biópsias de pele de pacientes com psoríase foram gentilmente cedidas pelo Dr. Andreas Koerber (departamento de Dermatologia da Universidade de Essen, Alemanha), após consentimento informado oral ou escrita para uso científico. XH também é suportado pelo NSFC 61263039 e 11101321 NSFC.

NOTA: As biópsias de pele de indivíduos saudáveis ​​foram obtidos a partir de restos de pele abdominal dos indivíduos submetidos a cirurgia plástica eletiva, após consentimento informado oral ou escrita para uso científico. O uso de pele humana foi aprovado e em conformidade com os regulamentos estabelecidos pelos médicos Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos centro médico da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda e Universidade de Essen, Alemanha. 1. Preparação de suspensões de células individuais de Pele Humana (Trabalho estéril em um Fluxo de-gabinete se Cultura de Células posterior é necessária) <ol><li> Prepare meio de cultura celular: RPMI 1640 + penicilina / estreptomicina (concentrações finais de 100 unidades / mL e 100 ug / ml, respectivamente) + piruvato (0.02 mM) e Glutamax (0,02 mM), sem soro adicionado. </li><li> Prepare meio de cultura completo: meio de cultura preparado no passo 1.1 + 10% de soro humano (HPS); Armazenar a 4 ° C. Traga médio a 20 ° C ± 2 antes de nósing. </li><li> Obter a biópsia de pele com um instrumento redondo 4 milímetros biópsia por punção e mantê-lo no meio de cultura RPMI 1640 completo a 20 ° C ± 2 até 4 horas ou a 4 ° C EM. Processar a biópsia, o mais rapidamente possível após a chegada ao laboratório. NOTA: um armazenamento mais prolongado da pele vai influenciar o rendimento das células e viabilidade celular. </li><li> Marcar um tubo de dissociação azul-tampado e adicionar 5 ml de meio de cultura completo para o tubo rotulado. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura completo a cada poço (num total de 3 cavidades) de uma placa de cultura de 6 poços estéril. Use ferramentas estéreis para colocar a biópsia em um único poço, lavar, mova-o para um segundo poço e repetir este passo mais uma vez, conseguindo assim um total de três lavagens. </li><li> Transferir a biópsia da pele bem lavado com uma placa de Petri estéril, adicionar 100 uL de meio de cultura completo no topo da biópsia, e raspar cuidadosamente o tecido gordo subcutâneo utilizando-se um bisturi de aço inoxidável estéril descartável. NOTA: Thé é um passo crítico. </li><li> Corte cada biópsia da pele em 4 pedaços menores em uma placa de Petri estéril. amostras de transferência (até quatro biópsias de 4 mm por tubo) para o tubo de dissociação preparadas contendo 5 ml de meio de cultura completo. </li><li> Feche bem os tubos com a tampa, e anexar cabeça para baixo para a manga da Dissociator tecido automatizado. Certifique-se de que todo o material de amostra está localizado na área do rotor. </li><li> Iniciar o processo de dissociação, executando o &quot;_01 programa m_spleen&quot; (um programa pré-definido fornecida pela memória interna do instrumento ou pelo cartão de programa, acompanhado) dissociar a biópsia na velocidade de rotação apropriada para 56 seg. </li><li> Após o processamento, retire o tubo de dissociação do Dissociator e certifique-se que todo o material dissociado é recolhido na parte inferior do tubo. </li><li> Adicionar 150 ul de colagenase IA (80 mg / ml) para dentro do tubo de dissociação e incubar a amostra num banho de água com agitação a 37° C durante 60 min. Adicionar 100 ul de ADNase I (5 mU / ml) para dentro do tubo thedissociation, misturar bem. NOTA: Maior concentração de colagenase ou tempo de incubação vai alterar a viabilidade celular. </li><li> Fixe o tubo de dissociação para a manga da Dissociator tecido automatizada e execute o programa &quot;m_ baço _01&quot; dissociar a biópsia mais uma vez. </li><li> Coloque um coador de células de nylon de 70 | iM no topo de um tubo Falcon de 50 ml. Aplicar materiais de amostra dissociados para este filtro celular para remover os detritos aglomerados de células / tecido. </li><li> Lavar uma vez com filtro de células 5 ml de meio de cultura completo. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 10 min e o sobrenadante aspirado. </li><li> Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Ressuspender as peletes de células em 300 ul de meio de cultura completo. uma única célula suspensões estão prontos para uma análise mais aprofundada; continuar com protocolos para a cultura de células ex vivo ou citometria de fluxo. </li><li> Em caso de mais icoloração de citocinas ntracellular, estimular as células com PMA (12,5 ng / ml), ionomicina (500 ng / ml) e Brefeldine A (5? g / ml) durante 4 hr a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 horas antes de executar o fluxo análise de citometria. </li></ol> 2. Polyclonal ativação das células T da Pele-residente (Ex Vivo de Cultura Celular) <ol><li> Alíquotas de suspensões de células únicas de 100 ul (preparado no passo 1.15) numa placa de fundo redondo de 96 poços. NOTA: Para cada biópsia de pele de 4 mm, as suspensões unicelulares adquiridos pode ser dividida em, pelo menos, duas cavidades de uma placa de 96 poços. </li><li> Adicionar anti-CD3 / microesferas anti-CD28 mAb-revestidas (25.000 grânulos por poço), citocina recombinante humano de rIL-2 (concentração final de 25 U / ml) e rIL-1p (concentração final de 50 ng / ml). </li><li> Cobrir a placa de cultura com uma tampa de placa bem marcado, incubar em 5% de CO2, 100% de humidade, 37 ° C incubadora. Alterar médio quando a cor média vira para amarelo. <br/&gt; NOTA: Uma colônia de células claras pode ser observado a partir do dia 8 de cultura de células. </li></ol> 3. citometria de fluxo de primário / cultivadas células da pele Residente T <ol><li> Preparar tampão de FACS: PBS + 0,2% de BSA. </li><li> Transferir células de interesse em uma placa de 96 poços de fundo em V. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> As células são coradas com 100 ul de eFluorescence780 preparados conjugados corante de viabilidade fixável (1: 1000 de diluição utilizando PBS) a 4 ° C durante 30 min. Adicionar 100 ul de tampão de FACS, centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Escolha mAbs marcador da superfície celular necessárias, por exemplo: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188, 01:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), e CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), preparar os mAbs-mistura, utilizando tampão FACS de acordo com cada fator de diluição mAb testados. Definir as configurações de porta usando o controle isotipo do anticorpo em conjunto com amostra não-mancha. </li><li> Adicionar 25 uL de mAb preparado-mistura em cada poço. Incubar 20 min a 20 ° C ± 2, proteger da luz. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de FACS, centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Para amostras que exigem apenas coloração da superfície celular, continue com o passo 3.16. </li><li> No caso da coloração de Foxp3 intra-celular: <ol><li> Preparar tampão de fixação e permeabilização através da mistura de uma parte do concentrado com 3 partes de diluentes. </li><li> Prepare tampão de permeabilização 1x: 1 parte de 10x permeabilização tampão + 9 partes de H 2 O. esterilizado </li></ol></li><li> Ressuspender as pelotas em 100 ul de fixação e permeabilitampão zação, misture bem, e incubar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização a cada poço, centrifugar a 450 xg à temperatura ambiente durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Lavar as células com tampão de permeabilização mais uma vez. </li><li> Escolha mAbs intracelulares necessário, por exemplo, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) e de IFN-y-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Prepare a mistura de mAbs utilizando tampão de permeabilização contendo soro normal de rato 2% de acordo com cada fator de diluição mAb testados. Definir as configurações de porta usando o controle isotipo do anticorpo em conjunto com amostra não-mancha. </li><li> Adicionar 20 uL de mAb preparado-mistura em cada poço. Incubar a 4 ° C durante 30 min, proteger da luz. </li><li> Após 30 min de incubação, adicionar 100 ul de tampão de permeabilização em cada poço. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Lave as células com buffe permeabilizaçãoR mais uma vez. Ressuspender sedimento em 110 ul de tampão de FACS, e suspensões de células para dentro do tubo de transferência microFACS. NOTA: A amostra está pronta para a medição usando 10 cores citometria de fluxo. </li><li> No caso do número de células exato necessário, adicione 10 ml de suspensão uniforme bem misturado de fluoroesferas em cada amostra imediatamente antes de realizar medições de citometria de fluxo. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar eficientemente células T residentes pele de biópsias de pele humana. A vantagem deste protocolo é o isolamento de um número relativamente elevado de linfócitos viáveis, e expressando marcadores de superfície relevante. As subpopulações de células identificadas foram: células CD11c + DCs, CD4 + e CD8 + T e Foxp3 + CD25 +. Importante, a cultura ex vivo de células T da pele isolado residentes foi muito bem possível e permitido para análise funcional subsequente. A pele humana pode ser dissociados em suspensões de célula única através da combinação de dissociação mecânica com a degradação enzimática das proteínas de adesão extracelulares, que funcionam de modo a manter a integridade estrutural dos tecidos. Embora dispase separação da camada base da epiderme e derme é um método amplamente utilizado para determinar a infiltração de células nestas respectivas camadas da pele, percebemos que dispase tratamento levou tOA grande redução da expressão à superfície celular do CD25 e CD27 (não mostrado). À medida que estes marcadores são importantes para caracterizar subconjuntos de linfócitos, acreditamos que a dispase a influenciar o tratamento subsequente imunofenotipagem. Não é provável que a supressão da derme é responsável pela redução observada em CD25 ou CD27 as células que expressam, uma vez que na pele de indivíduos saudáveis, a maioria das células T está localizada na derme, enquanto o número de células minutos T estão presentes na epiderme 10 -12. O efeito prejudicial de dispase na capacidade de proliferação dos queratinócitos isolados foi reportado anteriormente 13. Portanto, o uso prudente de dispase se justifica se a função celular é o objetivo do estudo. Em nosso protocolo temos vindo a utilizar colagenase tipo I obter a suspensão de células isoladas de biópsias de pele. Embora colagenase I tem alta atividade tríptica comparação com colagenase IV e, portanto, é mais dura, temos escolhido este colagenase especial porque tem sido tested para a sua adequação para cultura de células. O uso de uma colagenase IV, que é adequado para a cultura celular pode ser um passo futuro para optimizar ainda mais a nossa protocolo corrente. Devido à sua natureza, a pele é altamente resistente a forças de tensão e desagregação mecânica. Até agora, uma análise abrangente de células imunes na pele humana tem sido prejudicada por desafios técnicos na obtenção de números de células suficientes quando se utiliza protocolos de digestão relativamente severas. Como consequência, a maioria dos estudos publicados até à data dependem de análises de imuno-histoquímica. O isolamento directo das células T CD4 + a partir de biópsias de pele é geralmente considerada demasiado. Uma alternativa seria o uso de explante de pele rastejar para fora culturas 10. No entanto, estes levar 2-3 semanas de cultura, e o meio de cultura explante pele contém um conjunto selecionado de citocinas e quimiocinas, que poderá conduzir a crawling preferencial de subconjuntos específicos de células T. Além disso, o período de cultura pode affect o fenótipo das células. O protocolo atual não faz uso de citocinas adicionais ou quimiocinas e expressão de CD4 (e também outros marcadores de células) está bem preservada após o isolamento, permitindo tanto fenotípicas e estudo funcional de populações de células T diretamente após o isolamento. Um tecido Dissociator automatizado disponível comercialmente é utilizado para a dissociação de fragmentos da pele antes da sua incubação com colagenase, necessária para a degradação da matriz extracelular. Para a libertação subsequente das células a partir da matriz extracelular, o Dissociator automatizado é utilizado novamente. Apesar de extensa corte manual da pele pode produzir o número de células semelhantes (dados não mostrados), os resultados são menos consistentes e são mais dependente da experiência do artista. Dissociação da pele usando o procedimento pré-definido oferecida pelo instrumento irá produzir resultados muito mais reprodutíveis. Consistentes com estudos anteriores que mostram que a pele contém vários leukocytes subconjuntos células DCs, CD8 + e T CD4 + 2,14, CD11c +, e células Foxp3 + foram observados nas populações de células únicas preparadas pelo protocolo aqui apresentado. Importantemente, o protocolo origina um rendimento relativamente elevado de linfócitos viáveis. Devido à eficiência do protocolo, que é particularmente útil quando se estuda o material do paciente, onde muitas vezes apenas uma única biópsia de pele de 4 mm, podem ser obtidas. Utilizando o método, fomos capazes de mostrar que as células T isoladas a partir da pele lesionada de pacientes com psoríase mostrou uma maior capacidade para produzir IL-17A e IFN-y, em comparação com a pele saudável 9. Dependendo da questão de pesquisa, pode ser necessário para purificar ainda mais certos subconjuntos de células após a preparação de suspensões de células únicas. Neste caso, grandes pedaços de pele pode ser utilizada para garantir o rendimento das células suficientes para análises subconjunto. Ao fazê-lo, certifique-se de que a pele deve ser cortado em pi menorECES de cerca de 2 mm x 2 milímetros antes de iniciar o protocolo de isolamento. Em conclusão, o presente protocolo oferece um modo melhorado para isolar células residentes da pele, facilitando fenotípica significativa e análise funcional em um nível de célula única, melhorando assim a percepção em respostas imunes da pele. etapas críticas do protocolo atual são a remoção adequada do tecido adiposo subcutâneo e o corte de pele em pedaços menores, especialmente quando o processamento de mais de uma biópsia em um tubo de dissociação. O tecido adiposo e / ou grandes pedaços de tecido fará com que o Dissociator para trabalhar de forma inadequada, pedindo re-runs. Isso vai prejudicar seriamente a viabilidade celular. A limitação da técnica é que o número de células derivadas de uma única biópsia de pele de 4 mm não são suficientes para o subsequente isolamento de subconjuntos de células.

A pele, como a interface primária entre o corpo e o ambiente, proporciona a primeira linha de defesa contra físico externo, insultos químicos e biológicos, tais como ferimentos, radiação ultravioleta e micro-organismos. Pele compreende dois compartimentos principais, a epiderme e a derme, e contém uma variedade de células imunitárias, incluindo células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), e cerca de 20 mil milhões de células T de memória, quase o dobro do número presente em todo o volume de sangue 1 , 2. Um crescente corpo de dados suporta a noção de que a pele tem funções imunológicas essenciais, tanto durante a homeostase do tecido e em várias condições patológicas. Células imunes residentes na pele normal são pensados ​​para conduzir imunovigilância e 3 têm demonstrado desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias tais como psoríase 4. Na pele lesionada psoriática, tanto CD4 + e CD8 + foram infiltradas células T observed e foi demonstrado que a razão entre a CD4 e CD8 varia dependendo do estado da doença 5. No entanto, estas populações de células são difíceis de estudar porque as técnicas existentes permitem o isolamento de apenas algumas células. As técnicas atualmente utilizados para o isolamento de células T a partir de pele humana combinam dissociação da pele mecânica com tratamento enzimático. As biópsias da pele humana são extensamente triturada e incubada com enzimas como a tripsina, colagenase e / ou EDTA 6-8. Considerando-se que a pele é um tecido de barreira, que é altamente resistente a forças de tracção e de desagregação mecânica, os métodos estabelecidos de isolamento de células T produzido muito poucas células, e até mesmo menor número de células viáveis, o que torna a cultura ex vivo de células destas populações de células difíceis e desafiador. Aqui, nós relatamos um método modificado para isolar linfócitos de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação mechanical dissociação da pele usando um Dissociator tecido automatizada em vez do método estabelecido de picagem extensivamente, em conjunto com a digestão enzimática com colagenase. Vários subconjuntos de células imunitárias, incluindo as DCs viáveis ​​e células T foram observadas após a preparação de uma suspensão de célula única. É importante notar a expressão dos marcadores de superfície CD3, CD4 e CD8 foi bem preservada. As células assim preparadas, estão prontos para uso em culturas de células ex vivo ou análise de citometria de fluxo. Este protocolo tem sido empregue com sucesso para a análise de biópsias de pele individuais (4 mm) derivadas a partir da pele lesionada de pacientes com psoríase. Os resultados mostraram que as células T do paciente de pele residente produzido mais citocinas inflamatórias como a IL-17 e IFN-y, em comparação com voluntários saudáveis ​​9.

<table><tbody><tr><td>Disposable Biopsy Punch</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpels</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tube</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Blue-capped, used as the dissociation tube.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Automated tissue dissociator. Using the &quot;program spleen_01&quot; for dissociation of the skin biopsy.</td></tr><tr><td>Cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &amp;micro;m nylon</td></tr><tr><td>96-well U-bottom plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Human Pooled Serum (HPS)</td><td>in house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Type 1-A, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000</td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Diluent</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Mouse anti-human CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>Clone: HI30; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-human CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone: TUK4; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-human CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone: MOC-1; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mouse anti-human CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.</td></tr><tr><td>PC5.5 Mouse anti-human CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone: BU15; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-human CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone: B9.11; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clone: J3-119; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone: BC96; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PE Rat anti-human CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone: HECA-452; dilution factor 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Rat anti-human Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorospheres</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Counting beads, for flow cytometry</td></tr></tbody></table>

lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture

A pele humana tem uma função de barreira importante e contém várias células imunitárias que contribuem para a homeostase dos tecidos e protecção contra agentes patogénicos. Como a pele é relativamente fácil de acesso, ele fornece uma plataforma ideal para estudar mecanismos de regulação do sistema imunológico periféricos. células residentes na conduta imunes pele saudável imunovigilância, mas também desempenhar um papel importante no desenvolvimento de doenças de pele inflamatórias, tais como a psoríase. Apesar percepções emergentes, a nossa compreensão da biologia subjacente várias doenças de pele inflamatória é ainda limitada. Há uma necessidade de populações de células (single) de boa qualidade isoladas de amostras de pele biopsiados. Até agora, os procedimentos de isolamento ter sido seriamente dificultados pela falta de obtenção de um número suficiente de células viáveis. Isolamento e análise posterior também foram afetados pela perda de marcadores de linhagem de células do sistema imunológico, devido ao estresse mecânico e químico causado pelos procedimentos de dissociação atuais para obtersuspensão de células individuais. Aqui, descrevemos um método modificado para isolar as células T a partir de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação de dissociação da pele mecânica usando um Dissociator de tecido automático e tratamento de colagenase. Esta metodologia preserva expressão da maior parte dos marcadores de linhagem imunes, tais como CD4, CD8, CD11c e Foxp3 mediante a preparação de suspensões de células únicas. Os exemplos de sucesso de isolamento de células T CD4 + e fenotípica subsequente e análise funcional são mostrados.

O protocolo apresentado aqui vai render entre 2.200 ± 615 (média ± SEM, pele de voluntários saudáveis) até 178.000 ± 760 (média ± SEM, pele lesionada de pacientes com psoríase) linfócitos viáveis ​​de pele humana quando se utiliza uma única biópsia de pele de 4 mm. Foram identificados diferentes tipos de CD45 + células em suspensões unicelulares derivadas da pele de indivíduos saudáveis, incluindo as células T CD4 + (~ 45%), as células T CD8 + (~ 30%) e CD11c + DC (~ 5% ), enquanto que as células B (alguns CD19 +), células NK (CD56 + CD3 -), ou de monócitos / macrófagos (CD14 + ou CD1c +) foram observados (Figura 1A). A metodologia também permite a análise de CD4 + CD25 + Foxp3 + células em biópsias de pele humana. Utilizando coloração intracelular após fixação e permeabilização, é possível demonstrar a expressão da transcrição FACTor Foxp3 em células CD25 + (Figura 1A). Suspensões de uma única célula obtidos a partir de biópsias de pele humana mostrou um fundo elevado autofluorescência em FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (Pacific azul) e os canais usando um citómetro de FL10 (laranja cromo) (dados não mostrados) . Para a análise adequada da população de linfócitos, nós recomendamos o uso de um mAb CD45 anti-humano conjugado com uma Brilliant Violet 421 fluorocromo para gating da população de linfócitos ea exclusão da população de células autofluorescente (Figura 1B). A maioria das células residentes na pele humana eram células T CD3 + (Figura 1C). Para a análise de viabilidade celular, recomenda-se usar um corante de viabilidade fixável para distinguir viáveis ​​de células mortas / morrer (Figura 1C). Normalmente, este protocolo resulta em 65,3% ± 7,7 (média ± SD) de células viáveis. Para uma análise mais aprofundada da citometria de fluxo de dados, é AdvisEd a porta sobre a população de células viáveis, uma vez que as células mortas ou moribundas perdem a integridade da membrana celular, e pode não se ligar especificamente anticorpo conjugado, aumentando assim a coloração de fundo. As células T isoladas por este protocolo são bem adequados para análise funcional. Ao utilizar um único biópsia 4 milímetros de pele lesionada de pacientes com psoríase, mostrou-se que as células T de biópsias derivado produzida IL-17A e IFNy seguinte 4 h estimulação com PMA / ionomicina na presença de Brefeldina A (Figura 2). Preparados na hora suspensões de pele de uma única célula de lesões de pele psoriática envolvidos podem ser usados ​​também para uma maior cultura de células ex vivo e análise funcional subsequente. Após expansão após estimulação policlonal com microesferas anti-CD3 / anti-CD28 mAb revestidas na presença de citoquinas pró-inflamatórias IL-1 ou IL-23 durante 8 dias, por exemplo, as células podem ser analisadas quanto à sua cytokINE produção de capacidade (Figura 3). Ao fazê-lo, foi observada uma clara diferença entre o potencial de produção de citoquina de células derivadas da pele de indivíduos saudáveis ​​e de psoríase. As células T de indivíduos psoriáticas mostraram uma capacidade muito maior para produzir a psoríase associada IL17A citocinas e IFNy. Isto implica que, mesmo após a cultura ex vivo de um fenótipo de citocinas psoríase prototípico é mantida, no caso de ausência de controlos saudáveis. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig1.jpg" /> Figura 1:. Diferentes tipos de leucócitos são identificados em suspensões unicelulares derivadas da pele de indivíduos saudáveis ​​linfócitos residentes pele isolado utilizando o protocolo descrito no texto foram coradas com os mAbs fluorocromo-conjugados de interesse acrescido de corante de viabilidade fixável e imediatamente analisadas por citometria de fluxo. (A) Fluxo cydetecção tometric dos monócitos (CD14), DCs (CD11c), células B (CD19), as células NK (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + e CD25 + Foxp3 + subconjuntos dentro de linfócitos residentes pele. CD45 anti-humano / BV421 mAb distingue linfócitos de células autofluorescentes. As estratégias utilizadas para gating células CD45 + é mostrado em (B). (C) Percentagem de células T CD3 + CD45 + viável após o isolamento. Número mostra a percentagem de células positivas. A experiência representativa de três experiências diferentes / doadores é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig2.jpg" /> Figura 2: células T derivadas da pele lesional de pacientes com psoríase pode produce IL-17A e IFN-y. A biópsia de pele única de 4 mm foi feita a partir da pele lesional de pacientes psoríase em cima oralmente ou consentimento informado por escrito para uso científico. As células T residentes pele foram isolados utilizando o protocolo descrito no texto. Produção de IL-17A e IFNy por células T residentes pele. acumulação intracelular de citocinas em resposta à estimulação de 4 horas com PMA / ionomicina na presença de Brefeldina A foi medido por citometria de fluxo. Percentagem de células citocinas positivo é mostrado. Dados de três pacientes diferentes são mostrados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig3.jpg" /> Figura 3: células T cutâneas residentes são capazes de produzir IL-17A e IFN-y seguinte ex vivo <stcélulas residentes da pele Rong&gt; policlonal estimulação. derivadas de uma biópsia de pele de 4 mm paciente saudável ou psoríase foram preparados utilizando o protocolo descrito no texto. Em seguida, as células foram estimuladas com anti-CD3 / microesferas anti-CD28 mAb revestidas na presença quer de IL-1β (50 ng / mL, A) ou IL-23 (50 ng / ml, B) durante 8 dias. Em seguida, as células foram estimuladas durante 4 horas com PMA / ionomicina na presença de Brefeldina A e depois analisados ​​para a produção de citoquina intracelular por citometria de fluxo. Um exemplo representativo de três experimentos / doadores independentes é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

14.5K visualizações.  Radboud University Medical Centre. We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Genética

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Medicina

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biologia

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neurociência

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

Isolamento de queratinócitos da pele humana: um método para cultivar queratinócitos primários de amostras de pele

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...

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