Hautbiopsien von Patienten mit Psoriasis wurden freundlicherweise von Dr. Andreas Koerber (Dermatologie-Abteilung an der Universität Essen, Deutschland) nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke zur Verfügung gestellt. XH wird auch durch NSFC 61263039 und 11101321 NSFC unterstützt.

HINWEIS: Hautbiopsien von gesunden Personen aus Bauchhaut Überbleibsel von Individuen erhalten wurden elektiven plastische Chirurgie nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke. Die Verwendung menschlicher Haut wurde genehmigt und in Übereinstimmung mit den gesetzten Regeln von der medizinischen Ethikkommission für Humanforschung der Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande und Universität Essen, Deutschland. 1. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus der menschlichen Haut (Work Sterile in einem Fluss Schrank wenn Nachfolgende Zellkultur ist erforderlich) <ol><li> Bereiten Zellkulturmedium: RPMI 1640 + Penicillin / Streptomycin (endgültige Konzentration 100 Einheiten / ml und 100 ug / ml, jeweils) + Pyruvat (0,02 mM) und Glutamax (0,02 mM) ohne Serum zugesetzt. </li><li> Bereiten komplette Kulturmedium: Kulturmedium, hergestellt in Schritt 1.1 + 10% humanes Serumsammel (HPS); Lagerung bei 4 ° C. Bringen Medium auf 20 ° C ± 2 vor unsing. </li><li> Besorgen Sie sich die Hautbiopsie eine 4mm lang Biopsie Punch Instrument und halten Sie es in RPMI1640 komplettem Kulturmedium bei 20 ° C ± 2 für bis zu 4 Stunden oder bei 4 ° C an. Verarbeiten Sie die Biopsie so schnell wie möglich bei der Ankunft im Labor. HINWEIS: Eine längere Lagerung der Haut wird die Zellausbeute und die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen. </li><li> Beschriften Sie eine blau-capped Dissoziation Rohr und mit 5 ml komplettem Kulturmedium in das markierte Rohr. </li><li> 2 ml komplettem Kulturmedium in jede Vertiefung (insgesamt 3 wells) einer sterilen 6-well-Kulturplatte. Verwenden Sie sterile Werkzeuge, um die Biopsie in einem einzigen gut zu platzieren, spülen, verschieben Sie es zu einem zweiten weit über und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, also insgesamt drei Spülungen zu erreichen. </li><li> Übertragen Sie die gut gespült Hautbiopsie in eine sterile Petrischale, 100 &amp; mgr; l komplettem Kulturmedium auf der Oberseite der Biopsie und vorsichtig abkratzen das subkutane Fettgewebe mit einem Edelstahl-sterilen Einweg-Skalpell ab. HINWEIS: Thist, ist ein kritischer Schritt. </li><li> Schneiden Sie jede Hautbiopsie in 4 kleinere Stücke auf einer sterilen Petrischale. Transfer-Proben (bis zu vier von 4 mm Biopsien pro Röhrchen) auf die vorbereitete Dissoziation Röhrchen mit 5 ml komplettem Kulturmedium. </li><li> dicht schließen die Rohre mit der Kappe, und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator. Stellen Sie sicher, dass alle Probenmaterial in dem Bereich des Rotors befindet. </li><li> Starten Sie den Dissoziationsprozeß durch das &quot;Programm m_spleen _01&quot; läuft (ein vordefiniertes Programm zur Verfügung gestellt von den internen Speicher des Instruments oder durch die Begleitung Programmkarte), um die Biopsie bei der entsprechenden Drehzahl für 56 Sekunden zu distanzieren. </li><li> Nach der Bearbeitung lösen sich von der Dissociator die Dissoziation Rohr und stellen Sie sicher, dass alle das dissoziierte Material am Boden des Rohres gesammelt wird. </li><li> In 150 ul Kollagenase IA (80 mg / ml) in den Spaltrohr und Inkubation der Probe in einem geschüttelten Wasserbad bei 37° C für 60 min. 100 l DNase I (5 MU / ml) in thedissociation Rohr, gut mischen. Hinweis: Eine höhere Konzentration von Kollagenase oder längere Inkubationszeit wird die Lebensfähigkeit der Zellen zu verändern. </li><li> Bringen Sie die Dissoziation Rohr an der Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator und führen Sie das &quot;Programm m_ Milz _01&quot; die Biopsie ein weiteres Mal zu distanzieren. </li><li> Legen Sie eine 70 &amp; mgr; M Nylon Zelle Sieb auf der Spitze eines 50 ml-Falcon-Röhrchen. Anwenden dissoziierten Probenmaterialien auf diese Zellsieb Zellklumpen / Gewebereste zu entfernen. </li><li> Waschen Zellsieb einmal mit 5 ml vollständigem Kulturmedium. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 10 min und Überstand absaugen. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal. Resuspendieren Zellpellets in 300 &amp; mgr; l komplettem Kulturmedium. Einzelzellsuspensionen sind bereit für die weitere Analyse; weiterhin mit Protokollen für die ex vivo Zellkultur oder Zytometrie Analyse fließen. </li><li> Bei weiteren intracellular Zytokinfärbung stimulieren Zellen mit PMA (12,5 ng / ml), Ionomycin (500 ng / ml) und Brefeldin A (5 ug / ml) für 4 h bei 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 4 Stunden vor dem Strömungsdurchführen Zytometrie Analyse. </li></ol> 2. polyklonalen Aktivierung der Haut-Einwohner - T - Zellen (ex vivo Zellkultur) <ol><li> Aliquot 100 ul Einzelzellsuspensionen (hergestellt in Schritt 1.15) in einen Rundboden-96-Well-Platte. HINWEIS: Für jede der 4 mm Hautbiopsie können die erfassten Einzelzellsuspensionen in mindestens zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte aufgeteilt. </li><li> Hinzufügen anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beschichteten Microbeads (25.000 Kügelchen pro Vertiefung), rekombinantes menschliches Cytokin rIL-2 (Endkonzentration 25 U / ml) und rIL-1β (ng / ml Konzentration 50 final). </li><li> Decken Sie die Kulturplatte mit einem gut markierten Platte Deckel, Inkubation in 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit, 37 ° C Inkubator. Ändern Medium, wenn das Medium Farbe gelb wird. <br/&gt; Hinweis: Eine klare Zellkolonie von Tag 8 der Zellkultur beobachtet werden können. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie Analyse von Primär- / kultivierten Haut-Einwohner-T-Zellen <ol><li> Bereiten Sie FACS-Puffer: PBS + 0,2% BSA. </li><li> Übertragen Zellen von Interesse in einer V-Boden 96-Well-Platte. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 100 ul PBS. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Stain Zellen mit 100 &amp; mgr; l präparierte eFluorescence780 konjugiert fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff (1: 1000 Verdünnung mit PBS) bei 4 ° C für 30 min. Füge 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Wählen Sie das gewünschte Zelloberflächenmarker mAb, zum Beispiel: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TÜK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), und CD1c-APC (AD5-8E7, die mAb-Mischung unter Verwendung von FACS-Puffer 1:10), bereiten nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe. </li><li> In 25 ul vorbereitet mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren 20 min bei 20 ° C ± 2, vor Licht schützen. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Bei Proben, die nur Zeiloberflächenfärbung erfordern, weiter mit Schritt 3.16. </li><li> Bei intrazellulären Foxp3-Färbung: <ol><li> Bereiten Fixierung und Permeabilisierung Puffer von einem Teil Konzentrat mit 3 Teilen Verdünnungsmittel zu mischen. </li><li> Vorbereitung 1x Permeabilisierung Puffer: 1 Teil 10x Permeabilisierung Puffer + 9 Teile sterilisiert H 2 O. </li></ol></li><li> Resuspendieren Pellets in 100 ul Fixierung und Diffusionsratesation Puffer, mischen, und Inkubation bei 4 ° C für 30 min. </li><li> 100 l Permeabilisierung Puffer in jede Vertiefung, Zentrifuge bei 450 × g bei RT für 2 min und absaugen Überstand. </li><li> Wash-Zellen mit Permeabilisierung Puffer noch einmal. </li><li> Wählen erforderlich intrazellulärem mAbs, beispielsweise Foxp3-eFluo450 (pCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) und IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Bereiten Sie die mAbs Mischung Permeabilisierung Puffer mit 2% normalem Rattenserum nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe. </li><li> In 20 ul der vorbereiteten mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min, vor Licht zu schützen. </li><li> Nach 30 min Inkubation in jede Vertiefung 100 ul Permeabilisierung Puffer hinzuzufügen. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Wash-Zellen mit Permeabilisierung buffer ein weiteres Mal. Pellet in 110 &amp; mgr; l FACS-Puffer und Transfer Zellsuspensionen in microFACS Rohr. HINWEIS: Probe ist bereit für die Messung mit 10-Farben-Durchflusszytometrie. </li><li> Bei genaue Zellzahl erforderlich, fügen Sie 10 ul gut gemischten einheitliche Suspension von Fluorospheres in jeder Probe unmittelbar vor der Durchführung von Messungen mittels Durchflusszytometrie. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vast+majority+of+CLA++T+cells+are+resident+in+normal+skin.">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li><li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17.">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li><li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li><li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-infiltrating+CD8++T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions.">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Haut resident T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien isolieren. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Isolierung von relativ hohen Anzahl lebensfähiger Lymphozyten und relevante Oberflächenmarker exprimieren. Die Zell - Untergruppen identifiziert wurden , waren: CD11c + DCs, CD4 + und CD8 + T - Zellen und Foxp3 + CD25 + Zellen. Wichtig ist , dass Ex - vivo - Kultur der isolierten Haut resident T - Zellen war sehr gut machbar und für die nachfolgende funktionelle Analyse erlaubt. Menschliche Haut kann mit den enzymatischen Abbau der extrazellulären Adhäsion Proteine, die durch die Kombination von mechanischer Dissoziation in Einzelzellsuspensionen dissoziiert werden funktionieren, um die strukturelle Integrität von Geweben aufrechterhalten. Obwohl Dispase basierte Schicht Trennung der Epidermis und Dermis eine weit verbreitete Methode ist die Zellinfiltration in diesen jeweiligen Hautschichten zu bestimmen, haben wir festgestellt, dass Dispase-Behandlung führte toa deutliche Verringerung der Zelloberflächenexpression des CD25 und CD27 (nicht gezeigt). Da diese Marker sind wichtige Lymphozytensubpopulationen zu charakterisieren, glauben wir, dass Dispase Behandlung Einflüsse nachfolgenden Immunophänotypisierung. Es ist nicht wahrscheinlich , dass die Entfernung der Dermis für die beobachtete Verringerung der CD25 oder CD27 - exprimierenden Zellen, da in der Haut von gesunden Personen die Mehrheit der T - Zellen in der Dermis lokalisiert ist , während minute T - Zellzahlen vorhanden sind , in der Epidermis verantwortlich 10 -12. Die nachteilige Wirkung von Dispase auf der Proliferationskapazität der isolierten Keratinocyten wurde zuvor 13 berichtet. Daher wird umsichtige Verwendung von Dispase gerechtfertigt, wenn die Zellfunktion das Ziel der Studie ist. In unserem Protokoll haben wir Kollagenase Typ unter Verwendung von I Einzelzellsuspension von Hautbiopsien zu erhalten. Obwohl Kollagenase I hohe tryptischen Aktivität im Vergleich zu Kollagenase IV hat und somit ist härter, haben wir diese besondere Kollagenase gewählt, weil es te gewesensted auf seine Eignung für die Zellkultur. Die Verwendung eines Kollagenase IV, die für die Zellkultur sein könnte ein zukünftiger Schritt weiter zu optimieren unsere aktuellen Protokoll geeignet ist. Aufgrund seiner Natur ist die Haut von Zugkräften und mechanischen Disaggregierung sehr widerstandsfähig. Bisher eine umfassende Analyse von Immunzellen in der menschlichen Haut wurde von technischen Herausforderungen bei der Beschaffung von genügend Zellzahlen behindert, wenn relativ harten Verdauung Protokolle. Als Konsequenz setzen auf immunhistochemischen Analysen meisten Studien bisher veröffentlicht. Die direkte Isolierung von CD4 + T - Zellen aus Hautbiopsien wird in der Regel aufwendig angesehen wird . Eine Alternative wäre die Verwendung von Hautexplantat kriechen aus Kulturen 10. Allerdings nehmen diese 2-3 Wochen Kultur, und die Haut Explantation Kulturmedium enthält eine Reihe ausgewählt von Zytokinen und Chemokinen, die den präferenziellen Crawling aus spezifischen T-Zell-Subpopulationen führen könnte. Darüber hinaus könnte der Kulturperiode affect den Phänotyp der Zellen. Das aktuelle Protokoll nicht die Verwendung von zugesetzten Cytokinen oder Chemokinen, und die Expression von CD4 (und auch andere Zellmarker) machen, ist gut nach der Isolierung erhalten, sowohl phänotypische und funktionelle Untersuchung der T-Zell-Populationen direkt nach der Isolierung ermöglicht. Eine im Handel erhältliche automatisierte Gewebe Dissociator ist für die Dissoziation von Hautfragmente vor ihrer Inkubation mit Kollagenase, die für den Abbau der extrazellulären Matrix verwendet. Für die anschließende Freisetzung der Zellen aus der extrazellulären Matrix wird die automatisierte Dissociator wieder verwendet. Obwohl eine umfangreiche manuelle Schneiden von Haut ähnliche Zellzahlen ergeben kann (Daten nicht gezeigt), sind die Ergebnisse weniger konsistent und sind abhängig von der Erfahrung des Ausführenden. Die Dissoziation von Haut der vordefinierten Prozedur durch das Instrument angeboten verwendet, wird ergeben viel mehr reproduzierbare Ergebnisse. In Übereinstimmung mit früheren Studien, dass die Haut zeigt, enthält verschiedene leukocytes Teilmengen 2,14, CD11c + DCs, CD8 + und CD4 + T - Zellen, und + Foxp3 - Zellen wurden in Einzelzellpopulationen , die durch das Protokoll hier vorgestellten beobachtet. Wichtig ist, ergibt das Protokoll eine relativ hohe Ausbeute an lebensfähigen Lymphozyten. Aufgrund der Effizienz des Protokolls, ist es besonders nützlich, wenn das Studium Patientenmaterial, wobei häufig nur ein einziges 4 mm Hautbiopsie erhalten werden kann. Mit der Methode konnten wir zeigen , dass T isolierte Zellen aus der fallener Haut von Psoriasis - Patienten eine höhere Kapazität zeigte produzieren IL-17A und IFNy im Vergleich zu gesunden Haut 9. Je nach Fragestellung kann es erforderlich sein, um bestimmte Zellen-Untergruppen nach der Herstellung von Einzelzellsuspensionen zu reinigen. In diesem Fall größere Hautstücke können verwendet werden, um die Ausbeute an Zellen ausreichend, um sicherzustellen, für die Teilmenge analysiert. Dabei ist darauf zu achten, dass die Haut in kleinere pi geschnitten werdenECES von etwa 2 mm x 2 mm vor der Isolierung Protokoll zu starten. Abschließend bietet das vorliegende Protokoll eine verbesserte Art und Weise Haut resident Zellen zu isolieren, sinnvolle phänotypische und funktionelle Analyse auf Einzelzellebene zu fördern und so unsere Erkenntnisse in der Hautimmunantworten zu verbessern. Kritische Schritte im aktuellen Protokoll sind die richtige Entfernung von subkutanem Fettgewebe und das Schneiden der Haut in kleinere Stücke, vor allem, wenn mehr als eine Biopsie in einer Dissoziation Rohrbearbeitung. Fettgewebe und / oder große Gewebestücke bewirkt, dass der Dissociator unsachgemäß arbeiten, bitten um wieder läuft. Dies wird ernsthaft die Lebensfähigkeit der Zellen zu schaden. Die Begrenzung der Technik ist, dass die Zellzahlen aus einer einzelnen 4 mm Hautbiopsie abgeleitet sind nicht genug für die nachfolgende Isolierung von Untermengen von Zellen.

Die Haut, als primäre Schnittstelle zwischen dem Körper und der Umgebung, bietet die erste Verteidigungslinie gegen äußere physikalische, chemische und biologische Beleidigungen wie Verwundung, UV-Strahlung und Mikroorganismen. Haut besteht aus zwei Hauptfächer, die Epidermis und die Dermis, und enthält eine Vielzahl von Immunzellen einschließlich Langerhans&#39;schen Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen (DCs) und etwa 20 Milliarden Gedächtnis - T - Zellen, fast doppelt so viele , die in der gesamten Blutvolumen 1 , 2. Eine wachsende Zahl von Daten unterstützt die Vorstellung, dass die Haut wesentliche immunologische Funktionen, sowohl während der Gewebehomöostase und in verschiedenen pathologischen Zuständen. Immunzellen mit Wohnsitz in normaler Haut sind gedacht immunosurveillance 3 zu leiten und haben eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen wie Psoriasis 4 zu spielen gezeigt. In psoriatischer läsionaler Haut, sowohl CD4 + und CD8 + T - Zellen infiltriert waren observed und es wurde gezeigt , dass das Verhältnis der CD4 und CD8 5 auf der Krankheitszustand variiert. Jedoch sind diese Populationen von Zellen schwierig zu studieren, weil bestehende Techniken, um die Isolierung von nur wenigen Zellen ermöglichen. Die derzeit weit verbreiteten Techniken zur T-Zell-Isolierung aus der menschlichen Haut verbinden mechanische Haut Dissoziation mit enzymatische Behandlung. Menschliche Hautbiopsien werden in großem Umfang zerkleinert und inkubiert mit Enzymen wie Trypsin, Kollagenase und / oder EDTA 6-8. Bedenkt man, dass die Haut eine Barrieregewebe ist, die Zugkräfte und mechanische Disaggregation sehr widerstandsfähig ist, die etablierten Methoden der T Zellisolierung sehr wenige Zellen produziert und noch geringere Anzahl von lebensfähigen Zellen, die ex vivo Zellkultur dieser Zellpopulationen schwierig macht , und herausfordernd. Hier berichten wir über eine modifizierte Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus gesunden und beteiligt psoriatischer menschliche Haut durch mechan Kombinationsche Dissoziation der Haut eines automatisierten Gewebe Dissociator anstatt die etablierte Methode ausgiebig zerkleinern, zusammen mit enzymatische Verdauung mit Kollagenase verwenden. Verschiedene lebensfähige Immunzelluntergruppen einschließlich DCs und T-Zellen wurden nach der Herstellung einer Einzelzellsuspension beobachtet. Wichtig wurde die Expression der Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 gut erhalten. So hergestellten Zellen, sind bereit für den Einsatz in Ex - vivo - Zellkulturen oder Durchflusszytometrie - Analyse. Dieses Protokoll wurde für die Analyse der einzelnen Hautbiopsien (4 mm), abgeleitet von fallener Haut von Psoriasis-Patienten erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten , dass residente Haut Patienten T - Zellen mehr inflammatorische Zytokine wie IL-17 produziert und IFNy im Vergleich zu gesunden Probanden 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:299px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch</td>
			<td>Kai Europe</td>
			<td>BP-40F</td>
			<td>4 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpels</td>
			<td>Dalhausen</td>
			<td>1100000510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>Blue-capped, used as the dissociation tube.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:281px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td style="width:299px;">Automated tissue dissociator. Using the &#34;program spleen_01&#34; for dissociation of the skin biopsy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:145px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td>70 &#181;m nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">96-well U-bottom plate</td>
			<td style="width:145px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">650180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22409-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:281px;">Human Pooled Serum (HPS)</td>
			<td style="width:145px;">in house prepared</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2674</td>
			<td>Type 1-A, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">DNase I</td>
			<td style="width:145px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">PBS</td>
			<td style="width:145px;">B Braun</td>
			<td style="width:119px;">3623140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0865-18</td>
			<td style="width:299px;">Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Permeabilization Buffer (10x)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">BV421 Mouse anti-human CD45</td>
			<td style="width:145px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">563879</td>
			<td>Clone: HI30; dilution factor 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">FITC Mouse anti-human CD14</td>
			<td>Dako</td>
			<td style="width:119px;">T0844</td>
			<td>Clone: TUK4; dilution factor 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">PE Mouse anti-human CD56</td>
			<td style="width:145px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">R7127</td>
			<td>Clone: MOC-1; dilution factor 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:281px;">ECD Mouse anti-human CD3</td>
			<td style="width:145px;">Beckman - Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A07748</td>
			<td style="width:299px;">Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">PC5.5 Mouse anti-human CD4</td>
			<td style="width:145px;">Beckman - Coulter</td>
			<td style="width:119px;">B16491</td>
			<td>Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">PeCy7 Mouse anti-human CD11c</td>
			<td style="width:145px;">Beckman - Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A80249</td>
			<td>Clone: BU15; dilution factor 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">APC Mouse anti-human CD1c</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-090-903</td>
			<td>Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8</td>
			<td style="width:145px;">Beckman - Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A66332</td>
			<td>Clone: B9.11; dilution factor 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:281px;">APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19</td>
			<td style="width:145px;">Beckman - Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A94681</td>
			<td>Clone: J3-119; dilution factor 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">PeCy7 Mouse anti-human CD25</td>
			<td style="width:145px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">AD5-8E7</td>
			<td>Clone: BC96; dilution factor 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">&#160;PE Rat anti-human CLA</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-635</td>
			<td>clone: HECA-452; dilution factor 1:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">eFluo450 Rat anti-human Foxp3</td>
			<td>eBIoscience</td>
			<td>48-4776-42</td>
			<td style="width:299px;">Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A</td>
			<td style="width:145px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">53-7179-42</td>
			<td style="width:299px;">Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">PeCy7 Mouse anti-human IFNg</td>
			<td style="width:145px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-7319-41</td>
			<td style="width:299px;">Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Flow-Count Fluorospheres</td>
			<td style="width:145px;">Beckman - Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7547053</td>
			<td>Counting beads, for flow cytometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture

Die menschliche Haut hat eine wichtige Barrierefunktion und enthält verschiedene Immunzellen, die zu Gewebshomöostase und Schutz vor Krankheitserregern beitragen. Da die Haut für den Zugriff relativ einfach ist, bietet es eine ideale Plattform peripheren Immunregulationsmechanismen zu untersuchen. Immun-residenten Zellen in gesunde Haut Verhalten immunosurveillance, sondern spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Hauterkrankungen wie Psoriasis. Trotz Schwellen Einsichten, unser Verständnis der Biologie verschiedenen entzündlichen Hauterkrankungen zugrunde liegen noch begrenzt. Es besteht ein Bedarf für eine gute Qualität (single) Zellpopulationen aus biopsiert Hautproben isoliert. Bisher Isolierungsverfahren wurden durch einen Mangel an Erhalten einer ausreichenden Anzahl von lebensfähigen Zellen ernsthaft behindert. Isolierung und die anschließende Analyse wurden auch durch den Verlust der Immunzelllinie Marker, aufgrund der mechanischen und chemischen Beanspruchung durch die aktuellen Dissoziation Verfahren betroffen zu erhaltenEinzelzellsuspension. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode von T-Zellen zu isolieren, sowohl gesunde und engagierte psoriatischer menschliche Haut durch mechanische Haut Dissoziation Kombination eines automatisierten Gewebe Dissociator und Kollagenase Behandlung. Diese Methodik bewahrt Expression der meisten Immun Linie Marker wie CD4, CD8, Foxp3 und CD11c auf die Herstellung von Einzelzellsuspensionen. Beispiele für erfolgreiche CD4 + T - Zell - Isolierung und anschließende phänotypische und funktionelle Analyse gezeigt.

Das Protokoll hier präsentiert wird Ausbeute zwischen 2200 ± 615 (Mittelwert ± SEM, Haut von gesunden Probanden) bis 178.000 ± 760 (Mittelwert ± SEM, fallener Haut von Psoriasis-Patienten) rentable Lymphozyten aus der menschlichen Haut, wenn eine einzelne 4 mm Hautbiopsie. Verschiedene Arten von CD45 + Zellen wurden in Einzelzellsuspensionen identifiziert , die von der Haut von gesunden Personen einschließlich CD4 + T-Zellen (~ 45%), CD8 + T-Zellen (~ 30%) und CD11c + DCs (~ 5% ), während einige B - Zellen (CD19 +), NK - Zellen (CD56 + CD3 -) oder Monozyten / Makrophagen (CD14 + oder CD1c +) beobachtet (1A). Die Methode erlaubt auch die Analyse von CD4 + CD25 + Foxp3 + Zellen in menschlichen Hautbiopsien. Durch die Verwendung von intrazelluläres Färben nach Fixierung und Permeabilisierung, ist es möglich, die Expression des Transkriptions fac demonstrierentor Foxp3 in CD25 + T - Zellen (1A). Einzelzellsuspensionen aus menschlichen Hautbiopsien abgeleitet zeigten eine hohe Autofluoreszenz-Hintergrund in FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (pacific blue) und FL10 (Chromorange) Kanäle mit einem Zytometer mit (Daten nicht gezeigt) . Für eine korrekte Analyse der Lymphozyten - Population, also wir die Verwendung eines Anti-Human - CD45 mAb mit einem Brilliant Violet 421 Fluorochrom zur Torsteuerung der Lymphozyten - Population und den Ausschluss von der autofluoreszenten Zellpopulation (1B) konjugiert empfehlen. Die Mehrheit der Bewohner Zellen in der menschlichen Haut waren CD3 + T - Zellen (1C). Für die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse wird empfohlen , von den toten / sterbende Zellen (1C) eine fixierbare Lebensfähigkeit Farbstoff zu unterscheiden , rentabel zu verwenden. Typischerweise Ergebnisse dieses Protokolls auf 65,3% ± 7,7 (Mittelwert ± SD) lebenden Zellen. Zur weiteren Analyse der Durchflusszytometrie Daten ist es advised zum Tor auf der lebensfähigen Zellpopulation, da tote oder sterbende Zellen verlieren ihre Integrität der Zellmembran, und nicht-spezifisch konjugierten Antikörper binden kann, wodurch die Hintergrundfärbung zu erhöhen. T-Zellen durch dieses Protokoll isoliert sind gut geeignet für die weitere funktionelle Analyse. Eine einzelne 4 mm Biopsie lesional Haut von Psoriasis - Patienten durch Verwendung wurde gefunden , dass die Biopsie - abgeleiteten T - Zellen nach 4 h Stimulation mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A (Figur 2) erzeugte IL-17A und IFNy gezeigt. Auch für weitere ex vivo Zellkultur und nachfolgende funktionelle Analyse Einzelzellsuspensionen aus der Haut beteiligt psoriatischen Hautveränderungen können Frisch zubereitete verwendet werden. Nach der Expansion nach polyklonale Stimulation mit anti-CD3 / anti-CD28 mAb beschichteten Mikrobeads in Gegenwart der proinflammatorischen Zytokine IL-1β oder IL-23 für 8 Tage, können beispielsweise die Zellen für ihre cytok analysiert werdenine Produktionskapazität (Abbildung 3). Dadurch wurde so eine deutliche Differenz zwischen dem Zytokin produzierenden Potential von Zellen, die aus Haut von gesunden und psoriatischer Individuen beobachtet. T-Zellen von psoriatischer Individuen zeigten eine viel höhere Kapazität der Psoriasis Zytokine IL17A und IFNy zu erzeugen. Dies bedeutet , dass auch nach der Ex - vivo - Kultur ist eine prototypische Psoriasis Zytokin - Phänotyp beibehalten, fehlt bei gesunden Kontrollen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig1.jpg" /> Abb . 1: Verschiedene Arten von Leukozyten identifiziert werden in Einzelzellsuspensionen von der Haut abgeleitet von gesunden Menschen Haut resident Lymphozyten isoliert unter Verwendung des Protokolls im Text beschrieben wurden mit den fluorochromkonjugierten mAb von Interesse und fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff und sofort analysiert gefärbt durch Durchflusszytometrie. (A) Durchfluss cymetrisches Nachweis der Monozyten (CD14), DCs (CD11c), B - Zellen (CD19), NK - Zellen (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + und CD25 + Foxp3 + Subsets innerhalb der Haut resident Lymphozyten. Anti-Human CD45 / BV421 mAb unterscheidet Lymphozyten von autofluoreszenten Zellen. Die Gating - Strategien für CD45 + Zellen ist in (B) gezeigt. (C) Prozentsatz der lebenden CD45 + CD3 + T - Zellen nach der Isolierung. Zahl zeigt den Prozentsatz der positiven Zellen. Ein repräsentatives Experiment aus drei verschiedenen Experimenten / Geber angezeigt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig1highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig2.jpg" /> Abbildung 2: T - Zellen aus fallener Haut von Psoriasis - Patienten abgeleitet produ könnence IL-17A und IFNy. Eine einzelne 4 mm Hautbiopsie wurde bei oral von der fallener Haut von Psoriasis Patienten entnommen oder informierte Zustimmung für wissenschaftliche Zwecke geschrieben. Die T-Zellen der Haut Bewohner wurden unter Verwendung des Protokolls im Text beschrieben isoliert. Produktion von IL-17A und IFNy durch Haut resident T-Zellen. Intrazelluläre Akkumulation von Zytokinen in Reaktion auf 4 h Stimulation mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A wurde durch Flusszytometrie gemessen. Prozentsatz der Cytokin-positiven Zellen gezeigt. Daten von drei verschiedenen Patienten gezeigt werden . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig2highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig3.jpg" /> Abbildung 3: Skin-resident - T - Zellen sind in der Lage IL-17A und IFNy folgenden ex vivo zu produzieren <strong&gt; polyklonalen Stimulation. Haut Bewohner aus einer 4 mm Hautbiopsie von gesunden oder Psoriasis Patienten gewonnenen Zellen wurden unter Verwendung des Protokolls im Text beschrieben , hergestellt. Danach wurden die Zellen mit anti-CD3 / anti-CD28 mAb beschichteten Mikrobeads in Gegenwart von entweder IL-1β (50 ng / ml, A) oder IL-23 (50 ng / ml, B) angeregt für 8 Tage. Als nächstes wurden die Zellen für 4 Stunden mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A und danach analysiert, für die intrazelluläre Zytokinproduktion durch Durchflusszytometrie stimuliert. Ein repräsentatives Beispiel aus drei unabhängigen Experimenten / Geber angezeigt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig3highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

lymphocyte-isolation-from-human-skin-for-phenotypic-analysis-ex-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

14.4K Aufrufe.  Radboud University Medical Centre. We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Serie: Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellhandel von PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...