משמעות הפרוטוקול מסתמכת על איתות ממברנה לגרעין ואינה משפיעה ישירות על הגנום, כמו במקרה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. האופי הלא טרטוגני של תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם הוא היתרון העיקרי של הטכניקה, מה שהופך אותו מתאים ליישום קליני בטוח בתחום שונים של רפואה רגנרטיבית. מדגים את ההליך הוא ד"ר אן קתרין שוט, מוביל הפרויקט, ו Oksana Greenacre, עוזר מעבדה במעבדה שלי.
כדי לבודד PBMNCs, להוסיף 25 מיליליטר של דם אחד על אחד מדולל עם PBS ל 10 מיליליטר של מדיה הדרגתית צפיפות צנטריפוגה את התערובת ב 300 פעמים G במשך 30 דקות. בודד את שכבת הממשק בין הפלזמה למדיה ההדרגתית של הצפיפות על-ידי צנרת. לשטוף את התאים המבודדים עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות.
לאחר חזרה על ההליך פעמיים, לספור את מספר התאים באמצעות תא ספירה. הוסף 6 על 10 לתאים המונונוקלאריים השישיים לצינור 15 מיליליטר, ולאחר מכן בצע חיבור צולב נוגדנים על ידי הוספת נוגדן ספציפי לחלבון ממברנה הקשור ל- GPI אנושי לתאים ב- PBS עם 1%BSA ודגרה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הקישור הצולב, החליפו את המדיום מדגירה במדיום Dulbecco של Iscove בתוספת 10% FBS.
לגדל את התאים ב 15 מיליליטר צינורות פוליסטירן על ידי הצבתם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 8 עד 10 ימים ללא רועד. ביום החמישי, להוסיף עוד אחד עד שני מיליליטר של מדיום Iscove בתוספת עם 10% FBS לכל צינור 15 מיליליטר. תספור את התאים בתרבית עם תא ספירה.
לאחר מכן צנטריפוגה השעיית התא של כ 5 על 10 עד 6 תאים ב 300 פעמים G במשך 10 דקות ולשאף את supernatant וכתוצאה מכך עם פיפטה פסטר סטרילי. resuspend גלולה התא ב 90 microliters של PBS מקורר מראש של pH 7.2 עם 0.5% BSA ושני EDTA מילימטרי. לאחר מכן להוסיף 80 מיקרוליטרים CD-45 חרוזים מגנטיים בגודל ננו חיוביים השעיית התא ודגרה על קרח במשך 15 דקות.
כדי לשטוף את התאים, להוסיף שני מיליליטר של חוצץ PBS צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. resuspend התאים ב 500 microliters של מאגר PBS. לשטוף את העמודה עם 500 microliters של חיץ PBS מקורר מראש ומניחים אותו בשדה המגנטי.
הנח את מתלה התא על העמודה ושטוף אותו פעמיים עם 500 מיקרוליטרים של מאגר PBS. לאסוף את התאים במדיום של Iscove בתוספת 1%BSA ולספור את התאים בתא הספירה. מניחים כיסויי זכוכית בצלחות ארבע בארות ומכסים אותם בפולי-ל-אורניתין מדולל ומים מזוקקים כפולים.
לאחר דגירה כיסויים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, לשטוף אותם עם מים מזוקקים כפולים. מפשירים לאט 0.5 עד 2 מיליגרם למיליליטר למינין ומוסיפים אותו לראש כיסויים. לדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ולאחר מכן להסיר למינין עודף על ידי pipetting ולהוסיף N2 בינוני עצבי למנות התרבות.
תרבית BD נגזר CD-45 תאים שליליים במדיום N2 על ציפוי זכוכית מצופה למינין במשך יומיים באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס ליזום בידול עצבי של תאים חדשים שנוצרו BD. לאחר מכן, תאי תרבות בבידול עצבי בינוני ומניחים את הלוחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 16 ימים. הכן קיבוע עם 75 מיליליטר של מים סטריליים וארבעה גרם של paraformaldehyde.
מוסיפים 10 נתרן הידרוקסיד רגיל לפי הצורך עם ערבוב עד הפתרון מתפנה. מוסיפים תערובת סוכרוז לתמיסה ומצפצף אותה ל- pH 7.4 עם שש חומצה הידרוכלורית רגילה. מביאים את הנפח ל-100 מיליליטר עם מים סטריליים.
לאחר הסרת מדיה מתרבית התא, לדגור אותו עם קיבוע לפני המלחמה במשך 15 דקות, ולאחר מכן להשליך את הקיבוע לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. הוסיפו מיד פתרון טרי של 0.3% טריטון-X וחדרו לתאים למשך חמש דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף פתרון חסימה של PBS ו-5%BSA.
לחסום את התאים בטמפרטורת החדר על צלחת רוקר במשך שעה אחת. הכן דילול מתאים של נוגדנים ב 1%BSA PBS ודגר את התאים עם הנוגדנים על צלחת רוקר במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף.
דגירה של התאים באמצעות DAPI והעלה את כיסויי השער עם מדיית הרכבה להדמיה במיקרוסקופ. ההיבט המורפולוגי של תאים D dederentiated נחקר בימים אחד, חמש, ו -10, מראה מגמה של היעלמות הדרגתית של תאים לא מופעלים ואוכלוסייה חדשה גדל בהתמדה של תאים בתרבית מופעלת. תאי BD מפוזרים היו קטנים והראו את המאפיינים של תאים אגרנוריים לא בוגרים עם פחות אברונים ונגרעינים גדולים עם כרומטין מרוכז הדומה ל- ESCs.
תאים נחקרו עבור הבחנה מחדש נוירו לאחר culturing במנות תרבות מצופה למינין במשך 30 ימים. כבר ארבעה ימים, ניתן היה לזהות את התאים העצביים הראשונים עם מבנים ארוכים להסתעפות. רוב התאים הכדוריים הקטנים התפתחו לתאים מוסעפים עם צורות מוארכות גדולות יותר, מה שמרמז על תהליך פעיל לקראת בידול לשושלות עצביות.
גוף התא ותהליכי התאים הראו מורכבות גבוהה יותר מאשר תאים לא מופרעים, והציג צפיפות גבוהה של רטיקולום אנדופלסמי מחוספס וחבילות של חוטי אקטין. תאים הגדלים במדיה בידול נוצרו לעתים קרובות קשרים בין תאים מעורבים בגוף התאי, בעוד שאחרים מעורבים בתהליכים תאיים בצורה דמוית נויריט. ניתוח אימונוכימיה שבוצע באמצעות נוגדנים ספציפיים אישר כי תאים dederentiated BD מסוגלים להבחין מחדש כלפי שושלות עצביות שונות, כולל אסטרוציטים GFAP.
טכניקה זו מאפשרת ליצור תאים לא טרטוגניים אוטולוגיים המסוגלים להבדיל מחדש לתאים של כל שלושת שכבת הנבט, ופותחים הזדמנות חדשה במחקר רפואה רגנרטיבית.
