המחברים מבקשים להודות NINDS, FightSMA, ומשפחות של SMA לתמיכה כספית. SEGL נתמך על ידי מענק # הכשרת NINDS 5T32NS077984-02.

כל הנהלים המפורטים בפרוטוקול אושרו מכון לשימוש בבעלי חיים ובועדה לטיפול (IACUC) מאוניברסיטת מדינת אוהיו. 1. הכנת סביבת העבודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף קרח רטוב כדי להרדים את גורי העכבר, כלוב ריק להפריד את הסכר מההמלטה, מיקרוסקופ לנתח, מקור אור שיכול להיות ממוקם בזווית להזרקה (שימוש במקור אור ב° 90 &#160; זווית על הזריקה מטשטשת את הווריד), משטח נקי למקום חי להזרקה, צמר גפן, 3/10 מזרק אינסולין סמ&quot;ק עם 3/8 &quot;30 מחט G (אחד לכל חיה) ו -1% אוונס הכחול צבע ( עשה עם מי מלח פוספט שנאגרו פתרון (PBS)) לאימונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסכר לכלוב נפרד בעוד מניפולציה הגורים. </li></ol> נוהל 2. הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח גור אחד ישירות על הקרח הרטוב במשך 30-60 שניות כדי להרדים את החיה. אל תשאיר tהוא חיה על זמן רב מדי קרח בשל סיכון לסיבוכים הקשורים היפותרמיה כוללים פרפור חדרים, היפוקסיה רקמות וחמצת מטבולית. הערה: הניסיון שלנו הוא ש30-60 שניות היא מספיק כדי להאט את תנועות הגור כדי לאפשר להזרקה. אם נדרש הרדמה עמוקה יותר, שאיפה כגון isoflurane 1-2% עשויה להיות מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד החיה על קרח, לטעון את המזרק עם 30 μl של צבע הכחול אוונס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר בעלי החיים הוא בהרדמה מלאה, שאושר על ידי חוסר התנועה על הקרח בזמן שעדיין נושם, להעביר אותו מתחת למיקרוסקופ. להזרקה ימנית, ולהתמודד עם לועו של בעל החיים לצד ימין. הנח את האצבע שמאלה על הלוע וזנב האצבע אמצעית משמאל לניצן האוזן כך שניצן האוזן הוא בין האצבע ואמה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון רק קדמי לניצן האוזן לנימים שטחיות שזז כאשר העור הוא מניפולציה. נימים זה לא היעד, אולםזיהוי הוא חשוב לזיהוי וריד זמני. בשלב הבא, אתר וריד כהה, צללים נחותים הנימים שנשארה קבוע, ללא קשר לעמדת עור. הווריד הזמני מופיע צללים, פועל גב אל הגחון, והזנות לוריד הצוואר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הווריד הזמני עם השיפוע עד המחט. אם הוכנס בצורה נכונה, ניתן להציג את זווית הטית המחט להתמלא בדם דרך העור. ואז לוחץ על המתג לאט ופתק לבן לווריד בצד של הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את המחט להישאר בווריד לשניות 10-15 הוסיפו כדי למנוע זרימה חוזרת של injectant. </li></ol> 3. לאחר הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה נכונה, הגור צריך להפוך לכחול באופן כמעט מיידי. הסר את המחט ולהשתמש בכוח עדין ליישם מקלון צמר גפן לזריקה עד שקרישי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג הגור לסימני מצוקה. לאפשר דקות הגור 2-3 להתאושש ולחמם, recognize כאשר הגור הוא בהכרה, זקוף ומרגש, לפני ההחזרה לכלוב. גביע הגורים בידיים בכפפות של החוקר כדי לספק חום מתאים כדי לסייע בהחלמה במידת צורך. לחלופין, הנח כרית חימום מתחת לכלוב בבית כדי להקל על התחממות הגור מוזרק. בדרך כלל לאחר הזרקת צבע הכחול אוונס, להרדים גורים. אינו כולל צבע כאשר הזרקת חומר למבחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הגור בחזרה לכלוב בבית ולהבטיח את הגור מצופה מצעים ו / או nestlet כדי להבטיח reacceptance על ידי הסכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק חדש וקלון צמר גפן לכל גור לשמור על סטריליות. </li></ol>

<ol>
	<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nature. 27, 59-65 (2009).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+scAAV9+delivery+of+a+codon-optimized+SMN1+sequence+rescues+SMA+mice.">Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice.</a> Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).</li><li>Rahim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+AAV2/9+to+the+fetal+and+neonatal+mouse+leads+to+differential+targeting+of+CNS+cell+types+and+extensive+transduction+of+the+nervous+system.">Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+spinal+muscular+atrophy+phenotype+in+a+mouse+model+by+early+postnatal+delivery+of+SMN.">Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN.</a> Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).</li><li>Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV-9+transduction+in+mice+is+influenced+by+animal+age+but+not+by+the+route+of+administration.">Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration.</a> Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).</li><li>Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+transfer+into+the+CNS+across+the+BBB+after+neonatal+systemic+delivery+of+single-stranded+AAV+vectors.">Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors.</a> Brain research. 1389, 19-26 (2011).</li><li>Porensky, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+morpholino+antisense+oligomer+rescues+spinal+muscular+atrophy+in+mouse.">A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse.</a> Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+neonatal+intravascular+injections:+modeling+newborn+disease.">Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(ICV)+and+intravenous+(IV)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J. vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sands, M. S., Barker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+intravenous+injection+in+neonatal+mice.">Percutaneous intravenous injection in neonatal mice.</a> Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).</li><li>Bevan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+heart+failure+in+the+SMNDelta7+model+of+spinal+muscular+atrophy+and+correction+by+postnatal+scAAV9-SMN+delivery.">Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery.</a> Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).</li><li>Valori, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+scAAV9+expressing+SMN+prolongs+survival+in+a+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy.</a> Science translational medicine. 2, (2010).</li><li>Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+intraperitoneal+or+intravenous+injections+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+8+transduce+dorsal+root+ganglia+and+lower+motor+neurons.">Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons.</a> Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).</li><li>Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaucher+disease.">Gaucher disease.</a> Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).</li><li>Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+gene+transfer+leads+to+widespread+correction+of+pathology+in+a+murine+model+of+lysosomal+storage+disease.">Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).</li><li>Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+systemic+clinical+disease+in+MPS+VII+mice+following+AAV-mediated+neonatal+gene+transfer.">Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer.</a> Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juvenile+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.">Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).</li><li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bardet-Biedl+syndrome.">Bardet-Biedl syndrome.</a> European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).</li><li>Bevan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+in+large+species+for+targeting+spinal+cord,+brain,+and+peripheral+tissues+for+pediatric+disorders.">Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders.</a> Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li><li>Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neonatal+blood-brain+barrier+is+functionally+effective,+and+immaturity+does+not+explain+differential+targeting+of+AAV9.">The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9.</a> Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS.">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

משלוח תוך-סוכנים למערכת העצבים המרכזית או בכל הגוף קשה במודלים עכבריים יילודים של מחלה. הפרוטוקול המתואר הוא דרך מהירה, יחסית לא פולשנית לניהול לוריד פתרונות לעכברי יילודים עם דרישות ציוד מינימליות. למרות וריד הפנים הזמני ניתן לראות בעין בלתי מזוינת, ייתכן שיש לי זר?...

משלוח תרופות למערכת העצבים המרכזי (CNS) במודלים עכבריים למחלת ילדים עדיין מהווה אתגר. עכברים שמצבי מחלה שזה עתה נולדו מודל הם גוץ והתפתחותית בשלה, ולכן יכול להיות קשה להזריק ישירות במבנים מתאימים בתוך מערכת העצבים המרכזית. הזרקה תוך-של סוכנים טיפוליים היא שיטה לא פולשנית, נסבלת היטב כדי לספק תאים, תרופות, או וקטורים ויראליים לכל הגוף כולל מערכת העצבים המרכזית ו1-5 3,5-9 רשתית. פרסומים קודמים לתאר הזרקת פנים וריד זמנית באמצעות transilluminator 10,11, ללא מיקרוסקופ לנתיחה 11,12, או דורשים שני אנשים להזריק 10. טכניקת ההזרקה תוארה בפרוטוקול זה יש יתרון משום שאדם אחד יכול להזריק גורים, ומקור האור כדי לראות את הווריד הזמני לא נוגע בגור, ומבטל את הצורך בפלסטר או הקובץ המצורף של גור למשטח קבועכגון transilluminator 11. משלוח של סוג adeno הקשורים וקטור ויראלי 9 (AAV9) בעכברים מייצר ביטוי חזק בתאי עצב והאסטרוציטים ברחבי המוח וחוט השדרה (איור 1). משלוח תוך-של וקטורים ויראליים לוריד פנים הזמני השטחי נעשה שימוש באופן אמין במחקרים שונים בעכברים בילוד לטיפול בהפרעה עצבית-שרירית בילדים בעמוד השדרה שרירים ניוון (SMA) 2,4,13,14 וסופו של דבר הגדיל את תוחלת החיים של עכברים שטופלו. הזרקה תוך-של עכברים בילוד המטרה גם ביעילות מערכת עצבים ההיקפית ואיברים היקפיים (איור 2). בעקבות הזרקה של AAV, התמרה של גרעיני שורש הגבי, כבד, לב, שריר שלד, ריאות, ומקלעת myenteric של המעי נצפתה 1,3,6,7,15. התמרה נרחבת של מערכת העצבים המרכזית והפריפריה גורמת שיטה זו של אידאל הזרקה לטיפול במחלות הדורשות ביטוי הגלובלי שלtransgene, כגון המחלות של מחלת גושה 16 ואחסון lysosomal האחר 17,18, מחלת באטן וlipofuscinoses ceroid העצבי קשור, 19 ותסמונת Bardet-Biedl, הפרעה רבה מערכתית גנטית עם הופעת תסמינים המתרחשים בילדות המוקדמת 20. גם הזרקה תוך-לעכברים בילוד צריכה להיחשב כשיטת חדשנית למחלות ילדים מערכתיות דוגמנות. טכניקה זו תורגמה למודלים של בעלי חיים גדולים יותר 5,21 והזרקה תוך-כבר קיים כשיטת קלינית מקובלת של מתן תרופות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה, יעילה של אספקת סוכנים לעכברים בילוד דרך וריד הפנים זמניים השטחי, לא יאוחר מיום הזרקת 2. לאחר לידה יכולה להסתיים באחת, התאמן פרט ונסבל היטב על ידי שני הגורים והסכרים. גורים חווים מצוקה מינימאלית ולהתאושש במהירות. Importantly, זריקה מוצלחת תביא לאספקה ​​הגלובלית של הסוכן מנוהל. פרוטוקול זה מתאים למשלוח של וקטורים ויראליים, סוכנים או תאי תרופות לעכברים שזה עתה נולד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:188px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thinpro Insulin Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Terumo</td>
			<td>SS30M3009</td>
			<td style="width:188px;">3/10cc, 3/8&#34; needle, 30G, 1 per mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Evans Blue Dye</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2129</td>
			<td style="width:188px;">Dilute to 1% with 1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fiber Optic Light Source&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12-562-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous injections in neonatal mice

הזרקה תוך ורידית היא אופן קליני רלוונטי כדי לספק תרופות. מכרסמים מבוגרים ובעלי חיים גדולים יותר, זריקות תוך-ורידית הן אפשריים מבחינה טכנית ושגרתיות. עם זאת, בחלק מדגמי העכבר יכול להיות התחלה מוקדמת של מחלה עם התקדמות מהירה שעושה ממשל של טיפולים פוטנציאליים קשה. הווריד הזמני (או פנים) הוא רק קדמי לניצן האוזן בעכברים והוא נראה בבירור ביומיים הראשונים שלאחר לידה בכל צד של הראש באמצעות מיקרוסקופ לנתח. במהלך חלון זה, הווריד הזמני יכול להיות מוזרק בנפחים של עד 50 μl. הזריקה היא בטוחה ונסבל היטב על ידי שני הגורים והסכרים. הליך הזרקה טיפוסי יושלם בתוך 1-2 דקות, לאחר שהגור חוזר לכלוב בבית. מהיום ליום שלאחר הלידה השלישי הווריד קשה לדמיין והליך ההזרקה הופך מבחינה טכנית לא אמין. טכניקה זו הייתה בשימוש למסירה של vect וירוס adeno הקשורים (AAV)ORS, אשר בתורו יכול לספק, ביטוי transgene יציב כמעט גוף-רחב לחייו של בעל החיים בהתאם לסרוטיפ הנגיפי נבחר.

במהלך הזרקה נכונה, הווריד לרגע להפוך, או לחלוט ברורים. אם הזרקה לצבוע כל הגור צריך להפוך לכחול בתוך שניות. אם הזרקה לא תקינה התרחשה, לעתים קרובות יש בולוס תת עורי מרוכז בראש או בצוואר וinjectant עלול לדלוף מאתר ההזרקה. זריקות לא נכונה יכולות גם לגרום להופעה של שטפי דם בצווא?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravenous Injections in Neonatal Mice at JoVE.com

Intravenous Injections in Neonatal Mice

מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עתה נולדו בתוך שני הימים לאחר הלידה הראשונה של חיים.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Research

JoVE Journal

Biology

57.9K Views.  Ohio State University.  מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עת?...

Video: Intravenous Injections in Neonatal Mice

Transverse Aortic Constriction in Mice

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart failure.1 TAC initially leads to compensated hypertrophy of the heart, which often is associated with a temporary enhancement of cardiac contractility. Over time, however, the response to the chronic hemodynamic overload becomes maladaptive, resulting in cardiac dilatation and heart failure.2 The murine TAC model was first validated by Rockman et al.1, and has since been extensively used as a valuable tool to mimic human cardiovascular diseases and elucidate fundamental signaling processes involved in the cardiac hypertrophic response and heart failure development. When compared to other experimental models of heart failure, such as complete occlusion of the left anterior descending (LAD) coronary artery, TAC provides a more reproducible model of cardiac hypertrophy and a more gradual time course in the development of heart failure. Here, we describe a step-by-step procedure to perform surgical TAC in mice. To determine the level of pressure overload produced by the aortic ligation, a high frequency Doppler probe is used to measure the ratio between blood flow velocities in the right and left carotid arteries.3, 4 With surgical survival rates of 80-90%, transverse aortic banding is an effective technique of inducing left ventricular hypertrophy and heart failure in mice.

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model to study mechanisms underlying cardiac hypertrophy and heart failure development. Here, we describe procedures to constrict the aorta to create a reproducible degree of cardiac hypertrophy in mice.

אבי העורקים צמצום רוחבי של עכברים

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart ...

Ambulatory ECG Recording in Mice

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although the surface ECG is utilized for short-term measurements of waveform intervals, it is not practical for long-term studies of heart rate variability or the capture of rare episodes of arrhythmias. Implantable ECG telemeters offer the advantages of simple surgical implantation, long-term recording of electrograms in ambulatory mice, and scalability with simultaneous recordings of multiple animals. Here, we present a step-by-step guide to the implantation of telemeters for ambulatory ECG recording in mice. Careful adherence to aseptic technique is required for favorable survival results with the possibility of implantation and recording from weeks to months. Thus, implantable ECG telemetry is a valuable tool for detection of critical information on cardiac electrophysiology in ambulatory animal models such as the mouse. 

Telemetric ECG has emerged as an essential tool in evaluating animal models for cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Here, we present a stepwise guide to telemetric ECG recordings for application in long-term ambulatory ECG monitoring in mice.

רישום א.ק.ג. אמבולטורי ב עכברים

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

בVivo siRNA Transfection וג&#39;ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Inducing Apical Periodontitis in Mice

The mechanisms involved in local induced inflammation can be studied using several available animal models. One of these is the induction of apical periodontitis (AP). Apical periodontitis is a common pathology of an inflammatory nature in the periodontal tissues surrounding the tooth root. In order to better understand the nature and mechanism of this pathology it is advantageous to perform the procedure in mice. The induction of this odontogenic inflammation is achieved by drilling into the mouse tooth until the dental pulp is exposed. Next, the tooth pulp remains exposed to be contaminated by the natural oral flora over time, causing apical periodontitis. After this time period, the animal is sacrificed, and the tooth and the jaw bone can be analyzed in various ways. Typical analyses include micro-CT imaging (to evaluate bone resorption), histological staining, immunohistochemistry, and RNA expression. This protocol is useful for research in the field of oral biology to better understand this inflammatory process in an in vivo experimental setting with uniform conditions. The procedure requires a careful handling of the mice and the isolated jaw, and a visual demonstration of the technique is useful. All technical aspects of the procedures leading to induced apical periodontitis and its characterization in a mouse model are demonstrated.

Here, we present a protocol to locally induce apical periodontitis in mice. We show how to drill a hole in the mouse&#39;s tooth and expose its pulp, in order to cause local inflammation. Analysis methods to investigate the nature of this inflammation, such as micro-CT and histology, are also demonstrated.

לגרימת חניכיים הרשמי בעכברים

The mechanisms involved in local induced inflammation can be studied using several available animal models. One of these is the induction of apical ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a metachronal, synchronal fashion, these multiple, motile, actin-based organelles generate a cephalad fluid flow clearing the respiratory tract of inhaled pollutants and pathogens. With increasing environmental pollution, novel viral pathogens and emerging multi-drug resistant bacteria, cilia generated mucociliary clearance (MCC) is essential for maintaining lung health. MCC is also depressed in multiple congenital disorders like primary ciliary dyskinesia, cystic fibrosis as well as acquired disorders like chronic obstructive pulmonary disease. All these disorders have established, in some case multiple, mouse models. In this publication, we detail a method using a small amount of radioactivity and dual-modality SPECT/CT imaging to accurately and reproducibly measure MCC in mice in vivo. The method allows for recovery of mice after imaging, making serial measurements possible, and testing potential therapeutics longitudinally over time. The data in wild-type mice demonstrates the reproducibility of the MCC measurement as long as adequate attention to detail is paid, and the protocol strictly adhered to.

In this publication, we describe protocols for assessing airway mucociliary clearance (MCC) in mice in vivo utilizing dual-modality radionuclide imaging. This protocol is designed for a single photon emission computed tomography (SPECT) and computed tomography (CT) acquisition protocol using mouse whole body (MWB) collimators in a dual SPECT/CT system.

In vivo הערכה של אישור Mucociliary בעכברים

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

Terminal H-reflex Measurements in Mice

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits after injuries such as spinal cord damage or stroke. An increase of the H-reflex response, together with symptoms like non-voluntary muscle contractions, pathologically augmented stretch reflex, and hypertonia in the corresponding muscle, is an indicator of post-stroke spasticity (PSS).
In contrast to rather nerve-unspecific transcutaneous measurements, here, we present a protocol to quantify the H-reflex directly at the ulnar and median nerves of the forepaw, which is applicable, with minor modifications, to the tibial and sciatic nerve of the hindpaw. Based on the direct stimulation and the adaptation to different nerves, the method represents a reliable and versatile tool to validate electrophysiological changes in spasticity-related disease models.

The clinical evaluation of spasticity based on the Hoffmann reflex (H-reflex) and using electrical stimulation of peripheral nerves is an established method. Here, we provide a protocol for a terminal and direct nerve stimulation for H-reflex quantification in the mouse forepaw.

מדידות רפלקס H טרמינלי בעכברים

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits ...