ביופסיות עור מחולים פסוריאזיס נמסרו באדיבות על ידי ד&quot;ר אנדראס Koerber (המחלקה לדרמטולוגיה באוניברסיטת אסן, גרמניה) לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי. XH נתמכת גם על ידי NSFC 61263039 ו NSFC 11,101,321.

הערה: עור ביופסיות מיחידים בריאים התקבלו שאריות עור בטן של אנשים שעברו ניתוחים פלסטיים אלקטיבי לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי. שימוש עור אנושי אושרה ובהתאם לתקנות שקבעו הוועדות האתיות הרפואיות למחקר האדם של המרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud, ניימיכן, הולנד אונ&#39; אסן, גרמניה. 1. הכנת תרחיפים תא יחיד מעור אדם (עבודה סטרילית בתוך ארון-Flow אם תרבית תאים לאחר נדרש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבית תאים: RPMI 1640 + פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי 100 יחידות / מ&quot;ל ​​ו 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה) + פירובט (0.02 מ&quot;מ) ו Glutamax (0.02 מ&quot;מ), ללא בסרום הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני תרבות שלם: בינוני התרבות מוכן בשלב 1.1 + 10% בסרום נקווה אדם (HPS); לאחסן ב 4 ° C.. תביאו בינוני עד 20 ° C ± 2 לפנינוing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ביופסיה של העור באמצעות מכשיר ביופסיה סיבוב 4 מ&quot;מ ולשמור אותו במדיום תרבות שלמה RPMI1640 ב 20 ° C ± 2 עד 4 שעות או 4 ° C ON. לעבד הביופסיה בהקדם האפשרי עם ההגעה במעבדה. הערה: ארוכה יותר אחסון של עור ישפיע על תשואת התא כדאי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל צינור דיסוציאציה כחול הכתיר ולהוסיף 5 מ&quot;ל בינוני תרבות שלמה לתוך הצינור שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום תרבות שלמה לבאר כל (ב 3 בארות בסך הכל) של צלחת תרבות 6-גם סטרילי. השתמש בכלים סטריליים להציב הביופסיה לתוך באר אחת, לשטוף, תזיז אותה אל באר שני וחזור על שלב זה עוד פעם אחת, ובכך להשיג סכום כולל של שלוש שטיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביופסיה של העור שטוף היטב את צלחת פטרי סטרילית, להוסיף 100 μl של המדיום תרבות שלמה על החלק העליון של ביופסיה, ובזהירות לגרד רקמת שומן תת עורי באמצעות אזמל סטרילי חד פעמי נירוסטה. הערה: Thהוא הוא שלב קריטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כל ביופסיה של עור ל -4 חתיכות קטנות על צלחת פטרי סטרילית. דגימות העברה (עד ארבעה 4 ביופסיות מ&quot;מ לכל צינור) אל הצינור דיסוציאציה מוכן המכיל 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבשר ומהדקים את הצינורות עם כובע, ולצרף במהופך לשרוול של Dissociator רקמות אוטומטיות. ודא כי כל חומר המדגם ממוקם באזור של הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את תהליך הניתוק ידי ההפעלה &quot;תכנית m_spleen _01&quot; (תכנית מוגדרת מראש שמספקת בזיכרון הפנימי של המכשיר או על ידי כרטיס התכנית המלווה) כדי לנתק את הביופסיה במהירות הסיבוב המתאימה 56 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיבוד, לנתק את הצינור דיסוציאציה מן Dissociator ולוודא שכל החומר ניתק נאסף בתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl collagenase IA (80 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתוך הצינור דיסוציאציה דגירה המדגם באמבט מים רועד ב 37° צלזיוס למשך 60 דקות. הוספת 100 μl של DNase אני (5 MU / מ&quot;ל) לתוך צינור thedissociation, ומערבבים היטב. הערה: ריכוז גבוה של collagenase או זמן הדגירה כבר תשנה כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הצינור דיסוציאציה לשרוול של Dissociator הרקמות האוטומטיות ולהפעיל את &quot;_01 טחול תכנית m_&quot; כדי לנתק את הביופסיה עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר על גבי צינור פלקון 50 מ&quot;ל. החל חומר המדגם ניתק מסננת תא זה כדי להסיר גושי תא / פסולת רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מסננת תא פעם אחת עם 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות שלמה. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 10 דקות ו supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב הכביסה עוד פעם אחת. Resuspend כדורי תא 300 μl של מדיום תרבות השלם. המתלים תא יחיד מוכנים לניתוח נוסף; להמשיך עם פרוטוקולי תרבית תאי vivo לשעבר או ניתוח תזרים cytometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של i הנוספתמכתים ציטוקינים ntracellular, לעורר תאים עם PMA (12.5 ng / ml), ionomycin (500 ng / ml) ו Brefeldine A (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 4 שעות לפני ביצוע זרימת ניתוח cytometry. </li></ol> 2. הפעלת Polyclonal של תאי T עור-Resident (תרבית תאי Ex Vivo) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 100 תא בודד השעיות μl (מוכן בשלב 1.15) לתוך צלחת 96-היטב מסביב לתחתית. הערה: לכל אחד מ -4 מ&quot;מ ביופסיה של העור, השעיות תא בודד רכשה ניתן לפצל לפחות שתי בארות של צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 מב-מצופה (25,000 חרוזים לכל טוב), ציטוקינים אנושי רקומביננטי RIL-2 (הריכוז הסופי 25 U / ml) ו RIL-1β (מ&quot;ל / הריכוז הסופי 50 נ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת תרבות עם מכסה צלחת גם שכותרתו, דגירה 5% CO 2, 100% לחות, 37 ° C חממה. שנה בינונית כאשר הצבע הבינוני פונה צהוב. <br/&gt; הערה: מושבת תא ברורה ניתן להבחין בין יום 8 של תרבית תאים. </li></ol> 3. ניתוח cytometry זרימה של הראשים / עור-Resident בתרבית תאי T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ FACS: PBS + 0.2% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר תאי עניין לתוך צלחת 96-גם נ-תחתון. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100 μl של PBS. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים עם 100 μl של eFluorescence780 מוכן מצומדות צבע הכדאיות ניתן לתקן (1: דילול 1,000 באמצעות PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הוספת 100 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מבז סמן פני התא הנדרש, למשל: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388.2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), ואת CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), להכין את התערובת מהבזה באמצעות חיץ FACS על פי כל גורם לדילול מב נבדק. לקבוע את גדרות שער באמצעות שליטה אלוטיפ של נוגדן יחד עם מדגם לא כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של מבז-תערובת מוכנה לבאר כל אחד. דגירה 20 דק &#39;ב 20 ° C ± 2, להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות שרק דורשים מכתים פני התא, המשך לסעיף 3.16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של מכתים Foxp3 תוך תאי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן קיבעון חיץ permeabilization ידי ערבוב חלק אחד של תרכיז עם 3 חלקים של מדלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ permeabilization 1x: 1 חלק 10x permeabilization חיץ + 9 חלקים של H 2 O. לעקר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי Resuspend ב 100 μl של קיבעון permeabiliחיץ zation, ומערבבים היטב, דגירה על 4 ° C למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 חיץ permeabilization μl היטב כל, צנטריפוגות ב 450 XG ב RT במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם חיץ permeabilization עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נדרש מבז תאיים, למשל, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) ו IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). מכין את התערובת מהבזה באמצעות חיץ permeabilization המכיל סרום עכברוש נורמלי 2% על פי כל גורם לדילול מב נבדק. לקבוע את גדרות שער באמצעות שליטה אלוטיפ של נוגדן יחד עם מדגם לא כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מב-תערובת מוכנה לבאר כל אחד. לדגור על 4 ° C למשך 30 דקות, להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות דגירה, להוסיף 100 μl של חיץ permeabilization לבאר כל אחד. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם permeabilization buffer עוד פעם אחת. Resuspend גלולה ב 110 μl של חיץ FACS, השעיות תא העברה לתוך צינור microFACS. הערה: Sample מוכן למדידה באמצעות 10 צבעים cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של מספר סלולארי מדויק הנדרש, להוסיף 10 μl של השעיה אחידה מוּרבָּך של fluorospheres לתוך מדגם זה מייד לפני ביצוע מדידות באמצעות cytometry זרימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vast+majority+of+CLA++T+cells+are+resident+in+normal+skin.">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li><li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c+BDCA-1++dendritic+cells+and+CD163+FXIIIA++macrophages.">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li><li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus.">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li><li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha.">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li><li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis.">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8++T(RM)+cells+providing+global+skin+immunity.">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li><li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1++dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody.">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li><li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans.">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+(AEB071)+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production.">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin.">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li><li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin.">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li><li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17.">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li><li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li><li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-infiltrating+CD8++T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions.">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאי T תושב העור ביעילות ביופסיות עור האדם. היתרון של פרוטוקול זה הוא הבידוד של מספרים גבוהים יחסית של לימפוציטים קיימא, מבקש להביע סמני משטח רלוונטיים. תת תא מזוהה היו: CD11c + DCS, CD4 + ו- CD8 + T תאים Foxp3 + CD25 + תאים. חשו...

העור, כממשק העיקרי בין הגוף לסביבה, מספקת את קו ההגנה הראשון נגד פיזי חיצוני, כימיים ועלבונות ביולוגיים כגון פציעה, קרינה אולטרה סגולה ו מיקרואורגניזמים. העור מורכב משני תאים העיקרי, האפידרמיס הדרמיס, ומכיל מגוון של תאי מערכת החיסון כולל תאי לנגרהנס, מקרופאגים, תאים דנדריטים (DCS), וכ -20 מיליארד תאי זיכרון T, כמעט פי שניים בהווה מספר בהיקף הדם כולו 1 , 2. גוף גדל והולך של נתונים תומך ברעיון כי העור יש פונקציות חיסוניות חיוניות, הן במהלך הומאוסטזיס רקמות במצבים פתולוגיים שונים. תאים חיסוניים תושב בעור רגיל נחשבים לנהל immunosurveillance 3 הוכחו לשחק תפקיד בהתפתחות של מחלות דלקתיות כגון פסוריאזיס 4. בשנת העור lesional פסוריאטית, הן CD4 + ו- CD8 + הסתננו תאי T היו observed וזה היה הראה כי היחס בין CD4 ו- CD8 משתנה בהתאם למצב המחלה 5. עם זאת, אוכלוסיות אלה של תאים שקשה ללמוד בגלל הטכניקות הקיימות לאפשר בידוד של תאים בודדים בלבד. הטכניקות בשימוש כיום נרחב עבור בידוד תא T מעור אדם לשלב ניתוק העור מכני עם טיפול אנזימטי. ביופסיות עור אדם הם טחונים בהרחבה וטופחו עם אנזימים כמו טריפסין, collagenase ו / או EDTA 6-8. עור בהתחשב בכך הוא רקם מחסום אשר עמיד מאוד לכוחות מתיחת חלוקה מכאנית, השיטות הוקמו של בידוד תא T המיוצר בתאים מעט מאוד, ואפילו מספרים נמוכים יותר של תאי קיימא, מה שהופך תרבות vivo לשעבר לתא של אוכלוסיות תאים אלה קשים מאתגר. כאן אנו מדווחים על שיטה שונה לבודד לימפוציטים הן מעור אדם פסוריאטית בריא מעורב ידי שילוב mechanדיסוציאציה iCal של העור באמצעות Dissociator רקמות אוטומטיות במקום השיטה הוקמה ממינסינג בהרחבה, יחד עם עיכול אנזימטי באמצעות collagenase. תת תא חיסון קיימא שונה כולל DCs ותאי T נצפו לאחר הכנת השעית תא בודד. חשוב לציין את הביטוי של סמני המשטח CD3, CD4 ו CD8 השתמר היטב. תאים ובכך מוכן, מוכנים לשימוש בתרביות תאים vivo לשעבר או ניתוח תזרים cytometric. פרוטוקול זה הועסק בהצלחה לניתוח ביופסיות עור יחידות (4 מ&quot;מ) נגזרות עור lesional של חולי פסוריאזיס. תוצאות המחקר הראו כי תושב העור המטופל בתאי T מיוצר יותר ציטוקינים דלקתיים כמו IL-17 ו IFNγ בהשוואה למתנדבים בריאים 9.

<table><tbody><tr><td>Disposable Biopsy Punch</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpels</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tube</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Blue-capped, used as the dissociation tube.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Automated tissue dissociator. Using the &quot;program spleen_01&quot; for dissociation of the skin biopsy.</td></tr><tr><td>Cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &amp;micro;m nylon</td></tr><tr><td>96-well U-bottom plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Human Pooled Serum (HPS)</td><td>in house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Type 1-A, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000</td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Diluent</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Mouse anti-human CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>Clone: HI30; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-human CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone: TUK4; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-human CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone: MOC-1; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mouse anti-human CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.</td></tr><tr><td>PC5.5 Mouse anti-human CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone: BU15; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-human CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone: B9.11; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clone: J3-119; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone: BC96; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PE Rat anti-human CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone: HECA-452; dilution factor 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Rat anti-human Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorospheres</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Counting beads, for flow cytometry</td></tr></tbody></table>

lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture

יש עור אדם תפקיד מחסום חשוב ומכיל תאים חיסוניים שונים שתורמים הומאוסטזיס רקמות והגנה מפני פתוגנים. כפי שהעור הוא יחסית קל לגשת, הוא מספק פלטפורמה אידיאלית ללמוד מנגנוני ויסות היקפיים חיסוניים. תאי תושב חיסון immunosurveillance התנהגות עור הבריא, אלא גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של מחלות עור דלקתיות, כגון פסוריאזיס. למרות תובנות מתעוררים, הבנתנו את הביולוגיה שבבסיס מחלות עור שונות דלקתי עדיין מוגבלת. יש צורך באיכות טובה (יחיד) אוכלוסיות תאים שבודדו דגימות עור ביופסיה. עד כה, נהלי בידוד כבר הקשו ברצינות על ידי חוסר קבלת מספר מספיק של תאי קיימא. בידוד לניתוח שלאחר מכן גם הושפעו אובדן סמני שושלת תא חיסון, בשל הלחץ המכאני וכימיות נגרם על ידי נהלי דיסוציאציה הנוכחיים להשיגהשעית תא בודדת. כאן, אנו מתארים שיטה שונה כדי לבודד תאי T משני בריא מעורב עור אנושי פסוריאטית ידי שילוב דיסוציאציה עור מכאני באמצעות Dissociator רקמות אוטומטי וטיפול collagenase. מתודולוגיה זו שומרת ביטוי של סמני שושלת החיסוניים ביותר כגון CD4, CD8, Foxp3 ו CD11c רק בעת הכנה של השעיות תא בודדות. דוגמאות של בידוד תא מוצלח CD4 + T ו פנוטיפי עתידי אנליזה פונקציונלית מוצגות.

הפרוטוקול המובא כאן יניב בין 2,200 ± 615 (ממוצע ± SEM, עור של מתנדבים בריאים) עד 178,000 ± 760 (ממוצע ± SEM, עור lesional של חולי פסוריאזיס) לימפוציטים קיימא מעור אדם בעת שימוש ביופסיה של עור יחידה 4 מ&quot;מ. סוגים שונים של CD45 + תאים אותרו תא בודד ה...

Watch this Scientific Journal Video about Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture at JoVE.com

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

lymphocyte-isolation-from-human-skin-for-phenotypic-analysis-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

14.5K Views.  Radboud University Medical Centre. We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Video: Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Genetics

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Developmental Biology

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Medicine

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

בידוד תאי אנדותל מנימי לימפה עורית מורין

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

מחבר זרקור: בידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל לימפה עורית מורין

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה