000 ו 1,000,000 תאי זרע לכל טוב של 6-גם צלחת לא חסיד; אם התקבצות של neurospheres מתרחשת, להפחית את מספר תאי זרע. להבדיל לתאי עצב, צלחת כ -200,000 תאים לכל טוב של 6-גם צלחת, החלפת מדיה NPC עם תקשורת Neuron. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunohistochemically לאמת כל שורת NPC הוקמה. Expan מרגע שחומר תאי מספיק כברNPCs טוליפ אין, תווית עם נוגדנים לnestin וSox2. קווי Validated NPC גם צריכים להיות מובחנים לתוך הנוירונים למשך 4-6 שבועות, ושכותרתו עם נוגדנים לIII טובולין וMAP2AB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים בparaformaldehyde 4% PBS ב 4C במשך 10 דקות. Permeabilize NPCs ב RT במשך 15 דקות ב1.0% Triton בPBS, ולאחר מכן לחסום ב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני ב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton, הלילה בשעה 4C. הערה: אנו ממליצים הנוגדנים הבאים: העז נגד Sox2, 1: 200; Nestin עכבר אנטי-אנושי, 1: 200; אנטי-βIII טובולין ארנב, 1: 500; עכבר אנטי-βIII טובולין, 1: 500; העכבר אנטי-MAP2AB, 1: 200. (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף עם PBS, דגירה תאי נוגדנים משני עם הנוגדנים משני מצומדות המתאימים לעז, עכבר או ארנבת ב 1: 300, בב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton במשך 1-2 שעות בRT. כדי להמחיש גרעינים, תאי כתם עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) ולאחר מכן לעלות עם Vectashield. </li></ol></li></ol> 4. NPC התמרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש spinfection (צנטריפוגה של צלחות תרבית תאים בנוכחות הווירוס XG ב 1000 עבור שעה 1) כדי להגדיל את אחוז תאי transfected 21. תקשורת לשאוב ולהחליף עם ביטוי היתר הרלוונטי (או שליטה) lentiviruses (או רטרווירוסים), titered לריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים) (בדרך כלל 1-10), בדילול מלא בתקשורת NPC. השתמש בכל טוב של 6-גם צלחת 1.5 מיליליטר נפח (או נפח מדורגים בהתאם לסוגים אחרים של צלחות תרבית רקמה). ספין XG ב 1000 ו -37 ºC עבור שעה 1 בצנטריפוגה צלחת. הערה: באופן אידיאלי, transduce NPCs עם lentiviral או וקטורי retroviral בתוך 1-2 ימים של פיצול. בין אם באמצעות וירוסים מסחריים או-הכין מעבדה, זה יכול להיות מועיל לtiter כראוי קבוצות של וירוס מראש על ידי דילול סדרתי. (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית celמות lular, להחליף תקשורת בתוך 8 שעות של spinfection. הערה: שילוב ויראלי וביטוי transgene צריכה להתגלות בתוך 24 שעות על ידי הקרינה גן הכתב. (אם הווירוס חסר כתב ניאון, זה קשה יותר להעריך; transfection המוצלח ביותר יכול להיות מאומת על ידי immunoblot, אימונוהיסטוכימיה או qPCR למוצרי ביטוי יתר.) ביטוי מלא עשוי להימשך 3-7 ימים; spinfections חוזר ונשנה עם וירוס נוסף עשוי להידרש להגדיל את האחוז של תאי transfected. spinfections החוזר יכול להתרחש מדי יום, אך לא צריך להיות כל כך תכוף. באופן אידיאלי, אם באמצעות כתב ניאון,&gt; 80% של תאים צריכים להיות מסומנים. </li></ol> 5. neurosphere ההגירה Assay הערה: טופס neurospheres באופן ספונטני, בעקבות הניתוק האנזימטית של NPCs (על ידי אופן זהה לזה המשמש בהרחבת NPC - הצעדים 3.3-3.6), אם תאים בתרבית השעיה בתקשורת NPC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לגדול לנתקNPCs ד בתקשורת NPC במשך 48 שעות בצלחות nonadherent כדי ליצור neurospheres. (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגירת neurosphere, להכין צלחות Matrigel טריות באמצעות תקשורת NPC קרה, ולא DMEM, בצלחת 96-היטב, 1-2 שעות לפני neurosphere קטיף. לא לשאוב Matrigel מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שפורסם במקור עבור neurospheres מקורן בתאי הגזע עוברי 22, לבחור באופן ידני neurospheres נגזרת NPC תחת מיקרוסקופ, לאחר שטיפת פעם בתקשורת NPC כדי להסיר פסולת הסלולר. העבר את neurosphere אחד היטב בכל צלחת 96-היטב Matrigel מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.5 מ&quot;ג נוסף Matrigel, בדילול מלא בתקשורת NPC הקרה, לneurospheres בכל צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני במרכז כל neurosphere הבודד באמצע גם באמצעות קצה pipet. הערה: חשוב לבחור neurospheres בגודל דומה, על מנת לצמצם את השונות בתוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הגירה להתרחש במשך 48 שעות ולאחר מכן לתקן תאי wה- i paraformaldehyde 4% וכתם עם סמני immunohistochemical הרצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הגירת רדיאלי היא שיקבע, neurospheres תצלום בהם לחלוטין באמצעות מטרת 4x מיקרוסקופ. תכלול כל neurospheres פנייה קצה טוב או neurosphere שני מהניתוח. הערה: אם הגירה מתרחשת למשך זמן ארוך יותר מ -48 שעות, הגירת רדיאלי וכתוצאה מכך צפויה להיות גדולה מדי לתמונה באמצעות אובייקטיבי 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הגירה ממוצעת מכל neurosphere באמצעות תוכנת NIH ImageJ (איור 5). ניתן לעשות זאת באמצעות כל אחת משיטות הניתוח המפורטות להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירת מחוגי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להתחקות הקצה של התאים הרחוקים הנודד באמצעות כלי הבחירה חופשית ולאחר מכן להשתמש באמצעי הפונקציה (Ctrl + M) כדי לחשב את השטח של הצורה וכתוצאה מכך. לפני מדידת השטח לוודא שהשטח מסומן בחלון מדידות סט נמצא תחת הלשונית לנתח. השתמש בערך של מדידת השטח והמשוואה עבור שטחיו של מעגל (= πr 2) כדי לקבוע את הרדיוס (חיצוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר קצה neurosphere המקורי, למדוד את השטח ולחשב את הרדיוס (הפנימי) באותה הדרך. לחשב את הגירת רדיאלי הכוללת כהפרש בין הרדיוסים החיצוניים ופנימיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגירה סלולרית הגדולה ביותר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המרחק שעבר מחמשת התאים הרחוקים מקצה neurosphere הפנימי באמצעות כלי בחירת קו הישר ואחריו מדוד הפונקציה (Ctrl + M). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Brennand, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+differences+in+hiPSC+NPCs+derived+from+patients+with+schizophrenia.">Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. , (2014).</li><li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development.">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).</li><li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).</li><li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+heat+shock+factor+1+in+neuronal+response+to+fetal+environmental+risks+and+its+relevance+to+brain+disorders.">Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders.</a> Neuron. 82, 560-572 (2014).</li><li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+neuronal+differentiation+and+mitochondrial+dysfunction+in+hair+follicle-derived+induced+pluripotent+stem+cells+of+schizophrenia+patients.">Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients.</a> Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).</li><li>Paulsen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+oxygen+metabolism+associated+to+neurogenesis+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+a+schizophrenic+patient.">Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).</li><li>Yu, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+hippocampal+neurogenesis+using+human+pluripotent+stem+cells.">Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).</li><li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li><li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders.">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. , (2014).</li><li>Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+pf+Inflammation+and+Tumor+Microenvironment+in+the+Development+of+Gastrointestinal+Cancers:+What+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Can+Do.">Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do.</a> Current stem cell research &amp; therapy. , (2014).</li><li>An, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Correction+of+Huntington's+Disease+Phenotypes+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143, 527-539 (2010).</li><li>Sareen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+7+and+19+trisomy+in+cultured+human+neural+progenitor+cells.">Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells.</a> PLoS One. 4, e7630 (2009).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Cowan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts.">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li><li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells.">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460, 1127-1131 (2009).</li><li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+model+spinocerebellar+ataxia+type+2+in+vitro.">Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro.</a> Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Delaloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+coordinates+proliferation+and+migration+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors.">MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors.</a> Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li><li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).</li><li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo.">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

יש לנו תארנו שיטות שבאמצעותו להבחין hiPSCs לNPCs, סוג תא עצבי שבחלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC נשמרת ושעשויה לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה 8, 11. בנוסף, כפי שפורטנו, NPCs הוא אוכלוסייה עצבית וחסונה replicative וtransduced בקלות, שא?...

מחקרי ביטוי גנים של תאי עצב הבדיל במבחנה מתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSCs) על ידינו 1 ואחרים מצביעים על כך שתאי עצב 2,3 hiPSC דומים רקמת מוח עוברית ולא למבוגרים. נכון לעכשיו, מודלים מבוססי hiPSC עשויים להיות מתאימים יותר ללימוד נטייה ל, ולא תכונות מאוחרות של, מחלה נוירולוגית. יש לנו דיווח בעבר כי חלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה נשמרת בתאי סכיזופרניה הנגזר hiPSC העצביים אב (NPCs), מצביע על כך שNPCs עשוי להיות סוג תא שימושי לחקר המסלולים המולקולריים תורם לסכיזופרניה 1 . אנחנו ואחרים דיווחנו הגירה חריגה, סטרס חמצונים מוגברים ומיני חמצן תגובתי, רגישות ללחצים סביבתיים תת-סף ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה בסכיזופרניה hiPSC NPCs 1,4-6, כמו גם ירידת ג העצביonnectivity ותפקוד הסינפטי בנוירונים hiPSC סכיזופרניה 5,7-10. אם הגורמים המולקולריים תרמו להגירה חריגה ו / או סטרס חמצונים בסכיזופרניה hiPSC NPCs גם בבסיס הקישוריות העצבית המופחתת בתאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה, NPCs יכול להיות אוכלוסייה עצבית חזקה וreplicative מאוד שבה לחקור את המנגנונים אחראים למחלה. יתר על כן, כי אחד יכול במהירות לייצר מספר רב של תאים ולא צריך לחכות שבועות או חודשים להבשלה עצבית, מבחני מבוססי NPC מתאימים למחקר של קבוצות גדולות יותר של משתתפים והם נוחים יותר להקרנת תפוקה גבוהה. אנו מאמינים כי hiPSC NPCs יכול לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה, כפי שכבר הוכיח בהפרעות מגוונות כמו מחלת סכיזופרניה 1 והנטינגטון 11. להבדיל מNPCs hiPSCs, עצבי ראשוני בduction מושגת על ידי עיכוב כפול הסמאד (0.1mm LDN193189 ו10mm SB431542) 12. על ידי להכעיס BMP וTGF איתות עם מולקולות קטנות אלה, האנדודרם ומפרט mesoderm חסום, האצת בידול עצבי ומובילים להיווצרות של שושנות עצביות גלויות בתוך השבוע של ציפוי אחד. דפוסים עצביים מתרחש בשלב מוקדם בתהליך הזה, ככל הנראה בתקופת היווצרות שושנה עצבית ומייד לאחר מכן. בהיעדר רמזים אחרים, התאים עצביים האלה פרימיטיביים להניח גורל כמו המוח הקדמי-קדמי 13. מייד לאחר היווצרות שושנה עצבית, ומתמשך לאורך הרחבת NPC, NPCs המוח הקדמי בתרבית עם FGF2 8,14. יש להם פוטנציאל שושלת כפול ויכול להיות מובחן לאוכלוסיות עצביות של 70-80% נוירונים III טובולין-חיוביים וחלבון חומצי (GFAP) האסטרוציטים 20-30% גליה fibrillary -positive (איור 1). רוב הנוירונים hiPSC המוח הקדמי הם VGLUT1 חיובי, ולכן הם ככל הנראה glutamatergic, למרות שכ -30% מתאי העצב הם GAD67-חיובי (GABAergic) 8. NPCs הוא passaged באופן שיגרתי יותר מעשר פעמים במבחנה, תוך שמירה על פרופילי בידול עקביים, וללא צבירת חריגות קריוטיפ. קבוצות דיווחו NPCs passaging יותר מ -40 פעמים 15, לעומת זאת, אנו מוצאים כי מעבר לעשרה קטעים, NPCs להראות גדל נטייה לבידול astrocyte. NPCs גם לסבול הקפאה-מפשיר מרובה ויכול לעבור לגדול כneurospheres פשוט על ידי culturing בצלחות שאינן חסיד. NPCs הם transduced ביעילות על ידי וקטורים ויראליים, המאפשר הערכה מהירה של התוצאות מולקולריות ותאיות של ההפרעות גנטיות, ובקלות להרחבה להניב מספיק חומר למחקרים ביוכימיים. יתר על כן, מכיוון שוקטורים ויראליים להתיר חזק על ביטוי ו / או מציאה של גנים של מחלות-רלוונטיות, בכל שליטה או neur חולה נגזרתאי אל, אחד יכול להשתמש בפלטפורמה זו על מנת לבחון את ההשפעה של רקע גנטי על המניפולציות הללו. למרות שאינו מתאים להסינפטי או מבחני מבוססי פעילות הדורשים תאים בוגרים, NPCs עשוי להיות חלופה מעשית עבור רבים ניתוחים מולקולריים או ביוכימי פשוטים של תאים עצביים המופקת מחולה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1174">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:500px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#11330</td>
			<td>for HES media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#10565</td>
			<td style="width:500px;">for neural media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">KO-Serum Replacement</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#10828</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Glutamax</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#35050</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">NEAA</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#11140</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">2&#8208;mercaptoethanol (55mM 1000x)</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#21985-023</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">N2</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#17502-048</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27-RA</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#12587-010</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FGF2</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#13256-029</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LDN193189</td>
			<td style="width:171px;">Stemgent</td>
			<td style="width:216px;">#04-0074</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">SB431542</td>
			<td style="width:171px;">Stemgent</td>
			<td style="width:216px;">#04-0010</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:216px;">#450-02</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">GDNF&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#450-10</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Dibutyryl cyclic-AMP</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#D0627</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">#A0278</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in H20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#05832</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Accutase</td>
			<td style="width:171px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:216px;">AT-104</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#17104019</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CF1 mEFs</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">#PMEF-CF</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P3655</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Laminin, Natural Mouse 1mg</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#23017-015</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">BD Matrigel</td>
			<td style="width:171px;">BD</td>
			<td style="width:216px;">#354230</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:216px;">3506</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ultra low attachment 6-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:216px;">3471</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">goat anti-Sox2&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:216px;">sc&#173;17320</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-human Nestin</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">MAB5326</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">rabbit anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:171px;">Covance</td>
			<td style="width:216px;">PRB&#173;435P</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:171px;">Covance</td>
			<td style="width:216px;">MMS&#173;435P</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-MAP2AB</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">M1406</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Plate centrifuge</td>
			<td style="width:171px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to generating and using hipsc derived npcs for the study of neurological diseases

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

ניתן לזהות רוזטות העצבית מורפולוגית, באמצעות מיקרוסקופ brightfield, לפי המראה האופייני שלהם כמקבצים עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס (איור 1). למרות NPCs הם בדרך כלל בתרבית בצפיפות תאים גבוהה מאוד, הבא passaging מייד, מעט סומה בצורת הפירמידה ומבנה neurite דו קוטבי ה?...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases at JoVE.com

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Research

JoVE Journal

Medicine

18.1K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Video: A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

ניצול גירוי מגנטי Transcranial לחקר מערכת Neuromuscular האדם

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

שימוש Saccadometry עם דיפ גירוי המוח לחקר תפקוד מוח נורמלי ופתולוגיים

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

משטר phenotyping עבור עכברים מהונדסים גנטית בשימוש ללמוד גנים מעורבים מחלות אנושיות של הזדקנות

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

Setting Up a Stroke Team Algorithm and Conducting Simulation-based Training in the Emergency Department - A Practical Guide

Time is of the essence when caring for an acute stroke patient. The ultimate goal is to restore blood flow to the ischemic brain. This can be&#160;achieved by either&#160;thrombolysis with recombinant tissue-plasminogen activator (rt-PA), the standard therapy for stroke patients who present within the first hours of symptom onset without contraindications, or by an endovascular approach, if a proximal brain vessel occlusion is detected. As the efficacy of both therapies declines over time, every minute saved along the way will improve the patient&#39;s outcome.
This critical situation requires thorough work and precise communication with the patient, the family and colleagues from different professions to acquire all relevant information and reach the right decision while carefully monitoring the patient. This is a high fidelity situation. In nonmedical high-fidelity environments such as aviation, Crew Resource Management (CRM) is used to enhance safety and team efficiency.
This guide shows how a Stroke Team algorithm, which is transferable to other hospital settings, was established and how regular simulation-based trainings were performed. It requires determination and endurance to maintain these time-consuming simulation trainings on a regular basis over the course of time. However, the resulting improvement of team spirit and excellent door-to-needle times will benefit both the patients and the work environment in any hospital.
A dedicated Stroke Team of 7 persons who are notified 24/7 by a collective call via speed dial and run a binding algorithm that takes approximately 20 min, was established. To train everybody involved in this algorithm, a simulation-based team training for all new Stroke Team members was conceived and conducted at monthly intervals. This led to a relevant and sustained reduction of the mean door-to-needle time to 25 min, and enhanced the feeling of stroke readiness especially in junior doctors and nurses.

Every min counts in acute stroke care. This guide shows how to establish a Stroke Team algorithm and enhance its performance with regular simulation training. The principles of Crew Resource Management (CRM) facilitate a straight workflow, reduce door-to-needle times and increase staff satisfaction.

הגדרת שבץ אלגוריתם צוות וניצוח הדרכת סימולציה מבוססת בחדר המיון - מדריך מעשי

Time is of the essence when caring for an acute stroke patient. The ultimate goal is to restore blood flow to the ischemic brain. This can ...

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This compound is currently under investigation as a PET tracer for demyelination. We recently described a novel chemical reaction to produce metafluorinated pyridines consisting of direct fluorination of a pyridine N-oxide and the utilization of this reaction for the radiochemical synthesis of [18F]3F4AP. In this article, we demonstrate how to produce this tracer using an automated synthesizer and an in-house made flow hydrogenation reactor. We also show the standard quality control procedures performed before releasing the radiotracer for preclinical animal imaging studies. This semi-automated procedure may serve as the basis for future production of [18F]3F4AP for clinical studies.

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

We demonstrate the semi-automated radiochemical synthesis of [18F]3F4AP and quality control procedures.

אוטומטי סינתזה Radiochemical של [<sup22</sup&gt; F] 3F4AP: עוקב PET חדשנית עבור הדמיה מחלות Demyelinating

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

באמצעות הדמיה ברשתית ללמוד דמנציה

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...